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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1997;40(3): 409-416. |
| Immunohistochemical Localization of Choline Acetyltransferase in External Branch of Superior Laryngeal Nerve in Cat. |
| Young Mo Kim, Chang Joon Han, Jung Il Cho, Young Seok Chung, Tae Sook Hwang, Dae Joong Kim |
1Department of Otorhinolaryngology, College of Medicine, Inha University, Incheon, Korea.
2Department of Pathology, College of Medicine, Inha University, Incheon, Korea.
3Department of Anatomy, College of Medicine, Inha University, Incheon, Korea. |
| 고양이의 상후두신경외지에서 Choline Acetyltransferase 양성 신경섬유의 분포 |
| 김영모1 · 한창준1 · 조정일1 · 정영석1 · 황태숙2 · 김대중3 |
| 인하대학교 의과대학 이비인후과학교실1;병리학교실2;해부학교실3; |
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| ABSTRACT |
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Existence of the external branch of the superior laryngeal nerve containing afferent fibers is much of concern. In this study, it is the aim to identify the component of fibers by immunohistochemistry using choline acetyltransferase, the specific marker of the cholinergic motor neuron. Both side of external branch of superior laryngeal nerve were excised from 4 adult cats, and also obtained the great auricular nerve and the hypoglossal nerve for sensory control and motor control specimen, respectively. There were no fibers with immune reaction in the great auricular nerve while all of the fibers in the hypoglossal nerve were strongly stained with rabbit anti-choline acetyltransferase antibody. In the external branch of the superior laryngeal nerve, 12.7% of the fibers were not stained with immune reaction product.
They are smaller than stained nerve fibers in cross sectioned diameter and peripherally located in the same fascicle. The identification of unstained fiber group in the external branch of the superior laryngeal nerve suggest that it is a mixed nerve and not purely motor, possibly containing the sensory nerve fiber. |
| Keywords:
Superior laryngeal nerveㆍSensory nerve fiberㆍCholine acetyltransferaseㆍImmunohistochemistry |
서론
후두에서 감각 및 운동신경조절은 성대의 복잡하고 미세한 운동을 조절하며 후두운동뉴론의 활동에 영향을 주는 반사운동을 관장한다는 면에서 매우 중요한 역할을 하고 있다.38) 특히 감각신경계에 대한 연구는 이들이 기도의 방어와 호흡반사에 직접적으로 관여한다는 점에서 많은 관심을 끌고 있다.
일반적으로 성문상부의 감각은 상후두신경내지에 의해서, 성문과 성문하부 점막의 감각은 반회후두신경을 통해 중추신경계로 전달된다고 알려져 있다. 그러나 운동신경으로 알려진 상후두신경외지의 감각신경분포에 대해선 연구자마다 차이가 있어 논란이 많은 실정이다. 1960년대 초부터 전기생리학적1)27)30), 조직화학적24) 연구들을 통해 이 신경내에 감각신경의 존재에 대한 증거들이 제시되어 온 반면 이를 반박하는 연구들9)40)41)도 있어 확실한 신경조절을 알기위해선 더욱 직접적인 증거가 필요할것이다. 이에 본 연구에서는 운동신경인 콜린성뉴론의 특이적 표식자인 Choline Acetyltrasferase를 이용한 면역조직화학적 방법으로 상후두신경외지를 염색하여 이 신경내에 면역반응물질로 표지되는 신경섬유와 염색되지 않는 신경섬유를 구분함으로써 상후두신경외지내의 신경섬유 분포와 성상을 알아보고자 하였다.
재료 및 방법
1. 재료
약 1.5kg 가량의 건강한 고양이 4마리로부터 희생 직후 각각의 양측 상후두신경외지를 윤상갑상근으로 들어가는 것을 확인 후 2cm이내에서 박리 적출하였다. 순수한 운동신경과 감각신경의 대조군으로써 각각 설하신경(hypoglossal nerve)과 대이개신경(greater auricular nerve)을 취하였다.
2. 방법
1) 면역조직화학적 염색
획득한 각각의 신경을 즉시 4℃ Zamboni용액(containing 0.1M phosphate buffer, paraformaldehyde, 1 M sodium hydroxide solution, 2% picric acid, pH 7.4)에 4일간 고정하고 인산완충용액(phosphate buffered saline, 이하 PBS)으로 15분간 세척한 후 조직의 급속 동결로 인한 손상을 막기 위하여 4℃ 20% Sucrose 용액에 2일간 침투시킨 다음 OCT Compound로 포매(embedding)시켜 관상면의 조직냉동절편(10μm thickness)을 제작하고(Reichert-Jung, 2800 Frigocut N) Silanized Slide(DAKO Japan CO., LTD.)에 부착시켰다. 1개는 통상적인 Hematoxylin & Eosin 염색을 시행하였고 나머지는 상온에서 30분간 건조시킨 후 4℃ 0.9% PBST(phosphate buffer saline triton-X)에 30분동안 처리하였다.
조직이 부착된 슬라이드를 메탄올에 용해된 0.5% H2O2에 상온에서 30분동안 처리하고 항체의 비특이적 결합을 줄이기 위하여 각 절편을 차단항체(blocking antibody)로서 PBS에 용해된 30% Goat normal serum에 1시간30분동안 반응시키고 PBS에 30분간 세척하였다. 일차항체(primary antibody)로서 PBS에 1 : 1000배 희석한 Rabbit Anti-Choline Acetyltrasferase Anti-body(Chemicon Int. Inc. Temecula, California, USA, No AB143)를 각 조직 슬라이드에 24시간동안 4℃에서 반응시킨 후 0.9% PBS로 10분간 3회 세척하였다. Biotin이 결합된 2차 항체인 Goat Anti-Rabbit Ig G와 상온에서 1시간동안 반응시키고 PBS로 세척한 후 다시 상온에서 1시간동안 Avidin-Biotin-Peroxidase Complex와 반응시켰다. 이어서 상온에서 20여분간 DAB(diamino benzidine) 발색반응을 시킨후 Hematoxylin으로 대조염색을 하고 계열 에탄올(70%, 80%, 90%, 95%, 99%)로 탈수하고 Xylen으로 탈지과정 거쳐 Permount로 봉합하여 광학 현미경으로 관찰하였다.
2) 대조군
운동신경대조군으로서 순수한 운동신경으로 알려진 설하신경을, 감각신경대조군으로는 순수한 감각신경으로 알려진 대이개신경을 취하였으며 각각은 상후두신경외지의 염색과 동일한 방법으로 염색하였다. 음성대조군으로는 설하신경에 일차항체 대신 Goat normal serum을 가하고 이후 염색단계는 동일하게 처리한 군을 설정하였다.
3) 광학현미경적 관찰
광학현미경하에서 섬유속(fascicle)을 중심으로 각 축삭(axon)의 면역조직화학적 염색반응성을 관찰하였다. 적절하게 관상면으로 절단되고 조직손상이 적어 각각의 신경섬유를 정확히 셀 수 있는 단면을 골라 각 섬유속내에 관찰되는 전체 유수신경섬유(myelinated axon)의 수와 염색된 유수신경섬유의 수를 세어 이들의 비율을 백분율로 나타내어 특정신경내에서 염색되는 신경의 비율을 나타냈다.
연구결과
면역조직화학적 표식의 특이성 정립을 위한 대조군의 염색에서, 순수한 운동신경으로 알려진 설하신경은 모든 신경섬유의 중앙, 즉 축삭부위에서 암갈색의 면역반응물질이 보였으나(Fig. 1) 순수한 감각신경인 대이개신경의 축삭에선 면역반응물질을 발견하지 못하였다. 각 신경섬유 변연부로 Hematoxylin대조염색으로 군청색으로 보이는 핵들이 간간이 보이지만 신경섬유의 중앙에는 설하신경에서와 같은 면역반응물질은 보이지 않으며 창백한 색조를 띠고 있었다(Fig. 2). 또한 일차항체를 넣지 않고 전과정을 동일하게 시행한 음성대조군의 조직에서도 면역반응물질은 관찰되지 않았다(Fig. 3).
4마리의 고양이로부터 얻은 양측의 8개의 상후두신경외지에서 완전한 관상면 절단이 되지않았거나 조직의 손상으로 신경섬유내 염색을 확인 할 수 없었던 3례를 제외한 5례에서 광학현미경으로 검경한 결과 대부분의 신경섬유들은 중앙의 축삭위치에 암갈색으로 표지되는 면역반응물질이 보였지만 소수의 염색되지 않은 섬유군도 관찰되었다. 이들 염색되지 않은 신경섬유들은 섬유속의 변연부에 위치하고 있었으며 작은 군집을 형성하고 있었고 신경섬유의 직경은 상후두신경 내의 염색된 신경섬유들보다 작았다. 염색된 양상은 대이개신경에서와 마찬가지로 신경섬유의 중앙에 창백한 색조를 보였으나 각 신경섬유의 직경은 대이개신경의 신경섬유들보다 작았다(Fig. 4).
단일 섬유속내에서 관찰되는 모든 신경섬유중 면역반응으로 표식된 신경섬유의 비율은 평균 87.3% 였다. 즉 상후두신경외지내에서 Choline Acetyltransferase에 면역반응을 보이지 않는 신경섬유의 비율은 평균 12.7% 였다.
고찰
후두신경들은 3가지 종류가 있으며 각각은 고유한 기능을 가지고 있다. 운동신경은 후두 외근과 내근의 운동을 유발하며 자율신경은 혈관과 후두 분비선을 조절하고 감각신경은 말초자극을 감지하여 중추신경계로 보내는 역할을 한다.
후두에서 구심성 신경작용(afferent activity)에 대한 연구는 이들이 기도의 방어와 호흡반사에 직접적으로 관여한다는 점에서 관심을 끌고 있으며9) 특히 호흡반사는 경벽압(transmural pressure)과 공기의 흐름과 연관되어 호흡양상과 상기도근육의 작용을 조절하는 것으로 알려져 있다. 즉, 후두내에 존재하는 어떤 수용체들이 찬공기를 감지하여 상기도의 기관지경련 또는 연축(bronchspasm)을 유발하는 것으로 미루어 기도의 평활근 장력 조절에도 후두의 구심성 신경계가 깊이 관련되어 있음을 알 수 있다.
뿐 만아니라 발성에 있어서 청각기(auditory appartus) 외에 후두 감각신경으로부터의 되먹임회로(feedback system)를 통하여 중추신경계에서 음성의 음조(pitch), 음의 강도(intensity), 음질(tonal quality) 등을 조절하게 된다. 그러므로 후두의 감각신경계에 대한 정보는 음성 생성 조절의 생리적 기전을 이해하는데도 도움을 줄 것이다.9)
일반적으로 성문상부는 상후두신경의 내지에 의해, 성문하부는 반회후두신경에 의해 신경지배받는다고 알려져 있지만31)33)39) 내후두근에 대한 운동신경을 내는 상후두신경의 외지는 다른 근육신경들과 마찬가지로 고유수용체 신경지배(proprioceptive innervation)를 함께 하리라고 여겨지며3) 과거의 연구들에서 감각신경계의 신경섬유를 일부 포함하고 있다는 보고들도 있다.1)24)27)30)
상후두신경외지의 신경분포양상은 그간 해부학적, 전기생리학적, 조직화학적방법 등으로 많은 학자들에 의해 연구되어졌지만 연구결과마다 차이가 있어 아직 논란의 여지가 많은 실정이다. 1932년, Lemere24)가 개를 이용한 전기생리학적, 조직학적연구를 통해 상후두신경의 외지가 윤상갑상근(cricothyroid muscle), 갑상피열근(thyroarytenoid muscle)을 뚫고 들어가 성문하부의 점막에 신경지배한다고 보고한 이래 1958년 Andrew2)는 Rat를 이용한 전기생리학적 연구에서 상후두신경외지의 작은 신경섬유에서 성문하부점막으로부터의 활동전위를 기록할 수 있었다고 하였다.
이후 1960년대 여러 연구자들에 의한 동물실험을 통해서 윤상갑상근으로부터 기록되는 전기적 양상을 관찰한 결과 이들 전기적양상이 상후두신경내지의 절단으로는 전혀 영향받지 않으며 상후두신경외지의 절단시 비로서 소실됨을 관찰하고 이를 상후두신경 외지에 감각신경이 존재한다는 간접적인 증거로 제시했다.1)27)30)
1968년 Suzuki 등35)은 고양이를 이용한 보다 발전된 전기생리학적 연구에서 성문하부 전면의 심부구조와 윤상갑상막(cricothyroid membrane) 주변의 점막에 접촉과 압력자극에 따른 구심성흥분파(afferent impulse)를 상후두신경외지의 신경섬유에서 기록하고 여기에 상당수의 구심성신경군이 존재함을 주장하였다. 이부위는 대략 마름모 꼴이며 갑상연골의 하부에서부터 첫번째 기관환(tracheal ring)의 상연까지 연장되어 있다고 하였다. 이에 반해 1986년 Yoshida 등40)은 고양이의 상후두신경내지와 반회후두신경을 절단한 후 결절신경절(nodose ganglion)에 WGA-HRP(wheat germ agglutinin-horseradish peroxidase)를 주입하여 벽내경로(intramural course)와 말초경로를 추적한 결과 Suzuki가 주장했던 부위에서 표식되는 감각신경을 전혀 발견하지 못했고 이처럼 상반된 결과를 적절히 설명하지 못하였다. 이후 Yoshida등41)은 거꾸로 상후두신경외지에 HRP를 주입한 후 이를 추적한 결과 결절신경절 문측(rostral part)의 중간부위에서 산재하고 있는 소수의 세포체들이 염색됨을 관찰하였으며 의문핵(nuleus ambiguus)의 문측에서도 상당수의 표식된 세포체들을 발견하여 상후두신경외지의 감각신경존재를 일부 증명했으나 의문핵보다 상위중추인 미주신경배측핵(nucleus dorsalis nervi vagi)이나 고립로핵(nucleus tractus solitarius)에서는 명확히 표식되는 세포체들을 관찰할 수 없어 명확한 중추투사경로를 밝히지 못했다.
본 연구에서는 이전의 추적법(tracing method)을 이용한 조직화학적 방법이 아닌 면역조직화학적 염색으로 Acetylcholinesterase보다 콜린성 신경을 훨씬 민감하게 특이적으로 염색시킬 수 있는 Choline Acetyltransferase를 이용하여 상후두신경외지에 대해 염색을 시행하였다.
Acetylcholine은 일찌기 중추신경과 말초신경에서의 중요한 신경전달물질로 판명되었으며 이들이 신경활성을 갖고 있다고 여겨져 왔지만5)26)34) 이를 가시화 할 수 있는 적절한 방법이 없어 가수분해효소(hydrolytic enzyme)인 Acetylcholinesterase를 이용한 조직화학적 방법으로 간접적인 콜린성 경로를 표지하였다.20)22)23)25)28)29)32)34) 그러나 Acetylcholinesterase가 콜린성 뉴론에만 국한되어 존재하지 않으며22) 이들의 특이도에 한계가 있음이 밝혀졌다. 즉, 고양이의 척수근에서 운동신경근 대 감각신경근의 Acetylcholine함유량의 비는 100 : 126), Acetylcholinesterase의 비는 3 : 14)에 불과한데 반해 Choline Acetyltransferase 의 비는 무려 400 : 1로서16), Acetylcholinesterase는 감각신경과 운동신경을 구별하는 절대적 판단기준으로 미흡하며37) Acetylcholinesterase보다 더욱 특이성 있는 표식자로서 Choline Acetyltransferase에 대한 연구로 눈을 돌리게 되었다.10)12)
Choline Acetyltransferase는 Acetyl CoA와 Choline으로부터 신경전달물질인 Acetylcholine의 합성을 촉매하는 합성효소로서 신경계에서 이들의 분포는 Bioassay8)와 Enzymatic assay17)등을 통해서 최초로 연구되었고 콜린성 뉴론이 Choline Acetyltransferase를 함유하고 있으며 single N-terminal과 C-terminal amino acid residue를 갖고 있다는 것이 밝혀 지면서 정제된 이들 효소에 대한 항체를 얻을 수 있었다.6) 그리하여 항원-항체 복합체의 검출을 통한 면역조직화학적 염색법을 이용하여 콜린성 신경계의 특이적인 가시화가 가능해졌으며 이를 이용하여 신경계에서 감각신경과 운동신경을 감별할수 있는 도구의 하나로 쓰여지고 있다.7)11)18)19)21)22)
본 연구에서 Choline Acetyltransferase의 위와 같은 특성을 이용하여 상후두신경외지를 염색한 결과 Acetylcholinesterase를 이용한 He 등42)의 연구결과와 마찬가지로 신경의 축삭부위에서 면역물질이 관찰되었으며 신경초에서는 보이지 않았다.
그러나 Acetylcholinesterase를 이용한 다른 연구들13)14)15)38)에서도 보고되었던 유수신경섬유사이에서 보이는 불규칙하고 진한 면역반응물질들의 군락을 본 연구에서는 발견하지 못하였다. Wu38)등은 이같은 군락을 무수교감신경섬유로부터 확산된 면역반응물질이라고 설명하면서 감각신경섬유사이에 교감신경계의 절후신경섬유분포가 더 많으므로 오히려 운동신경보다 감각신경섬유속이 더 진하게 보일수 있다고 하였으나 Choline Acetyltransferase를 이용한 본 연구에서는 그같은 양상은 보이지 않았다. 즉, 축삭에 갈색의 면역반응물질이 보이는 신경섬유군과 보이지 않는 신경섬유군으로 크게 구분되었는데 염색되지 않은 신경섬유들은 전체신경섬유의 12.7%를 차지하는 것으로 나타났다. Choline Acetyltransferase를 이용한 면역염색법의 특이도나 민감도에 대해서는 아직 보고된 바가 없지만 Acetylcholinesterase를 이용한 조직화학적 염색의 신뢰성를 보기위한 한 연구결과12)를 보면 감각신경과 운동신경이 50%씩 섞여 있는 혼합신경에서 모든 염색된 신경섬유의 90%만이 실제로 운동신경이며 염색되지않은 모든 신경 신경섬유 중 83%만이 실제로 감각신경을 의미한다고 하였다.
감각신경세포에 비해 운동신경세포내 Choline Acetyltransferase함유량이 Acetylcholinesterase보다 100배이상 많은 사실로 미루어 보아 이전의 Acetylcholinesterase를 이용한 감각신경과 운동신경의 구별법보다 Choline Acetyltransferase를 이용한 면역조직화학적염색이 훨씬 민감하며 특이도도 높을 것으로 추정된다. 그러므로 본 연구에서 동일 섬유속내에 염색되지않은 신경의 비율이 12.7%인 사실은 가음성율을 감안하더라도 무시할수 없는 부분일 것이다.
이들은 형태학적으로도 면역반응물질로 표식된 신경섬유들보다 단면의 직경이 작아 구분이 되었지만 동일 섬유속내에 여러 크기의 신경섬유들이 섞여 있으므로 신경의 모양과 크기만으로 운동신경과의 구별은 어렵다.10)
향후 본연구에서 관찰되었던 염색되지 않은 신경섬유군에 대해선 기능적인 측면과 형태학적인 연구가 부가되어야 할것이다. 즉 감각신경을 표식할수 있는 신경전달물질의 특이성있는 항체를 이용한 추가적인 면역조직염색법36)등을 통해 이들의 성상을 규명하여 감각신경 또는 자율신경으로 구분해야 하겠고 뇌간과 같은 상위중추에서도 이들의 경로를 확인함이 필요할 것이다.
이상으로 후두의 방어반사와 호흡조절에 있어서 상후두신경외지의 역할은 상후두신경내지에 비해 그리 크지는 않으리라 생각되지만 이들의 역할을 배제할수는 없으며 상후두신경내지의 구심성입력(afferent input)에 의해 나타나는 전체적인 반응에 기여할것으로 추정된다.9)
요약
고양이의 상후두신경외지에서 Choline Acetyltransferase를 이용한 면역조직화학적 염색을 시행한 결과 전체 신경섬유 중 87.3%의 신경섬유에서 면역반응물질을 관찰하였고 12.7%를 차지하는 염색되지 않는 신경섬유를 관찰하였다. 이들 염색되지 않은 신경섬유들은 섬유속내의 변연부에 위치하고 있으며 이들의 직경은 염색된 신경섬유들보다 작았다. 위와 같은 결과는 상후두신경내에 콜린성 신경이 아닌 다른 부류의 신경이 존재함을 시사하는 소견이며 이들은 자율신경 또는 감각신경으로 추정할 수 있겠다.
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