Cytogenetic Studies of High Dose EGF Treated KUMA3 Cell Clone.

Chae, Han Soo; Song, Dal Won; Jeong, Hyun Soo; Kim, Hee Jun; Hong, Chang Eui; Ahn, Byung Hoon; Choi, In Jang

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery > Volume 41(2); 1998 > Article

Original Article

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1998;41(2): 232-237.

Cytogenetic Studies of High Dose EGF Treated KUMA3 Cell Clone.

Han Soo Chae, Dal Won Song, Hyun Soo Jeong, Hee Jun Kim, Chang Eui Hong, Byung Hoon Ahn, In Jang Choi

¹Department of Otolaryngology, College of Medicine, Keimyung University, Taegu, Korea.
²Department of Anatomy, College of Medicine, Keimyung University, Taegu, Korea.

고농도 EGF로 처리된 KUMA3 세포주의 세포유전학적 연구

채한수¹ · 송달원¹ · 정현수¹ · 김희준¹ · 홍창의¹ · 안병훈¹ · 최인장²

계명대학교 의과대학 이비인후과학교실1;해부학교실2;

주제어: 상피성장인자ㆍKUMA3 세포주ㆍ편평상피세포암ㆍ염색체이상.

ABSTRACT

BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Epidermal growth factor (EGF), directly stimulates epidermal growth and differentiation. The combination of EGFR activation and genetic alternations may lead to neoplasia and metaplasia. To study the change of chromosomal number and the aberrations of chromosomal structure of KUMA3 cell line treated with high dose EGF.
MATERIALS AND METHODS:
The high dose EGF treated cell clones were obtained from KUMA3 cell line which was established from squamous cell carcinoma of the lower lip by culturing cells in medium containing high dose EGF for 6 months. The chromosomal analysis and subculture were performed at subsequent passage of 1 month interval.
RESULTS:
In high dose EGF treated cell clones, there was no apparent change in chromosomal number, but the ratio of the number of chromosome 7 to mode chromosome number was similar to normal value (0.043). The new chromosomal structural aberrations appeared first from 30 passage of IR-200 cell clone. The chromosomal aberrations were del(1)(q23-->qter) and del(4)t(1:4)(1qter-->1q23: : 4p16-->4qter).
CONCLUSION:
There was no change in chromosomal number, but the ratio of the number of chromosome 7 to mode chromosome number was similar to normal value (0.043), and the new chromosomal structural aberrations were appeared.

Keywords: EGFㆍKUMA3 cell cloneㆍSquamous cell carcinomaㆍChromosomal aberrations

서론 EGF(epidermal growth factor)는 53개의 아미노산으로 구성된 polypeptide로 상피세포의 증식과 분화를 유도한다고 Carpenter와 Cohen1)은 보고하였다. 그러나 A431 사람 유표피암세포2)와 몇 종의 사람 편평상피암세포들3)에서는 EGF가 세포성장을 억제한다는 반증도 있었다. A431 세포에서는 EGF 수용체가 정상보다 과발현되어 있고 배양상태의 세포수에 따라 EGF에 의한 성장억제 정도의 차이가 있으나 EGF 수용체를 포화시키는 고농도의 EGF에 대해서는 세포수와 무관하게 성장이 억제된다고 Gill과 Lazor2)가 보고하였다. Bass 등4) A431 세포배양액에 고농도인 0.1 μEGF첨가로 3주간 처리하여 EGF에 대한 성장억제기능이 소실된 EGF 처리 변이주들을 선별하여 연구한 결과 EGF 수용체에 존재하는 tyrosine 특이 단백 kinase 활성이 A431 세포들의 성장억제를 중재하는 것으로 결론지었다. Gill 등5)은 EGF 처리 변이주들에서는 A431 모세포주에 비해 정상 7번 염색체수의 변화는 미약하였으나 EGF 수용체 유전자가 좌위한 7번 염색체 단완이 전좌된 특이한 표지 염색 체들의 수가 현저히 감소되어 있는 것을 핵형분석으로 밝혔다. EGF는 세포막에 존재하는 특이한 수용체와 결합하게 되어 수용체 자신의 인산화나 세포내 기질의 tyrosine 인산화를 중재하여 정보전달계를 활성화시켜 그 기능이 나타나게 되는데 EGF 수용체를 갖는 정상 섬유모세포에 성숙한 EGF6)나 미성숙 EGF 전구물질7)을 발현하게 하는 운반체를 세포내에 도입하게 되면 섬유모세포가 전형되게 된다고 각각 발표하였다. Khazaie 등8)은 autocrine이나 paracrine 방식으로 계속적인 EGF 수용체의 활성과 적절한 유전자 변화축적이 정상세포를 새로운 종양세포로 변화시키고 상피성 종양에서 종양진행의 역할을 하는 것으로 주장하였다. EGF 수용체 증폭을 가진 아래입술 편평상피암에서 유래된 KUMA3 세포주는 안정화된 염색체수와 일정한 구조적 염색체이상들을 가지고 있으며 특히 EGF 수용체 유전자 좌위가 위치한 7번 염색체 단완의 전좌형태가 없는 특징을 가지고 있다. 이에 저자는 일종의 paracrine 방식인 배양액에 고농도(200 ng/ml와 600 ng/ml)의 EGF를 첨가하여 EGF 처리 변이주를 확립하고 6개월 이상 고농도 EGF를 계속 처리하여 주기적인 계대배양과 핵형분석으로 모세포주인 KUMA3와 다른 고농도 EGF 처리 변이주에서 EGF 수용체 유전자가 존재하는 7번 염색체수의 변화와 그외 다른 염색체의 특이한 구조적 이상이 부가적으로 출현하였기에 그 의의를 발표하고자 한다. 재료 및 방법 연구재료 아래입술 편평상피암에서 유래된 24세대에서 36세대까지의 KUMA3 세포주 연구방법 KUMA3 세포주 배양과 고농도 EGF 처리 변이주 확립 KUMA3 세포주는 10% 우태아혈청(Gibco제, USA)이 함유된 F10(Gibco제, USA)의 완전배양액으로 36세대까지 배양하였다. 고농도 EGF 처리 변이주를 확립하기 위해서는 24세대째의 KUMA3 세포주를 완전배양액 ml당 200 ng의 EGF(Sigma제, USA)를 첨가한 배양조건(1R-200)으로 3∼5일마다 EGF가 함유된 신선한 완전배양액으로 갈아주면서 1개월에 한번씩 계대배양하였다. 고농도 EGF 처리 변이주의 특이한 구조적 염색체이상출현 이후의 배양 고농도 EGF 처리 변이주(1R-200)의 핵형분석결과 특이한 구조적 염색체이상이 출현한 30세대째 이후 완전배양액 ml당 200 ng의 EGF가 첨가된 배양조건(2R-200), ml당 600 ng의 EGF가 첨가된 배양조건(2R-600) 및 완전배양액에 EGF를 첨가하지 않은 배양조건(2R-0)으로 고농도 EGF 처리 변이주(1R-200)를 배양하였다. 완전배양액 ml당 200 ng EGF를 첨가한 배양조건(1R-200)에서 나타난 특이한 구조적 염색체이상이 고농도 EGF 에 의한 특이한 염색체 형태인지를 확인하기 위해 KUMA3 세포주 31세대째에 완전배양액 ml당 600 ng의 EGF를 첨가하여 6개월후인 36세대째에 특이한 구조적 염색체가 동일하게 나타나는지를 확인하였다. 세포유전학적 분석 KUMA3 모세포주와 고농도 EGF 처리 변이주들의 계대배양을 실시하여 도립현미경으로 확인하고 중기염색체를 얻기에 최적상태에서 colcemide(Gibco제, USA)로 처리하여 일반적인 방법으로 염색체 슬라이드를 제작한 후 37℃ 배양기에 하루밤 건조시켜 60℃ 배양기에 옮겨 6시간 처리하고 0.025% 트립신용액(Difco제, USA)에 5∼10초간 둔 후 10% H 2O 2 용액(Sigma제, USA)에 옮겨 트립신반응을 중지시키고 여과한 4% Giemsa용액(Merck제, USA)에 5∼10분간 염색하여 G-banding을 실시하였다. 세포주당 50세포들을 무작위로 선택하여 염색체를 확인하였고 각 세포주에서 20개의 염색체를 사진촬영하여 ISCN9)에 준하여 완전하게 핵형분석을 실시하였다. 결과 모세포주 KUMA3와 고농도 EGF 처리 변이주들에서의 7 번 염색체수 변화 외래성 EGF와 복합체를 이루어 정보전달계를 활성화시키는 EGF 수용체 단백을 발현하는 EGF 수용체 유전자가 좌위하는 7번 염색체수는 모세포주 KUMA3에서는 평균 3개이상(Fig. 1과 Table1) 존재하여 전체 염색체수에 대한 7번 염색체수가 차지하는 정상 기준값인 0.043보다 높은 수치를 나타내고 있었다(Table 1). 고농도 EGF 처리군인 1R-200세포주의 26세대째에서 7번 염색체수는 가장 낮은 평균값인 2.36이며 전체 염색체수에 대한 7번 염색체수가 차지하는 비율값은 0.036으로 정상 기준 비율값보다 훨씬 낮았으나 29세대째에서는 전체 염색체수에 대한 7번 염색체수의 비율값은 정상 기준 비율값과 유사한 0.042를 나타내었다(Table 1). 고농도 EGF 처리 변이주의 특징적인 염색체 구조변화인 1번 염색체 장완의 일부 결실 형태와 1번 염색체 장완에서 결실된 염색체 단편이 4번 염색체 단완 끝부분으로 전좌된 형태들(Fig. 2)이 나타났다. 고농도 EGF 처리군(1R-200)의 30세대째 이후 배양 조건을 다르게 한 2R-200, 2R-600 과 2R-0세포주들에서는 세대수와 배양조건에 관계없이 전체 염색체수에 대한 7번 염색체수가 차지하는 비율값은 정상 기준 비율값과 유사하였다(Table 1). 모세포주 KUMA3의 30세대째에 완전배양액 ml당 600 ng의 EGF를 처리하여 EGF 처리 변이주의 특징적인 염색체 구조변화가 나타난 36세대째의 1R-600세포주(Fig. 4)에서는 전체 염색체수에 대한 7번 염색체수가 차지하는 비율값은 정상 기준 비율값과 같았다(Table 1). 확립된 고농도 EGF 처리 변이주의 특이한염색체 구조이상 24세대째 모세포주 KUMA3에 고농도 EGF를 계속 처리하여 6개월간 계대배양과 핵형분석으로 30세대째 1R-200세포주에서 KUMA3에서는 전혀 관찰되지 않았던 새로운 염색체 구조이상들인 del(1)(q23→qter)과 der(4)t(1：4)(1qter→1q23：：4p16→4qter)(Fig. 2)가 처음으로 출현하였다. 2R-200(Fig. 3)과 2R-600세포주들에서는 del(1)(q23 → qter)이나 der(4)t(1：4)(1qter → 1q23：：4p16→4qter) 또는 두가지 염색체 구조이상들을 모두 함유한 세포들이 세대와 무관하게 거의 100%로 나타났다(Table 2). 2R-0세포주는 32세대째에서 두가지 특이한 염색체 구조이상들을 모두 가진 세포들이 10%에서 관찰되었으나 36세대째에서는 del(1)(q23→qter)만 보유한 세포들과 두가지 특이한 염색체 구조이상들을 가진 세포들이 30%로 세대가 경과함에 따라 증가하였다(Table 2). 36세대째의 1R-600세포주에서는 30세대째 1R-200세포주에서 관찰되었던 똑같은 형태의 del(1)(q23 → qter)(Fig. 4)만 보유한 세포들이 50%에서 관찰되었다(Table 2). 고찰 EGF는 세포표면에 존재하는 특이한 EGF 수용체 단백과 복합체를 형성하여 상피세포를 증식 또는 분화시키는 역할을 하지만 EGF 수용체 단백의 과발현이 있는 A431 사람 유표피암세포주 2)와 MDA-468 사람 유방암세포주10) 및 JSQ-3 사람 편평상피암세포주11) 등에서는 EGF에 의해 증식이 억제된다고 보고하였다. 세포표면에 존재하는 EGF 수용체 단백을 포화시키는 고농도 EGF 처리로 EGF에 의한 성장억제기능이 소실된 EGF 처리 변이주들을 얻을 수 있고 또한 이러한 EGF 처리 변이주들은 EGF에 대한 성장 모세포주와 비교해 보면 EGF 수용체 단백에 존재하는 tyrosine 특이 단백 kinase 활성정도가 훨씬 낮게 나타남으로 tyrosine 특이 단백 kinase 활성이 EGF에 의한 증식억제에 밀접한 관계가 있다고 보고하였다.4) Gill 등5)은 EGF 처리 변이주들은 모세포주인 A431 세포와 달리 EGF 수용체 유전자가 좌위한 7번 염색체 단완이 전좌된 형태의 표지염색체인 M4와 M14의 숫자가 정상 7번 염색체보다 현저하게 감소되는 것을 밝혔다. Filmus 등12)은 EGF에 대한 변이주들은 모세포주인 MDA-468 세포와 다르게 EGF 수용체 유전자가 좌위한 7번 염색체 단완부분에 비정상 염색부위(abnormally banded region)가 존재하는 염색체가 소실된 것을 밝혔고, 비정상 염색부위는 증폭된 EGF 수용체 유전자임을 밝혔다. 본 연구에 사용된 KUMA3 세포주는 EGF 수용체 유전자의 증폭이 있는 아래입술 편평상피세포암에서 유래되었고, 핵형분석상 EGF 수용체 유전자가 좌위한 7번 염색체 단완이 전좌되거나 비정상 염색부위가 없이 오직 수적으로 7번 염색체수가 정상보다 많은 특징을 가지고 있었다. EGF 처리 변이주를 확립하는 과정에서 전체 염색체수에 대한 7번 염색체가 차지하는 비율이 고농도 EGF 처리초기인 26세대째의 IR-200세포주에서 0.036으로 현격하게 낮아져 EGF 수용체 단백에 존재하는 tyrosine 특이 단백 kinase활성정도가 낮음을 7번 염색체수로 알 수 있었고 세대가 거듭될수록 전체 염색체수에 대한 7번 염색체가 차지하는 비율이 정상값인 0.043에 근접하여 Filmus 등10)이 주장한 EGF에 대한 변이주에서 EGF 수용체 단백수치가 정상으로 나타나는 것과 같은 결과를 얻었다. EGF가 특이한 수용체와 결합하여 수용체 자체의 인산화나 세포내 기질의 tyrosine 인산화를 중재하여 정보전달계를 활성화시키는 기능을 이용하여 정상 섬유모세포에 성숙한 EGF나 미성숙 EGF을 분비하게 하는 운반체를 세포내에 도입시키게 되면 섬유모세포가 전형되게 된다고 보고하였고,6)7) Khazaie 등8)은 autocrine이나 paracrine 방식으로 연속적으로 EGF가 EGF 수용체 단백을 활성화시키면 정상세포를 새로운 종양세포로 그리고 상피성 종양의 진행에 기여하는 것으로 주장하였다. 본 연구에서는 KUMA3 모세포주에 EGF를 고농도로 계속 처리하면 6개월째에 KUMA3에서 전혀 관찰되지 않는 부가적인 염색체 구조이상인 del(1)(q23 → qter)과 der(4)t(1；4)(1qter → 1q23：：4p16 → 4qter)이 고농도 EGF 처리군의 30세대째인 1R-200세포주에서 출현하였고, 배양조건을 달리한 2R-600세포주에서 세대와 무관하게 부가적 염색체 구조이상들을 함유한 세포들이 거의 100%로 나타났으나 배양액에 EGF를 첨가하지 않은 2R-0세포주에서는 세대를 거듭할수록 부가적 염색체 구조이상들을 가진 세포들이 증가하였다. 1R-600세포주에서도 6개월째에 부가적인 염색체 구조이상인 del(1)(q23→qter)이 50%의 세포들에서 나타났다. 이러한 결과들로 미루어 볼 때 고농도 EGF를 6개월간 계속 처리하게되면 부가적인 염색체 구조이상인 del(1)(q23→qter)이 공통적으로 나타났음으로 del(1)(q23→qter)이 고농도 EGF의 장기간 처리에 의한 특이한 염색체 구조이상임을 알 수 있었다. 1번 염색체의 장완 22에서 24부위는 염색체절단 호발부위며 이 부위의 절단된 염색체 단편이 다른 염색체로 전좌된 형태들이 고형암을 포함한 여러가지 암에서 관찰되나 암세포의 유일한 염색체 구조이상이 아니라 부가적인 염색체 구조이상이라고 주장하였다.13) Chaganti 등14)은 1번 염색체 장완 22에서 24부위에 ski 암유전자가 위치하여 이 부위에 절단이 생기면 ski 암유전자의 조절기능이 상실되어 비특이적으로 종양의 진행이 일어난다고 하였다. Santini 등15)은 두경부에서 발생한 암들 중 EGF 수용체 단백 발현이 낮은 종양에 비해 높은 종양에서 약물치료요법 효과가 더 높기 때문에 두경부에서 생긴 암에서 EGF 수용체 단백 발현이 흥미로운 종양의 생물학적 지표라고 강조하였다. 본 실험에서 고농도 EGF 처리 변이주들은 EGF 수용체 유전자가 좌위한 7번 염색체수가 전체 염색체수에 대한 비율값에서 정상값인 0.043과 유사하지만 공통의 부가적인 염색체 구조이상인 del(1)(q23→qter)을 함유하고 있기 때문에 KUMA3 모세포주보다 세포증식능과 악성능이 더 높을 것으로 사료되었다. 요약 아래입술 편평상피세포암으로부터 유래한 KUMA3 세포주에서 고농도 EGF로 처리한 변이주를 확립하였고, 또한 고농도 EGF의 6개월이상 계속적인 처리로 주기적인 계대배양과 핵형분석을 실시하였다. 염색체의 수적변화는 KUMA3와 고농도 EGF 처리 변이주간에 뚜렷한 차이는 없었으나, 전체 염색체수에 대한 7번 염색체수가 차지하는 비율은 고농도 EGF 처리변이주에서 KUMA3 보다 낮은 정상 기준값과 유사하였다. 30세대째의 1R-200세포주에서 새로운 염색체 구조이상들인 del(1)(q23→qter)과 der(4)t(1：4)(1qter→1q23：：4p16→4qter)이 처음으로 나타났고, 이러한 염색체 구조이상들은 2R계 세포군들의 모든 세대에서 발견되었다. 모세포주에 30세대째부터 새로이 EGF를 투여한 1R-600세포주에서도 del(1)(q23→qter)의 염색체이상이 나타났다.
REFERENCES
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