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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1997;40(7): 1014-1019. |
| The Immunoreactivity of Endothelin-1: A Comparison Study between Healthy and Diseased Nasal Mucosa. |
| Dong Joon Park, Seog In Paik, Jeong Pyo Bong, Sang Yoo Park, Dae Sik Kim |
| Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Wonju College of Medicine, Yonsei University, Wonju, Korea. |
| Endothelin-1：비점막내의 면역조직화학적 분포 및 비 질환에 따른 발현의 비교 |
| 박동준 · 백석인 · 봉정표 · 박상유 · 김대식 |
| 연세대학교 원주의과대학 이비인후과학교실 |
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| ABSTRACT |
BACKGROUND:
ndothelin-1(ET1) has been reported about it's versatile pharmagological and physiological influences to airway calibre. Some investigators suggested that ET1 exisit in the nasal mucosa, and may play a part in the exaggerated symptoms of asthma and in controlling the nasal mucosal physiology.
OBJECTIVES:
In order to clarify the alterations of expression of ET1 in the pathologic nasal mucosa, we investigated the distribution of ET1 by immunohistochemistry at the allergic rhinitis mucosa and the polyp tissues.
MATERIALS AND METHODS:
The mucosal specimens were obtained from the inferior turbinate of normal persons(n=5) and from patients with allergic rhinitis(n=10), and the polyps from the lateral nasal wall of non-allergic patients(n=10). The immunoreactivity of the ET1 was evaluated by the immunohistochemical stainig with the anti-ET1 monoclonal antibody.
RESULTS:
The immunoreactivity of ET1 could be observed weakely in the epithelium, in the vascular endotheluim, and in the submucosal gland. But the feature was not constant and showed no statistical significance in each group. On the other hand, strong positive immunoreactivity was noted in the cytoplasm of the granulated large cells and bilobed nuclear leukocytes in the submucosa. These cells were proved to be the mast cells and the eosinophils respectively by means of the toluidine blue and the H & E staining.
CONCLUSION:
These findings would be reasonable to suggested that the ET1 existed in the mast cells and the eosinophils as like cytokines, and the ET1 activity may be affected by the quantity of these cells in allergic rhinitis or nasal polyps. |
| Keywords:
Endothelin-1ㆍMast cellsㆍEosinophilsㆍAllergic rhinitisㆍNasal polyps |
서론
Endothelin-1(ET1)은 21개의 아미노산으로 구성된 펩타이드로 발견 당시 혈관의 내피세포에서 생성되며, 강력한 혈관 수축 작용이 있음이 보고 되었다.19) 이의 아형으로 Endothelin-2, Endothelin-3 등이 있으며, 이중 ET1의 기능에 대한 연구가 가장 많이 되고 있어 내피세포외에 기도, 신장, 척수신경등 인체의 여러곳에서 발견되고 있으며 그 작용도 매우 다양한 것으로 밝혀지고 있다.8)13)15) 기도에서의 작용을 보면, 사람을 비롯한 여러 종에서 강력한 기관지 평활근 수축작용이 있고17), 천식환자 에서는 정상인 보다 많은 ET1이 있음이 보고되어 이 ET1은 기관지 천식과 같은 염증성 질환에 관계가 있음을 알 수 있다.16) 또한 Riccio등12)은 알레르기가 염증성 기관지 질환에서 ET1의 작용을 증강 시킴을 보고하여, 알레르기의 병인에도 관여함을 추측할 수 있다. 비점막에서의 존재 및 기능도 활발히 연구, 보고되고 있는데 히스타민의 분비증가18), 비 선세포 분비증가9), 비혈관 수축3), 섬모운동 증가 등1)이 그 예이다. 따라서 이러한 사실들은 ET1이 비강내의 생리학적 조절기능이 있슴을 알 수 있게 해주며, ET1기능 또는 발현의 이상은 비강의 비정상적인 상태를 야기할 수 있슴을 추측 할 수 있다. 이상의 연구 결과들을 종합해 볼 때 ET1은 알레르기 비염환자의 점막이나, 만성염증 반응의 결과인 비용종의 조직에서 그 발현이나 기능에 변화가 있을 것이란 추측도 가능하게 해준다. 따라서 본연구의 목적은 이러한 ET1의 비질환에 따른 발현의 변화를 면역 조직화학적인 방법으로 알아보고자 하는 데에 있다.
재료 및 방법
1. 점막 채취
정상 대조군으로는 알레르기 증상등이 없고, 피부 반응검사상 음성이며 단지 비중격 만곡증과 비후성 비염에 의한 비폐색으로 비중격 성형술 및 하비갑개 성형술을 시행한 5명의 환자에서 하비갑개 중간 3분의 1에서 점막을 채취 하였다. 알레르기군은 모두 10례로 현재 비폐색, 수양성비루, 재채기가 있으면서 집먼지 진드기나 집먼지등 통년성 항원의 피부반응 검사에 양성이었던 환자중 비폐색을 치료하기 위해 하비갑개 절재술시 하비갑개의 점막을 채취 하였다. 환자는 수술전 2주간은 스테로이드나, 항히스타민제 등의 사용을 금하였다. 또한 비용종군은 알레르기 피부반응엔 음성이며, 만성 부비동염 및 비용종증으로 내시경적 부비동 치료술시 용종을 채취 하였으며 모두 비외측벽에서 기원한 경우만 포함시켜 모두 10례를 대상으로 하였다. 총 25례의 점막은 모두 채취시 10% 중성 포르말린 고정액에서 고정하여 당일로 파라핀 포매 하였다.
2. 면역조직화학 염색 및 결과 관찰
면역조직화학 염색은 ABC법을 약간 변형시켜 민감도를 높인 labled streptoavidin-biotin(LSAB) 법을 사용하여 AEC법으로 발색 하였는데, 간략한 과정은 다음과 같다. 즉 파라핀 포매조직을 세절하여 탈 파라핀화 하고 탈수한후 물로 수세한다. 3% hydrogen peroxide에서 5분간 배양, 세척후 blocking용액으로 5분간 처치한다. 1：250배(200, 250, 300, 350배중에서 최적의 농도를 후향적으로 얻음)로 희석한 단클론 항체(monoclonal mouse anti-human Endothelin-1, Affinity Bioreagent, USA)로 일차항체 반응을 시키는데 반응시간도 10분, 3시간, 18시간중에서 가장 염색이 잘되었던 3시간을 후향적으로 선택하였다. 음성대조를 위해서는 이단계를 생략하였다. link용액, streptiavidin peroxidase 처치후 미리준비한 AEC-chropmogen으로 발색 하였다. 대조염색으론 hematoxylin을 사용하였다.
비점막에서 ET-1이 존재하는 부위로 추측되는4)9) 상피층, 혈관내피층 그리고 점막하 선세포층등 세구역으로 나누어 병리학자 1명과 이비인후과 의사 1명이 면역반응성을 각각 음성(-), 양성(+), 강양성(++)으로 구분하여 판독하고 상이한 판독결과는 추후 협의를 통해 통일하였다. 양성대조군은 시행하지 않았으므로 전체 조직중 가장 강하게 염색된 곳을 강양성으로 간주하였다. 또한 점막하 부위중 독립적으로 염색된 염증세포들이 있었는데 이들은 광학 현미경 400배 시야에서 연결된 10군데를 정해 양성 세포수를 계산하였고 이들은 다시 toluidine blue 또는 H&E로 이중 염색하여 어떤 세포인지 규명하였다. 각 대상군에 따른 세포의 증감은 Kruskal-Walis test로 검증하였다.
결과
ET1 면역반응은 정상 대조군의 경우 2례에서만 상피층에서 양성이었고 혈관이나 선세포 에서는 관찰되지 않았으며, 알레르기군에서는 상피층에서 2례, 혈관내피층에서 1례, 선세포에서 3례 양성이었으나, 상피층을 제외한층은 대부분이 병리학자와 본연구자 간에 음성과 양성으로 각각 판정한 매우 미약한 양성이었다. 비용종군에서도 결과는 비슷하여 상피 3례, 혈관내피세포 4례 그리고 선세포 3례에서 양성이었으며, 대부분 양성과 음성을 구분하기 어려운 약한 양성이었다(Fig. 1). 따라서 각대상군의 상피층, 내피세포층 그리고 선세포층에서 강양성은 1례도 없이 약한 양성의 소견은 보였으나 이것도 일관된 소견을 보이지는 않았고 대상군간의 차이도 나타나지 않았다(Table 1).
상기의 세 영역과는 달리, 점막하 고유층에는 많은수의 ET1 강양성 염증세포가 있었고 이들의 핵은 작고 세포질은 크며 toluidine blue로 이중 염색시 metachromasia를 보여 비만세포임을 알수 있었고(Fig. 2) 이들 양성 세포수는 정상 대조군보다 알레르기군과 비용종군에서 숫자상의 증가는 보였으나 p값이 각각 0.42, 0.14로 통계학적인 의의는 없었다(Table 2). 또 한편 강양성 세포중 일부에서 핵이 두 개의 엽(bilobed)으로 되어있고 H&E 염색에서 세포질이 호산성을 띄는 호산구도 관찰되어 비만세포뿐 아니라 호산구도 ET1이 존재함을 알수있었고 이들의 숫자도 알레르기군에서 더 관찰되었으나 정량 분석을 시행하지는 않았다(Fig. 3).
고찰
인간의 비점막에도 ET1이 존재함은 1992년 Ichimura등7)이 말초혈관의 농도와 같은양이 하비갑개 비점막에도 존재한다고 보고한 이래 Mullol등9)이 비점막에서의 분포, 수용체, 생리적 기능에 대한 가능성을 제시하였다. 즉 ET1은 상피층, 작은 동맥혈관의 벽 그리고 점막하 선세포에 존재하며, 그 수용체는 작은 근육 혈관의 내벽과 선세포에 있어 혈관근육의 조절 및 분비기능이 있을 것 이라고 제안 하였다. 본연구에서도 상피의 경우 모든 대상군 25례중 7례(28%)에서 약하지만 양성반응을 보였고 혈관 내피세포에서 5례(20%), 점막하 선세포 6례(24%)의 결과를 얻을수 있었다. 이렇게 양성율이 낮은이유는 염색 기술상의 문제는 아닐것으로 추측할 수 있다. 왜냐하면 Mullol의 결과에서는 양성율이 어느 정도인지 표기 되어있지는 않았지만 비슷한 연구를 한 Cassasco4)의 경우 상피층과 혈관의 내피 세포에서 ET1 면역 반응성이 관찰되었으나, 조직마다 염색양상이 다르고 혈관 내피세포에서는 매우 약하게 염색된다고 보고 하였으며, 점막하 선세포의 염색에 대한 언급은 없기 때문이다.
알레르기 비염이나 비용종 등의 병적인 상태와 건강한 상태의 비점막에서 ET1 발현의 비교에 대한 연구보고는 그간 없었으나 본연구에서는 주목할만한 결과는 나타나지 않았다. 즉 염색강도를 주관적으로 표시한 결과이므로 산술적 평가를 하기엔 다소 무리가 있지만 각군에서의 양성율은 대조군의 경우 5례의 조직중 상피, 혈관 내피세포, 점막하 선세포등 총15군데에서 2례(13%), 알레르기 비염에선 30군데에서 6례(20%) 그리고 비용종에서 10례(33%)로 알레르기와 비용종군의 양성율이 산술적으로 증가하지만 Table 1에서 괄호안의 결과, 즉 병리학자와 이비인후과 의사의 판독이 각각 달라 협의하여 양성으로 판정한 경우룰 모두 음성으로 하였다면 대상군 13%, 알레르기 7%, 비용종 17%로 질환에 따라 오히려 감소하기 때문이다.
알레르기 비염의 비점막에서 비만세포는 증가하는 것으로 알려져있다.11) 현재까지 알려진 바로는 비점막의 비만세포는 알레르기 환자의 경우 상피층의 비만세포가 많이 증가하여 비즙으로 많이 배출되고 이때 탈과립화되는 매개물질이 주위의 여러 조직에 존재하는 수용체와 결합하여 알레르기 증상을 일으키는데 이들중 히스타민이 큰 역할을 한다. 히스타민에 대한 수용체는 상피, 선세포, 혈관등에 존재하여 분비증가와 점막부종 등의 결과를 초래한다. Yamamura등18)은 ET1이 비만세포를 자극하면 세포표면의 수용체와 결합해 히스타민과 Leukotriene C4를 분비하는데 항원 자극보다 강력하고 빠르다고 하였다. 본 연구에서 비만세포의 세포질에서 매우 강한 면역반응성을 보인 것은 사람 비점막의 비만세포내에 ET1의 존재를 강하게 암시하므로 비만세포내의 ET1이 비만세포 자체의 히스타민 유리를 지극하는 autocrine 기능을 한다는 가정도 할수있고 혹은 주위조직에 직접적인 영향을 미칠 수 있는 paracrine 역할도 추측할수 있다. 실제로 Ehrenreich등6)은 설치류의 골수에서 분리된 비만세포에서 ET1의 존재 및 생성을 보고한바 있다. 물론 본연구에서 주로 관찰된 비만세포는 포르말린으로 고정하고 toluidine blue로 이중염색을 하여 주로 고유층의 것이 관찰 되었으므로10) 알레르기때 더욱 증가하는 상피층의 비만세포와는 조금다른 성질이 있을 것으로 생각되기도 하나 상피층과 고유층의 비만세포의 성질이 조금 다르다는 heterogeniety 그 자체도 아직 확실하지 않으며, 데이터를 제시하지는 않았으나 이번 연구를 시작할 때 상피층의 비만세포를 더욱 잘 볼수있다는 Carnoy 용액5)으로 일부 고정하여 포르말린으로 고정한 결과를 비교 하였으나 크게 상이하지 않았다. 또한 조직에서 toluidine blue 염색시 metachromasia 소견을 보이는 세포가 호염기구 일수도 있으나 대부분의 호염기구는 혈액내에 존재하여 조직내에서는 상대적으로 아주적게 존재 한다는 연구 결과가 있으므로10) ET1과 toluidine blue로 이중염색된 세포는 거의 모두 비만세포로 간주할수 있다고 생각된다. 비용종에서도 비만세포의 수는 증가하는 것으로 되어있고14) 결과에서 보듯이 비만세포의 수는 알레르기와 비용종에서 모두 증가 하였으나 통계학적 의의는 적었는데 그 이유는 조사 대상이 적었기 때문이라고 생각된다. 또한 이중염색을 시행하지는 않았으나 H&E로 확인된 호산구의 특징적인 모양 즉, 핵이 두 개로 엽을 이루고 세포질이 붉게 염색되는 세포에서도 예외 없이 ET1에 대한 강한 면역반응을 보였는데 현재까지 호산구내에 ET1이 존재한다고 보고한 경우는 본 연구가 처음이다. 이를 보충할 수 있는 연구는 있는데, Andersson등2)은 항원으로 자극한 개의 기관지 세척액에서 호산구의 출현이 증가할수록 ET1의 농도가 증가 한다고 하였다. 알레르기 비염이나 비용종시 호산구의 증가 또한 주지의 사실이므로 본 연구에서는 대상군에서 호산구의 증가를 측정하지 않았다. 이러한 결과들을 종합해 볼때 알레르기나 비용종시 ET1이 증가하는데 점막 자체에서 생성이 증가 하지는 않지만 알레르기나 비용종시 공통적으로 증가되는 비만세포와 호산구내에 있는 많은양의 ET1이 모종의 역할을 담당하리라 추측 할 수 있으며 향후 이를 분명히 하기위해 비만세포 및 호산구를 분리하여 ET1의 분비기전, 수용체, 자극후 ET1-mRNA의 증가에 대한 연구가 필요할 것으로 생각된다.
결론
사람 비점막에서 ET1의 분포를 면역조직화학적으로 조사한 결과 상피층, 혈관의 내피세포, 선세포 등에 약하게 존재하였다. 알레르기 비염이나 비용종에서도 이와같은 현상은 비슷하여 정상과 질환들에서 ET1의 발현의 차이가 비점막 자체내 에서는 없었다. 그러나 본연구에서 사람의 비점막에 있는 비만세포와 호산구에 ET1이 존재한다는 강한 가능성을 발견하였고, 이로 미루어 알레르기 비염이나 비용종에서 공통적으로 증가된 비만세포와 호산구의 ET1이 증상의 발현이나 병인과 관계가 있을 수 있다고 추측하였다.
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