Middle Ear Epithelial Cell Culture in Mongolian Gerbil.

Chung, Jong Woo; Oh, Seung Ha; Kim, Chong Sun

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery > Volume 41(10); 1998 > Article

Original Article

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1998;41(10): 1235-1240.

Middle Ear Epithelial Cell Culture in Mongolian Gerbil.

Jong Woo Chung, Seung Ha Oh, Chong Sun Kim

¹Department of Otolaryngology, Asan Medical Center, University of Ulsan College of Medicine, Seoul, Korea. chongkim@plaza.snu.ac.kr
²Department of Otolaryngology, Seoul National University, College of Medicine, Seoul, Korea.

Gerbil의 중이점막상피세포의 배양

정종우¹ · 오승하² · 김종선²

울산대학교 의과대학 서울중앙병원 이비인후과학교실1;서울대학교 의과대학 이비인후과학교실2;

주제어: 상피세포배양ㆍ중이ㆍ저빌ㆍ면역화학염색ㆍ투과전자현미경ㆍ세포증식.

ABSTRACT

BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Middle ear epithelial cells (MEECs) appear to be involved in the secretion of mucous substances and the hypersecretion of the mucus may increase the viscoelasticity of the middle ear fluid leading to the disturbance of the mucociliary transport system. The establishment of a cell culture system, therefore, provides fundamental means to define the role of epithelial cells in the pathogenesis of otitis media.
MATERIALS AND METHODS:
The epithelial cells were isolated with 0.1% protease from mongolian gerbil and were cultured in the growth media with 5% CO2 at 37degreesC. Cultured cells were characterized by immunofluorescent method against cytokeratins and by transmission electron microscopy. The proliferation activity of cultured cells was measured by [3H]-thymidine incorporation method.
RESULTS:
The cultured cells showed an polygonal shape and they reached confluency in 8th day of culture. The cells were positively stained with anti-cytokeratins by immunofl-uorescence study. By transmission EM, cultured cells showed numerous tonofilaments and desmosomes which are the characteristics of epithelial cells. Cell proliferation activity by thymidine incorporation method increased during first 48 hours and was followed by the increase in the cell number.
CONCLUSION:
We have established an epithelial cell culture system using gerbil middle ear and data on the cell proliferation activity and viability at various times following the incubation. The results of the present study provide basic information necessary for fundamental studies of epithelial cells in gerbil middle ear.

Keywords: Epithelial cell cultureㆍMiddle earㆍMonglian gerbilㆍImmunohistochemical studyㆍTransmission electron microscopeㆍProliferation

서론 중이의 염증은 소아환자의 염증성 질환 중에서 가장 흔한 질환중의 하나이다. 중이염의 발생에는 여러가지 요인이 복합되어 생길 수 있는데, 특히 중이점막상피세포자체의 혈장 투과성의 증가1)2)와 중이점막자체의 분비능력의 증가3)가 주된 요인으로 생각되고 있다. 또한 중이강내에 점성당단백의 농도가 높을수록 중이액의 점도는 증가하고 점액 배출이 용이하지 않아 중이염의 임상경과에 상당한 영향을 줄 것으로 생각된다. 점성당단백은 중이점막상피의 배세포와 점막하의 점액분비선에서 분비하는 것으로 알려져 있는데4) 중이염의 발생과 유지에 있어서 점막상피세포에서 이들 점성당단백이 어떻게 생성되고 조절되는지에 대한 뚜렷한 연구결과는 없다. 상피세포 중 배세포에서 점성당단백의 분비는 염증반응의 매개체, 호흡기점막세균, 혹은 점막의 온도, pH 등의 물리적 요소 등에 영향을 받으리라고 예상되며,5) 세포배양을 통하여 세균이나 바이러스 감염시 세포의 반응, 세포간 반응, 또 세포의 형태의 변화 등의 정보를 알 수 있으므로,6) 이상과 같은 중이의 염증반응을 이해하는데 적절한 조직배양 모델을 만드는 것은 매우 중요하다. 일반적으로 조직 배양은 계대배양을 성공할 경우 지속적으로 조직을 공급하여 연구를 손쉽게 할 뿐만 아니라 잘 통제된 환경( in vitro) 하에서 실험을 가능케 함으로써 생체를 이용한 실험( in vivo)에 비해서 인과관계의 조절 및 분석이 용이한 장점이 있다. 일반적으로 보통방법에 의해서 상피세포를 배양하면 세포의 분화가 완전하지 못하고 제기능을 갖지 못한다고 알려져 있다. 하지만 최근 적절한 영양소 배합과 성장호르몬, collagen gel 등을 이용한 상피세포 배양법이 알려져 기관지 세포에 대하여 성공적으로 사용되고 있다.7)8) 그동안 여러가지 실험동물을 이용하여 중이조직을 배양하려는 노력이 있었다. 최근까지 가장 많이 이용되고 연구되어진 중이조직배양모델은 친칠라를 이용한 것으로 추출조직배양은 일차배양6)뿐 아니라 계대배양까지 성공하였고,9) 상피세포분리배양 역시 비교적 안정된 배양 조건하에 수행되고 있다.10)11) 친칠라를 이용한 세포배양은 다른 동물에 비하여 중이강이 크고 얻기가 쉬우며 많은 상피세포를 얻을 수 있는 장점이 있지만 정상적인 친칠라의 중이점막을 보면 이관의 입구부를 제외하고는 배세포가 많이 감소되어 있으므로 점성당단백이 다른 동물에 비하여 상당히 적을 것이라고 예상할 수 있다. 또한 친칠라의 중이염 모델에서 점액성 삼출액이 보고되지 않아서 점액분비세포가 존재하지 않을 가능성을 시사하고 있다. 그러므로 친칠라의 상피세포배양모델은 적용의 한계를 가지고 있다. 저빌, 쥐 및 친칠라의 정상 중이강을 비교하여 볼 때 저빌은 쥐에 비하여 중이강이 크고 이관이 거의 수직으로 위치하며 사람의 중이와 비슷한 형태의 상피세포로 구성되어 있고 또한 자연적으로 생기는 중이염의 빈도가 쥐에서보다 적으므로 중이염을 연구하는 좋은 동물모델이다.12) 또한 섬모세포와 분비세포가 이관과 하고실에 걸쳐서 존재하며 분비세포에서는 점액을 분비하므로13) 저빌의 중이점막상피세포를 이용하여 중이염의 생화학적인 적용에 장점이 있을 것으로 생각된다. 본 연구에서는 아직은 많이 연구되어지지 않은 저빌의 중이점막상피세포를 상피세포분리배양법으로 배양하여 배양모델을 확립하고자 하였고 배양기간 중 세포증식의 양상을 파악하여 향후 연구의 기초자료를 얻고자 하였다. 방법 및 재료 상피세포의 분리 및 배양 중이질환이 없고 정상적으로 잘 사육된 몽고저빌(Meriones unguiculatus)(50∼80 gm)을 50 mg/kg의 sodium pentobarbital을 이용하여 마취한 후 중이강을 얻었다. 중이강을 파라핀 필름으로 싸서 이관을 통하여 용액이 흐르지 않도록한 후 중이강내에 0.1% protease solution XIV(Sigma, St. Loius, MO, USA)를 가득 채우고 4℃에서 보관하였다. 16시간후 용액을 모으고 10% fetal bovine serum(FBS, Sigma)이 함유된 배양액으로 서너차례 씻어내어 같이 모으고 모아진 용액을 10분간 500 g로 원심분리한 후 세포침전물을 10% FBS 배양액으로 재부유시키고 다시 원심분리하였다. 10% FBS 배양액은 Dulbecco’s modified Eagle’s media와 F-12를 동량으로 섞은 용액(DMEM/F-12, GibcoBRL, Grand Island, MD, USA)에 10% FBS, hydrocortisone 1 uM, insulin 5 ug/ml, transferrin 5 ug/ml, sodium selenite 5 ng/ml(ITS)(Sigma), penicilline 100 units/ml, streptomycin 100 ug/ml, amphotericin-B 250 ng/ml(GibcoBRL)를 섞어서 사용하였다. 이렇게 하여 생긴 세포의 덩어리를 재부유시키고 이를 20 μl 취하여 동량의 trypan blue(Sigma)를 섞어 염색하고 혈구계(hemocytometer)를 이용하여 세포의 수를 계산하였다. 35 mm 배양용기를 미리 콜라겐 용액(PC-3, ICN, Costamesa, CA, USA)으로 막을 입힌 후 재부유액을 하나의 배양용기당 약 2×105개의 세포가 되도록 배양용기에 분주하고 37℃, 5% CO2에서 24시간 배양한 후 무혈청 배양액으로 교환하였다. 이후에는 계속 2일 간격으로 무혈청 배양액으로 갈아주면서 도립현미경으로 관찰하였다. 무혈청 배양액은 DMEM/F-12에 hydrocortisone, ITS, penicillin, streptomycin, amphotericin-B, epidermal growth factor(EGF) 50 ng/ml(Becton-Dickinson, Frankline Lakes, NJ, USA), retinol acetate 0.1 uM(Sigma)을 섞어서 사용하였다. 면역형광 검사 콜라겐으로 미리 막을 입힌 직경 13 mm의 원형 coverslip(Thermanox, Nunc, Naperville, Il, USA)에 세포를 배양시킨 후 acetone에 고정하고 일차항체로 항싸이토케라틴 AE-1, AE-3(DAKO, Glosturp, Denmark), 그리고 항 vimentin을 각각 사용하였고, 이차항체로는 FITC-conjugated anti-mouse antibody를 사용하여 면역형광염색을 하여 형광현미경(Fluophot, Nikon, Osaka, Japan)을 이용하여 관찰하였다. 투과전자현미경을 이용한 미세구조의 관찰 콜라겐으로 미리 막을 입힌 직경 13 mm의 원형 coverslip에 세포를 키운 후 glutaraldehyde로 고정시키고 1% OsO4 용액으로 후고정시킨 후 알코올을 이용하여 탈수시켰다. 탈수후 조직을 propylene oxide와 agar mixture를 섞은 용액으로 포매한 후 ultramicrotome으로 약 60nm의 초박절편을 만들어서 관찰하였다(Hitachi, H-600, Tokyo, Japan). [3H]-thymidine을 이용한 세포 활성도의 측정 1 μCi/ml의 [3H]-thymidine을 포함하고 있는 배양액으로 바꾸어준 후 16시간 동안 배양시킨다. 그 후에 trypsin-EDTA를 이용하여 세포들을 배양용기의 collagen으로부터 떼어내고 이 세포들을 세포수집기를 이용하여 모은 후 cocktail 용액을 섞고 액체 섬광계수관(Packard, Ulgersmaweg, The Netherlands)를 이용하여 방사선의 양을 측정하였다. 또한 trypsin-EDTA로 세포를 떼어낸 후 혈구계를 이용하여 세포의 수를 계산하였다. 결과 배양액에 있는 각각의 상피세포는 배양 24시간후면 배양용기에 달라붙고 그곳에서부터 증식을 시작하였다. 배양된 세포는 다각형의 모양이었고, 약 8일정도 경과후에 융합된 세포의 군락을 이루었다(Fig. 1). 면역형광염색 결과 항싸이토케라틴 AE-1과 AE-3에 대해서 모두 양성반응을 보였다(Fig. 2). 세포의 군락 중심부에서는 항 vimentin에 대해서 염색이 되는 세포가 없었고, 주변부로 가면서 항 vimentin 양성인 세포가 발견되었다. 투과전자현미경검사로 장원미사(tonofilament)가 세포질내에 산재해 있는 것을 관찰할 수 있었고 세포와 세포의 경계부위에서 결합소체(desmosome)를 볼 수 있었다(Fig. 3). Thymidine 결합을 이용한 DNA양은 배양 후 처음 48시간동안 증가하였고 세포의 수는 약 2일째부터 증가하기 시작하였다. DNA양은 배양 2일후부터는 감소하기 시작하였으나 세포의 수는 배양 10일째까지 점점 증가하였다(Fig. 4). 고찰 본 연구에서는 상피세포분리배양법을 이용하여 중이점막상피세포를 배양하였다. 대개 조직배양은 기관 배양(organ culture), 추출조직배양(explant culture) 및 상피세포 분리배양법으로 나뉘며,14) 본 연구에서 시행한 상피세포분리배양법은 상피세포의 수를 극대화할 수 있고 배양조건을 쉽게 조절할 수 있기 때문에 좋은 방법으로 알려져 있다.14) Van Blitterswijk 등15)은 쥐의 중이점막상피세포를 배양하여 배양모델을 확립하였고, Nakamura 등6)9)은 친칠라에서 추출조직배양법을 이용하여, 또 Amesara 등10)은 상피세포분리배양법을 이용하여 일차배양에 성공하였다고 보고하였다. 이러한 동물모델은 중이염의 병인연구에 도움을 줄 것으로 생각되는데, 친칠라의 중이염모델에서는 점액성 삼출액이 생기지 않으므로 중이염의 병인연구에 적용되기는 어려울 것으로 생각된다. 쥐의 경우는 점액성의 중이염이 많이 발생하므로 중이염 연구모델로 자주 이용되나 저빌은 쥐보다 다루기가 쉽고, 중이강의 점막상피가 사람과 유사하여13) 중이염 연구에 더 큰 장점을 가질 것으로 생각된다. 본 연구에서는 섬유아세포가 자라는 것을 막기 위해 무혈청 배양액을 이용했는데, 세포군락의 주변부를 제외하고는 섬유아세포가 자라지 않아서 적절한 방법으로 생각된다. 섬유아세포를 줄이기 위해 putrescine을 배양액에 첨가하는 방법,10)16) 배양액내의 L-valine을 D-valine으로 바꾸는 방법,17) 배양온도를 33℃ 정도로 낮추어서 유지하는 방법18) 등이 사용되었으나, serum-free hormone-supplemented medium 의 사용이 보고된 이후에는19) 배양액의 조성을 정확하게 조절할 수 있는 무혈청배양액이 많이 사용되고 있다.10)11) 또한 무혈청배양액은 배양액내의 항생제와 더불어 세균오염의 가능성을 줄이는 장점을 가지고 있다.10) 배양된 모든 조직은 어느정도 원래의 모양이나 기능을 잃어 버리게 되며 배양조직이 얼마나 고유의 기능을 보존하고 있는지에 대하여 검증하여야 하는데 본 연구에서는 항싸이토케라틴으로 AE-1와 AE-3를 이용하였고 섬유아세포의 증식을 보기위해 항 vimentin을 이용하였다. AE-1은 비교적 산성 케라틴에 반응하며 AE-3는 알칼리성 케라틴에 반응하는 항싸이토케라틴 이다. 이러한 항싸이토케라틴에 대한 양성반응을 통하여 본 연구의 배양세포가 상피세포임을 알 수 있었다. Vimentin은 간엽조직에서 기원한 세포에 특이적인 중간세사(intermediate filament)이며, 항 vimentin염색반응을 통하여 섬유아세포가 자라는 것을 찾을 수 있는데 본 연구의 배양세포들에서는 항 vimentin에 대해 양성인 세포가 거의 없었으나 세포의 군락주위로 가면서 양성반응인 세포들이 나타나기 시작하였다. 이러한 섬유아세포의 증식에 대해서는 향후 다른 연구가 더 필요할 것으로 생각된다. 또한 전자현미경을 이용하여 상피세포의 특징인 결합소체와 장원미사 등을 관찰할 수 있었다. 이러한 검증방법을 통하여 본 연구에서 배양된 조직이 상피세포임을 증명할 수 있었고, 본 세포배양모델이 중이염 등의 연구모델로 사용될 수 있을 것으로 생각된다. [3H]-thymidine 결합방법은 세포의 증식과 분화과정에서 DNA양의 변화를 볼 수 있는 방법으로 본 연구의 배양세포에서 배양 2일째 [3H]의 양이 증가됨은 이 시기에 DNA의 합성이 왕성하게 일어나고 있다는 표시이며 세포의 수는 배양 2일째부터 증가하기 시작하여 배양 10일째까지 계속 증가되었는데, 이는 DNA합성이 왕성하게 일어난 후에 세포의 증식이 일어나기 때문일 것으로 생각된다. 이러한 결과를 통하여 본 연구의 세포배양모델에서는 배양 2일째부터 배양 10일째 사이의 기간이 세포의 증식에 가장 중요한 기간임을 알 수 있었다. 그리고 10일이후에는 세포의 수가 오히려 감소하기 시작하였는데, 이는 상피세포가 점점 분화하여 최종단계에서 세포군락에서 떨어져서 더 이상 유용한 배양세포로 작용하지 못하기 때문일 것으로 생각된다.15) 본 연구에서는 계대배양을 시행치 않았기 때문에 이와 같은 세포증식양상이 모든 상피세포에서 동일하게 일어난다고 볼 수는 없으나, 일차배양된 세포를 이용할 때 도움을 줄 것으로 생각된다. 결론 적절한 영양소의 공급과 적정한 환경하에서 저빌의 중이점막상피세포를 배양하여 상피세포임을 증명하여 배양모델을 확립하였다. 배양된 세포는 대개 배양 2일째부터 활성도가 크게 증가하였고 배양 10일정도까지 계속해서 증식하여 배양 2일에서 약 8일간 활발한 세포의 증식이 일어남을 알 수 있었고, 이 세포배양모델을 이용하여 향후 중이염의 병리기전중 중이점막세포의 역할에 대한 연구의 기초자료로 이용될 수 있으리라 생각된다.
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