Changes of the Ca2+ Current of the Cochlear Outer Hair Cells by Cisplatin in Guinea Pigs.

Chung, Jong Woo; Kim, Chong Sun

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery > Volume 41(5); 1998 > Article

Case Report

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1998;41(5): 553-558.

Changes of the Ca2+ Current of the Cochlear Outer Hair Cells by Cisplatin in Guinea Pigs.

¹Department of Otolaryngology, Asan Medical Center, College of Medicine, University of Ulsan, Seoul, Korea. chongkim@plaza.snu.ac.kr
²Department of Otolaryngology, College of Medicine, Seoul National University, Seoul, Korea.

Cisplatin에 의한 기니픽와우 외유모세포의 Ca<sup>2+</sup> 전류의 변화

정종우¹ · 김종선²

울산대학교 의과대학 서울중앙병원 이비인후과학교실1;서울대학교 의과대학 이비인후과학교실2;

주제어: Ca<ㆍsup>ㆍ2+<ㆍ/sup>ㆍ 전류ㆍCisplatin 이독성ㆍ막전압고정법ㆍ신호전달기전.

ABSTRACT

BACKGROUND AND OBJECTIVES:
The mechanism of cisplatin ototoxicity has been well studied and several evidences indicating outer hair cell damage have been found. Calcium plays an important role in cellular signal transduction and many studies argued that calcium channel was blocked or modified by ototoxic drug. Authors aimed to determine the changes of calcium channel regulation by cisplatin in isolated outer hair cells, and to speculate the mechanism of hearing loss by cisplatin.
MATERIALS AND METHODS:
Outer hair cells were isolated from guinea pigs by enzymatic and mechanical dissociation. Calcium current was recorded by whole cell patch clamp method and any changes in the calcium current were observed after cisplatin (0.3 mM) perfusion in bath solution.
RESULTS:
In outer hair cells, calcium current (I(Ca)) and barium current (I(Ba)) were L-type current and IBa was blocked completely by bath application of cisplatin over the whole range of test potentials.
CONCLUSION:
From the above results, we suggested that cisplatin ototoxicity may be due to the inhibition of calcium current and it can be speculated that disturbance of Ca2+ regulation mechanism may play a role in the provocation of hearing loss in cisplatin ototoxicity.

Keywords: Calcium currentㆍCisplatin ototoxicityㆍWhole cell patch clampㆍSignal transduction mechanism

서론 Cisplatin에 의한 내이의 형태학적인 변화는 대개 외유모세포의 변성이며,1) 그밖에 코티기관의 지지세포 또는 Reissner막의 이상소견등을 관찰할 수 있다고 하였다.2) Strauss등3)은 cisplatin을 투여받은 환자의 측두골 병리조직소견을 분석하여 주로 기저회전의 외유모세포가 손상받으며, 그 밖의 지지세포들은 대개 정상으로 유지되고 있음을 보고하였다. Byun4)은 외유모세포의 제 1 열에서 가장 심한 변성이 있었으며, 이는 아마도 외유모세포의 대사율과 관계가 있으리라 추정하였다. 이러한 연구들은 외유모세포가 cisplatin이독성의 일차적인 침범부위라는 가설에 합당한 관찰이라고 볼 수 있다. 그러나 아직 cisplatin 투여에 의한 이독성의 발생부위에 대해서는 논란이 있어서 일부의 연구자들은 cisplatin 투여에 의하여 와우내 전위가 감소하는 것을 관찰하여 혈관조가 cisplatin 이독성의 발생부위라고 하였으나, 5) 다른 연구자들은 와우내 전위가 감소하지 않고 와우 음전기반응이 감소한다는 것을 관찰하여6) 일차적인 발생부위가 코티기관일 것이라고 주장하였다. McAlpine과 Johnstone7)은 유색기니픽를 이용한 cisplatin이독성 실험을 통하여 cisplatin이 외유모세포의 신호전달통로를 차단하여 난청을 유발한다고 하였는데, 유모세포의 신호전달에는 Ca2+ 이 중요한 것으로 알려져 있으므로8) 이와 같은 관찰은 cisplatin에 의해 외유모세포에 대한 직접적인 손상의 가능성을 더욱 높여주는 것이라고 할 수 있다. Laurell등9)은 cisplatin 투여 후 내림프의 K+ 이온의 수동적인 이동이 변화된다고 하였고, Saito등10)은 외유모세포의 미토콘드리아 DNA등의 표적분자와의 상호작용에 의해 이독성이 나타날 것으로 주장하였다. 그러므로, 외유모세포에서 cisplatin에 의한 I Ca, I Ba의 연구를 통해 cisplatin 이독성의 기전을 밝혀야 할 것이다. 본 연구에서는 기니픽 와우 외유모세포를 분리하여 whole cell patch clamp법을 이용하여 세포막에 존재하는 Ca2+ 통로를 통한 Ca2+ current(I Ca)와 Ba2+ current(I Ba)를 관찰하고 cisplatin 투여시 I Ba의 변화를 관찰하여 외유모세포의 Ca2+ 통로가 cisplatin에 의하여 어떠한 조절을 받는지 알아보고자 한다. 이러한 연구를 통하여 청각생리중 유모세포의 신호전달체계의 어떤 부분이 cisplatin에 의해 손상받고 있는지를 밝힐 수 있고, 더 나아가서 이런 손상을 미리 예방할 수 있는 연구가 가능하게 될 것이다. 재료 및 방법 재료 백색 기니픽(200∼250 g)에 sodium pentobarbital(50 mg/kg)을 복강내 주사하여 마취시킨 후 양측의 측두골을 얻었다. Modified Leibovitz 용액내에서 중이강을 열고 와우를 노출시킨 후 와우골포를 제거한 후 코티기관를 꺼내어 dispase(Godo Shusei, Japan, 400 protease unit)로 5분간 처리한 후 pasteur 피펫으로 흡인, 배출하여 외유모세포를 분리하였다. 분리된 외유모세포를 modified Leibovits 용액이 포함된 35 mm 배양용기에 넣어 95% O 2, 5% CO2 배양기에서 20∼30분간 배양하여 세포가 바닥에 붙도록 하였다. 분리된 세포중 세포의 모양이 실린더모양이고, 핵이 세포의 기저부에 위치하며, 세포의 첨부표면에 유모가 있는 것을 관찰하여 외유모세포임을 확인하였다(Fig. 1). 모든 실험은 단일세포를 분리하고 나서 약 30분내지 1 시간뒤에 실온(23∼25℃)의 도립현미경(inverted microscope)위에 설치되어 있는 실험용기로 옮겨서 시행하였고, 용액은 주기적으로 관류하여 세포분리의 부유물이 없도록 하였다. 전기생리학적 연구방법 단일세포의 막전압고정법 외유모세포를 대상으로 patch clamp 증폭기(List EPC-7, Heka, Germany)를 이용하여 whole cell clamp 방법11)으로 실험하였으며, 막전류는 막전압고정방식으로 기록하였다. 미세피펫 puller(Narishige, Japan)를 이용하여 borosilicate glass capillary(WPI, USA)를 뽑아서 전극의 저항이 5∼6MΩ 되는 것을 사용하였다. 전극내는 Ca2+ 전류를 기록하기 위하여 K+ 대신 Cs+으로 대치한 용액을 사용하였다(전극내 용액). 전극을 실험용액에 담근 후 외유모세포의 핵의 윗부분으로 접근하여 giga Ω seal을 만들고, 전극에 약 50∼80 cm H 2O의 음압을 주어 whole cell voltage clamp 상태를 만들고 pCLAMP 6.0 software(Axon Instruments, USA)를 이용하여 전기적인 신호를 기록하였다. 실험용액과 약물 Modified Leibovits 용액은 NaCl 142.2 mM, KCl 5.37 mM, CaCl 2 1.25 mM, MgCl 2 1.48 mM, HEPES 5.0 mM, dextrose 5.0 mM로 조성하였고, pH는 NaOH로 적정하여 7.4로 맞추었고, dextrose를 이용하여 300 mO sm로 맞추었다. 전극내 용액은 Ca2+전류를 기록하기 위하여 K+를 Cs+로 대치하였다. 용액조성은 CsCl 140 mM, HEPES 10 mM, EGTA 10 mM, ATP 2 mM, MgCl2 1 mM, GTP 0.1 mM로 조성하였고, CsOH를 이용하여 pH를 7.3∼7.35로 맞추었으며, dextrose를 이용하여 300 mOsm로 맞추었다. 실험시 사용한 실험용액은 NaCl 123 mM, TEA-Cl 20 mM, KCl 5.4 mM, MgCl 2 1 mM, CaCl 2 5 mM, glucose 10 mM, HEPES 10 mM로 조성하였고, pH는 HCl을 이용하여 7.4로, dextrose를 이용하여 300 mOsm로 맞추었다. 본 실험에 사용한 시약들은 별도로 명시하지 않는 한 Sigma사(St. Louis, USA)에서 구입하였다. Verapamil은 modified Leibovits용액에 녹여 0.3 mM의 stock solution으로 보관하여 최종농도 3 μM로 맞추었으며, cisplatin 역시 modified Leibovits용액에 녹여 0.3 mM로 투여하였다. 결과 외유모세포에서 Ca2+ 전류(I Ca)와 Ba2+ 전류(I Ba)를 기록하기 위해 charge carrier로 5 mM Ca2+ 와 5 mM Ba2+ 를 각각 사용하였다. 막전압을 -70 mV로 고정하고 200 msec 동안 0 mV인 저분극전압을 가하였을 때 내향성 I Ca와 I Ba가 기록되었다. 기록된 I Ca 전류의 peak amplitude는 -330±103 pA로 -140±50 pA의 I Ba 보다 크게 기록되었다(Fig. 2). Fig. 3에서 볼 수 있듯이 기록된 I Ba는 -50 mV의 부근에서 활성화되기 시작하여 최대전류의 크기와 자극전압의 관계를 도시한 전류-전압관계곡선에서도 0∼10 mV에서 정점을 보이고 양쪽으로 감소하는 거꾸로 된 종 모양(inverted bell shape)을 보였다. 이러한 I Ba는 organic calcium channel blocker인 verapamil 3 μM을 실험용액에 투여하였을 때 95% 이상 전류가 억제되었다(Fig. 4). -70 mV의 고정전압에서 0부터 10 mV씩 증가하여 140 mV 까지 20초간격으로 200 msec 동안 자극한 결과인 I Ba의 전류-전압관계곡선은 막전압이 0 mV일 때 -140±50 pA, 10 mV의 막전압일 때 -145±51 pA로 가장 전류가 컸으며 20 mV의 막전압에서부터 전류가 감소하고 +70 mV에서 전류가 0가 되는 역전전압을 보였다(Fig. 3). 이러한 상관관계는 세포의 길이에 관계없이 일정하게 유지되었다. 실험용액에 cisplatin을 0.3 mM 투여한 경우 기록된 초기전류의 85%로 감소하였다(Fig. 5). 이러한 효과는 Fig. 3의 전류-전압관계곡선에서 볼 수 있듯이 I Ba는 cisplatin 투여에 의하여 막전압 -40 내지 +30 mV의 범위에서 -20 pA로 감소하였다. 고찰 세포질내에 증가된 Ca2+은 세포내에 존재하는 Ca2+ 결합단백과 결합하여 조절작용을 나타내는 것으로 알려져 있다. 모든 세포는 여러 가지 세포막 결합단백질이나 펌프등의 작용에 의하여 Ca2+ 의 농도를 낮게 유지하고 있으나 여러 가지 흥분성 자극이나 저분극에 의하여 농도가 증가된다. 이렇게 증가된 Ca2+은 수축에 관여하는 단백질들을 활성화하여 수축을 유발할 뿐만 아니라 세포내에 존재하는 다양한 단백질들과 결합한다. Ca2+ 결합단백질에는 여러 가지가 있으나 대표적인 Ca2+ 결합단백질로는 calmodulin이 있다. 세포내 Ca2+ 이온의 증가의 알려진 경로는 세포막의 Ca2+ 이온통로를 통한 Ca2+의 유입이나 세포내 Ca2+ 저장고에서 유리되는 Ca2+ 등에 의해서 유발되는데,12) 와우의 유모세포에서는 전압의존성 Ca2+ 이온통로를 통한 Ca2+의 유입이 Ca2+ 의존성 K+ 전류를 조절하고,13)14) 신경전달물질의 분비13)와 외유모세포의 길이를 조절하는 것15)16)으로 알려져 있다. 특히 L-type Ca2+ 이온통로 차단제로 알려진 nimodipine은 와우음전기반응과 청신경의 복합활동전위를 억제하는 것으로 알려져 있으며,17) Bobbin등15)은 nimodipine을 외림프에 관류시킨 결과 L-type Ca2+ 이온통로가 차단되어 와우음전기반응과 복합활동전위가 억제된다고 보고하였다. 또한 nimodipine은 와우가중전압(summating potential)을 억제하는데 소리자극이 주어지면 외유모세포 또는 내유모세포의 막전위의 직류전위의 변화를 초래하며 이 변화에 의하여 가중전압이 나타나게 될 것으로 여겨지고 있다. 그러므로 L-type Ca2+ 이온통로는 이러한 직류전위의 변화를 일으키는데 중요한 역할을 한다고 볼 수 있으며, Nakagawa등18)은 기니픽의 외유모세포에서 L-type Ca2+ 이온통로를 막전압고정방법을 이용하여 증명함으로써 외유모세포가 청각신호를 받아들이는데 있어서 L-type Ca2+ 이온통로의 중요성을 강조하였다. 외유모세포에 대한 whole cell voltage clamp 실험결과 나타난 내향성 전류의 모양과 L-type Ca2+ 이온통로 차단제인 verapamil(3 μM)에 의해 I Ba가 차단되는 점등(Fig. 4)을 보아 외유모세포에 존재하는 Ca2+ 이온통로는 대부분 L-type임을 알 수 있다. 이는 다른 연구자들19)20)에 의한 결과와 유사하다. 그러나 Chen등20)은 Ca2+ 을 사용하였을 때 보다 Ba2+ 을 charge carrier로 사용하였을 때 약 30% 정도 더 큰 전류를 얻었다고 보고하였으나, 본 연구에서는 I Ca가 I Ba 보다 크게 기록되었다. 이는 Chen 등이 20 mM의 Ba2+ 을 사용한 데 비해 본 연구에서는 5 mM을 사용하였기 때문이 아닐까 추정되나 농도에 따른 I Ba의 연구를 통하여 밝혀야 할 것이다. 일반적으로 와우의 첨부회전 및 기저회전에 있는 외유모세포는 분리하기가 어려워서 주로 제 2, 3 회전에 존재하는 약 30∼70 μm의 외유모세포를 주로 많이 이용하게 된다. 다른 연구자들이 세포의 길이를 밝히고 있지 않으므로 이와 같은 차이는 세포의 길이에 따른 차이라고 생각할 수도 있다. 본 연구에서는 세포의 길이에 따른 I Ca와 I Ba의 차이에 관해서는 더 관찰하지 않았는데, 이는 향후 연구해야 할 과제이다. 본 연구에서 cisplatin 투여시 I Ba가 정상상태의 전류 최고치에 비해 약 10∼15% 수준으로 감소하였으며 이러한 억제현상은 전막전압 범위에서 관찰되었다. 이상과 같은 cisplatin에 의한 I Ca의 감소는 이독성의 여러 가지 기전중 하나로 작용할 것이다. L-type Ca2+ 이온통로 차단제인 nimodipine을 외림프에 관류시켰을 때 와우 음전기반응 및 복합활동전위가 감소한다는 보고15)를 미루어 보면 cisplatin에 의해 L-type Ca2+ 이온통로가 차단되는 현상이 결국 유모세포의 신호전달체계를 억제하며 이독성을 나타낼 것으로 생각할 수 있다. 결론 본 연구를 통하여 cisplatin은 외유모세포의 중요한 요소인 Ca2+ 이온통로를 방해하여 세포의 기능을 떨어뜨림으로 난청을 유발할 것으로 생각된다.
REFERENCES
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