| Distribution of Calcitonin Gene-Related Peptide Immunoreactive Nerve Fibers in Rat Cochlea and Brainstem Auditory Nuclei. |
| Hyun Ho Lim, Jung Soo Park, Hak Hyun Jung, Han Kyu Suh, Soon Jae Hwang |
| Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, College of Medicine, Korea University, Seoul, Korea. |
| 흰쥐 와우와 청각뇌간핵에서 Calcitonin Gene-Related Peptide 면역반응 신경섬유의 분포 |
| 임현호 · 박정수 · 정학현 · 서한규 · 황순재 |
| 고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실 |
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| ABSTRACT |
BACKGROUND:
Calcitonin gene-related peptide(CGRP) is one of the neuronal elements of the inner ear. CGRP immunoreactive fibers are known to regulate auditory action potential and blood flow of cochlea.
OBJECTIVES:
This study was designed to localize the CGRP immunoreactive fibers in the cochlear tissue and auditory brainstem of normal rat.
MATERIAL AND METHODS: Male Sprague-Dawley rats were perfused with 4% paraformaldehyde. Cochleae and brainstems were taken out and processed for surface preparations and frozen sections. Immunoperoxidase immunohistochemistry was carried out using anti-CGRP polyclonal antibody.
RESULTS:
Numerous CGRP immunoreactive fibers were located in the inner spiral bundle, intraganglionic nerve fibers, base of inner hair cells and lateral superior olivary nuclei in brainstems.
CONCLUSION:
CGRP is one of the neuropeptides in the olivocochlear effent system and may participate in the inhibitory effect on auditory action potential. |
| Keywords:
Calcitonin gene-related peptideㆍOlivocochlear efferent systemㆍCochlea |
서론
상올리브핵으로부터 와우로의 원심성 신경분포는 Rasmussen1)에 의하여 처음 밝혀졌으며, 유모세포에 대한 뇌간으로부터의 되먹임작용에 의한 원심성 조절은 유모세포들의 기능조절에 중요한 역할을 한다.2) 뇌간의 상올리브핵으로부터 와우로 연결되는 올리브와우 신경계에 분포하는 신경전달물질로는 acetylcholine3), -aminobutyric acid(GABA)4) 외에 신경펩타이드인 dynorphine5), enkephalin6) 및 Calcitonin gene-related peptide(CGRP)7)등이 존재한다.
이 중 CGRP는 신경계에 널리 분포되어 있으나 그 분포되어 있는 정도는 일정하지 않으며 신경섬유의 분포로 보아 외부의 해로운 자극을 받아들이며 자율신경계와 내분비계를 조절하는 역할을 하는 것으로 보고되어 있다.8)
와우에서 CGRP 면역반응 신경섬유는 내유모세포, 신경절내 나선형다발(intraganglionic spiral bundle), 내나선형다발(inner spiral bundle) 및 상올리브핵에서는 관찰되지만 나선신경세포체, 코르티 기관에서는 관찰되지 않는다.7)9) 이러한 분포로 보아 CGRP가 상올리브핵으로부터 와우로 분지하는 원심성신경의 신경전달물질 또는 신경조절물질 기능을 하는 것으로 추측된다. 또한 CGRP의 투입으로 와우혈류량이 증가한다고 보고되어 있어 와우의 혈류량에도 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.10)11)
본 연구의 목적은 흰쥐의 와우와 청각뇌간핵에서 면역조직화학염색법을 이용하여 CGRP 면역반응 신경섬유의 분포를 확인하고 그 기능에 대하여 알아보고자 하였다.
연구대상 및 방법
1. 실험동물 및 검체의 처치
실험동물은 체중 200∼250gm의 정상 Preyer’s reflex를 보이는 수컷 Sprague-Dawley계의 흰쥐를 사용하였다. Nembutal(pentobarbital sodium, 60mg/kg)을 복강내 주사하여 마취한 후 개흉하여 심장을 노출시키고 좌심실을 통하여 18gauge 주사바늘을 상행 대동맥에 삽입하여 유입시키며 우심방을 절제하여 유출하도록 하였다. 먼저 heparin(2IU/mL)을 첨가한 생리식염수로 관류하여 혈액을 씻어내었으며 계속하여 고정액(4% paraformaldehyde in 0.1mol/L sodium phosphate buffer, pH7.4)으로 관류하여 고정하였다. 고정된 쥐의 두개골에서 측두골을 분리하여 동일한 고정액으로 난원창과 정원창을 통하여 고실내 관류고정을 한 후 동일 고정액에서 하룻밤동안 후 고정 하였다. 와우의 surface preparation을 얻기 위해서는 실체 해부현미경하에서 와우를 미세해부하였으며, 동결절편을 얻기 위해서는 와우를 인산완충수용액(phosphate buffered saline：PBS, pH7.4)으로 세척한 후 4% EDTA(4% ethylene-diaminetetraacetic acid in 0.1mol/L sodium phophated buffer)용액에서 약 7일에서 10일간 탈석회화 시킨후 액화 질소로 급속냉각시키고 15μm의 두께로 와우추주위(paramodiolar)의 동결절편을 만들었고, 뇌간조직은 와우핵으로부터 하구까지 15μm의 두께로 동결절편을 만들어 표면이 poly-L-lysine으로 피막된 슬라이드에 절편을 수집하였다.
2. 면역조직화학적 염색
면역조직화학염색법으로는 면역과산화효소법을 이용하여 와우의 surface preparation과 동결절편, 뇌간의 동결절편을 염색하였다. 0.3% H2O2 /PBS에 10분간 처리한 후 5분씩 3회 인산완충식염수로 세척하였다. 조직내의 비특이 반응을 줄이기 위하여 3% normal goat serum에 1시간 동안 실온에서 처리한 후 다시 인산완충식염수로 10분씩 3회 세척하였다. 일차항체(poly-clonal anti-CGRP antibody, Chemicon, USA)를 1：750으로 희석하여 4℃에서 하룻밤동안 반응시켰다. 하룻밤동안 반응을 한 조직은 인산완충식염수로 세척한 후 이차항체(biotin-labeled anti rabbit IgG)로 실온에서 한시간 동안 반응시킨 다음 세척하였다. HRP(horeseradish peoxidase-labeled streptavidin)용액에 실온에서 한시간 동안 반응시킨 다음 세척 후 DAB(0.05% 3, 3-diaminobenzidine tetrahydrochloride /0.006% H2O2/0.05mol/L PBS ph7.4, Sigma, USA)액에 약3∼5분간 담구어 발색반응을 시켰다. 염색이 끝난 조직은 수돗물로 세척후 탈수 및 탈지과정을 거쳐 봉입한 후, 광학현미경(Olympus)으로 관찰하였다.
결과
1. 와우에서 CGRP항체를 이용한 면역조직화학적 염색 소견
동결절편을 이용하여 면역화학적 염색을 시행한 결과 내나선형다발(inner spiral bundle)과 나선형신경세포체 사이로 지나가는 CGRP 면역양성 신경섬유가 관찰되었으며(Fig. 1), 내유모세포의 기저부에서 강하게 염색되는 신경섬유가 관찰되었다(Fig. 2). 그러나 외유모세포에서는 면역양성 신경섬유가 관찰되지 않았으며, 나선신경절 세포체, 혈관조, 개막, Reissner씨 막에서도 관찰되지 않았다.
Surface preparation에서도 내유모세포에서는 CGRP 면역양성반응이 관찰되었으나 외유모세포에서는 거의 관찰되지 않았다(Fig. 3).
2. 뇌간에서 CGRP항체를 이용한 면역조직화학적 염색 소견
CGRP 양성을 나타내는 세포체들이 뇌간의 외상올리브핵에서 관찰이 되었다. 그러나 능형체(nucleus of the trapezoid body)와 내상올리브핵에서는 관찰되지 않았다(Fig. 4).
고안
뇌간으로부터 와우로 정보를 전달하는 원심성신경계는 와우의 정상적인 기능에 중요한 역할을 하는 중추에서의 되먹임작용을 전달한다.12) 그러나 중추에서의 되먹임기능에 대하여는 정확히 밝혀져 있지 않다. 뇌간에서 원심성신경이 존재하는 부분은 상올리브핵이며 여기로부터 올리브와우신경다발을 통하여 와우로 정보전달이 이루어진다. 올리브와우신경계는 내측계와 외측계로 구성되어 있는데 외측계는 외측 상올리브핵에서부터 시작되며 내유모세포와 접촉하고 있는 와우신경의 말초분지로 끝난다. 내측계는 능형체(Trapezoid body)의 내측과 복측의 핵으로부터 기원하며 외유모세포로 종말된다. 올리브와우신경계에는 acetylcholine3), -aminobutyric acid(GABA)4), dynorphine5), enkephalin6) 및 Calcitonin gene-related peptide(CGRP)7) 등 여러종류의 신경전달물질이 존재한다.13)
CGRP는 Rosenfeld등8)에 의하여 밝혀진 펩타이드로 37개의 아미노산으로 구성되어 있고 calcitonin gene으로 부터 mRNA 전사에 의하여 신경계에서 생성된다. 흰쥐에서 CGRP 면역양성 신경섬유는 와우와 전정기관의 유모세포, 혀, 구개, 구인두의 미뢰, 후각상피세포와 후구 등 외부감각에 반응하는 감각계에 풍부하게 존재하고 있다. 이러한 분포로 보아 특수감각과 외부의 유해한 자극에 대한 반응에 관련되며, 원심성조절에 관여하는 것으로 생각되어진다.12)
포유동물의 청각기관에서 CGRP 면역양성 신경섬유의 분포는 1985년 Kitaziri등7)이 면역조직화학적 방법으로 보고한 이래로 여러 저자들에 의하여 보고되었다.9)14) CGRP 면역양성 신경섬유는 와우의 내유모세포의 기저부, 내나선형다발(inner spiral bundle), tunnel spiral bundle 등에서 관찰이 되지만, spiral limbus, Reissner씨 막, spiral ligament, 혈관조, 개막등에서는 관찰되지 않는다고 보고되어 있으며, 외유모세포에서는 일부의 면역양성 신경섬유가 관찰된다고 보고되어 있다. 와우에서 CGRP의 기능은 확실히 밝혀져 있지 않으나 이들이 내유모세포의 기저부에서 발견되는 것으로 보아 수축성 필라멘트(contractile filament)를 통하여 외부자극에 대한 감수성의 조절에 관여 하는 것으로 알려져 있다.12)
본 연구에서도 흰쥐 와우의 내유모세포의 기저부, 나선신경절내의 신경섬유등에서 CGRP 면역양성반응을 보였으나, 외유모세포, 개막, 나선신경절세포체 및 혈관조에서는 관찰되지 않았다. 나선신경절세포체에서 CGRP 면역양성반응이 나타나지 않는 현상은 CGRP가 청각정보의 전달에 직접 관여하지 않는것으로 생각된다.12) 또한 흰쥐 뇌간의 외상올리브핵에서는 CGRP 면역양성 세포체들의 관찰이 가능하였으나 뇌간의 다른 부분에서는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 와우에서 면역양성을 보이는 신경섬유들은 뇌간의 외상올리브핵에서 기인되었다는 것을 의미한다.
이러한 결과로 보아 CGRP가 청각기에서 청각을 전달하는 역할보다는 올리브와우 원심성신경계에 의하여 내유모세포를 통한 외부자극에 대한 감수성의 조절에 관여하는 것으로 생각되어진다.
Takeda등9)은 면역전자현미경으로 CGRP 면역양성 신경섬유를 관찰하여 올리브와우신경다발의 CGRP 면역양성 신경섬유들의 축색종말이 청신경의 말초축색과 접촉하는 것을 보고하였다. 또한 청신경은 내유모세포에서 직접정보를 전달받으며 CGRP 면역양성 신경섬유의 말단이 와우에서 축색-수상돌기(axo-dendritic) 접촉을 통하여 청각정보의 전달을 조절하는 것이라고 하였다. 올리브와우신경다발은 청각 활동전위를 억제하는 것으로 알려져 있는데, CGRP를 외림프에 주입하여 청각 활동 전위가 감소되는 현상은 CGRP가 이러한 기전에 관여하는 것을 의미한다.9)
올리브와우계에 존재하는 여러가지 신경펩타이드들은 같은 신경세포내에 함께 존재하고 있다고 보고되어 있다. Shigemori등15)은 닭의 청각유모세포에서 CGRP와 acetylcholine의 상호작용에 대한 연구에서 acetylcholine은 유모세포의 세포내 칼슘이온의 농도를 증가시키고 CGRP는 이러한 반응을 증강시킨다고 하였고, acetylcholine에 의하여 발생된 평활근의 수축이 CGRP에 의하여 증가되므로 콜린성 구심성신경계에 의하여 조절되어지는 외유모세포의 움직임을 조절하는 기능이 있다고 보고하였다. 따라서 이러한 펩타이드들은 따로 기능을 하기보다는 서로 보완작용하는 것으로 생각된다.
결론
흰쥐 와우와 뇌간에서 CGRP 면역반응 신경섬유는 와우의 내유모세포, 나선신경절 내의 신경섬유와 뇌간의 외상올리브핵에서 관찰되었다. 이러한 분포로 보아 CGRP는 올리브와우 원심성신경계에 존재하는 신경펩타이드이며 와우의 내유모세포가 외부자극에 대한 감수성을 조절하고 청각 활동전위를 억제하는데 관여하는 것으로 생각된다.
REFERENCES
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2)Vetter DE, Adams JC, Mugnaini E：Chemically distinct rat olivocochlear neurons. Synapse. 1991；7：21-43
3) Altschuler RA, Kachar B, Rubio JA, Parakkal MH, Fex J：Immunocytochemical localization of choline acetyltransferase-like immunoreactivity in the guinea pig. Brain Res. 1985；338：1-11
4) Fex J, Altschuler RA, Kachar B, Webthold R, Zempel JM：GABA visualized by immunocytochemistry in the guinea pig cochlea in axons and endings of efferent neurons. Brain Res. 1985；336：106-117
5) Altschuler RA, Hoffman DW, Reeks KA, Fex J：Localization of dynorphine B-like and alpha-neoendorphin-like immunoactivities in the guinea pig. Hear Res. 1985；17：249-258
6) Altschuler RA, Parakkal MH, Rubio JA, et al：Enkephalin-like immunoreactivity in the guinea pig organ of Corti：Ultrastructural and lesion studies. Hear Res. 1984；16：17-31
7) Kitaziri M, Yamashita T, Tohyama Y, et al：Localization of calcitonin gene-related peptide in the organ of Corti of the rat：An immunohistchemical study. Brain Res. 358：394-397
8) Rosenfeld MG, Mermord JJ, Amara SG, et al：Production of a novel neuropeptide encoded by the calcitonin gene via tissue specific RNA processing. Nature. 1984；308：741-748
9) Takeda N, Doi K, Mori N, Yamazaki H, Tohyama M, Matsunaga M：Localization and fine structure of calcitonin gene-related peptide(CGRP)-like immunoreactive nerve fibers in the organ of Corti of guinea pigs by immunohistochemistry. Acta Otolaryngol(Stockh). 1987；103：567-571
10) Hillderdal M, Andersson SE：The effect of calcitonin gene-related peptide(CGRP) on cochlera and mucosal blood flow in the albino rabbit. Hear Res. 1991；52：321-328
11) Quirk WS, Seidman MD, Laurikainen EA, Nuttall AL, Miller JM：Influence of calcitonin gene-related peptide on cochlear blood flow and electrophysiology. Am J Otol. 1994；15：56-60
12) Silverman JD, Kruger L：Calcitonin-gene-related-peptide-immunireactive innervation of the rat head with emphasis on specialized sensory structures. J Comp Neurol. 1989；280：303-330
13) Warr WB, Guinan JJ：Efferent innervation of the organ of Corti：Two separate system. Brain Res. 1979；173：152-155
14) Ohno K, Takeda N, Tanaka-Tsuji M, Matsunaga T：Calcitonin gene-related peptide in the efferent system of the inner ear. Acta Otolaryngol(Stockh) Suppl. 1993；501：16-20
15) Shigemori T, Ohmori H：Muscarinic antagonist and ATP increase the intracellular Ca++ concentration in chick cochlear hair cells. J Physiol. 1990；420：127-140
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