Cochlear Pathology in Experimental Otitis Media with Effusion ofGuinea Pig Caused by Endotoxin.

Jung, Hak Hyun; Kim, Young Ho; Sung, Tae Hyun; Jung, Do Kwang

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery > Volume 41(12); 1998 > Article

Original Article

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1998;41(12): 1527-1535.

Cochlear Pathology in Experimental Otitis Media with Effusion ofGuinea Pig Caused by Endotoxin.

Hak Hyun Jung, Young Ho Kim, Tae Hyun Sung, Do Kwang Jung

¹Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Korea University College of Medicine, Seoul, Korea. hakjung@netsgo.com
²Sun General Hospital,Taejeon, Korea.

내독소에 의한 실험적 삼출성중이염에서 기니픽 와우의 형태학적 변화

정학현¹ · 김영호¹ · 성태현² · 정도광¹

고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실1;선병원 이비인후과2;

주제어: 감각신경성 난청ㆍ내독소ㆍ삼출성 중이염.

ABSTRACT

BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Injection of endotoxin into the middle ear of experimental animals results in otitis media with effusion and transient reversible hearing loss, which occurs in the higher concentration of endotoxin than the concentration found in human middle ear effusion. The purpose of this study was to investigate the histopathologic changes of the cochlea in guinea pigs with experimental otitis media with effusion induced by E.coli endotoxin.
MATERIALS AND METHODS:
Concentrations of lipopolysaccharides (LPS) from E.coli, such as 0.1 mg/ml, 1 mg/ml, and 10 mg/ml, were instillated into the middle ear cavity of 30 normal guinea pigs. Histopathologic changes of the cochlea were observed at 1 week after endotoxin instillation, using both light and electron microscope. Six normal guinea pigs were used as a control group whose middle ears were instillated with the physiologically sterile saline.
RESULTS:
There were deformation in the organ of Corti, partial loss of stereocilia in the hair cells, and vacuolation in stria vascularis at a concentration of 10 mg/ml lipopolysaccharides from E. coli. Mild morphologic abnormality of the cochlea was observed at the concentrations of 1 mg/ml and 0.1 mg/ml.
CONCLUSION:
A higher concentration of LPS in the middle ear cavity may produce severe inner ear damage, possibly resulting in the sensorineural hearing loss.

Keywords: EndotoxinㆍOtitis mediaㆍCochleaㆍSensorineural hearing loss

서론 Bernstein과 Praino 등1)이 1980년 만성 삼출성중이염의 저류액에서 내독소의 검출을 처음 보고한 이래 DeMaria와 Prior 등2)은 만성 삼출성중이염의 저류액에서 내독소는 80%에서 검출되며, 평균농도는 약 512 ng/ml 이었다고 하였고, Sakakura와 Hamaguchi 등3)은 저류액의 양상에 따라서 내독소의 양에 차이가 나는데, 장액성인 경우보다 점액성인 경우에서 내독소의 양이 더 많았고, 이는 점막의 섬모손상에 의하여 점액섬모운동에 장애가 생겨서 내독소의 양이 증가한다고 하였다. 내독소는 생물학적으로 활성화된 물질로 작용기전은 아직 명확히 알려져 있지 않으나 염증을 유발하고, 면역반응을 조절하며 alternative and classic pathway에 직접 작용하여 여러가지 vasoactive amines과 mediator 들을 분비하며 림프구와 대식세포를 활성화시켜 prostaglandin, lymphocyte-activating factors, tumor-necrotizing factor와 interleukin등을 분비시키고, 혈소판을 응고시켜서 serotonin을 분비시켜 모세혈관벽에 작용하여 모세혈관의 투과성 및 혈장액을 증가시키는 것으로 알려져 있다.2)4)5) 삼출성중이염이나 만성중이염에서 유발되는 감각신경성 난청에 대하여 여러 보고가 있었으나6-8) 아직 그 원인 및 기전은 확실하지 않으며, 중이강내에 이독성을 함유하고 있는 세균성 산물이 내이에 영향을 주는 것으로 추정되고 있다. 내독소가 청력소실을 초래하는 가에 대하여 Morizono와 Ikeda 9)는 내독소를 중이강내 주입한 경우 와우의 복합활동전위가 일시적으로 변화하며 이는 중이점막의 염증정도에 관련된다고 하였고, Spandow와 Anniko 등10)은 E.coli 내독소를 0.0001, 0.01 및 1 mg/ml의 농도로 정상 흰쥐의 중이강에 주입하고 시간별로 청력역치를 측정한 결과, 0.0001 mg/ml에서는 변화가 없었으나, 1 mg/ml에서는 10 KHz 이상에서 의미있는 청력역치의 상승이 있었는데 특히 31.5 KHz에서 가장 현저한 변화가 관찰되었으며 대부분 2주 이내에 정상 범위로 회복되었으나 31.5 KHz에서는 2주후까지 청력역치의 상승이 지속되었고, 약 10 dB의 청력소실이 잔존했다고 보고한 바 있다. 또한 Darrow와 Keithley 등11)도 S. typhimurium 내독소 1 mg/ml를 외림프액에 주입하면 2일에서 4일에 15~20 dB 정도의 청력소실이 발생되어 2주 후에 정상화 되었고, 0.01 mg/ml에서는 변화가 없었다고 하였다. 내독소가 내이에 미치는 병리조직학적 검사에서 Kawauchi와 DeMaria 등12)은 S. typhimurium 내독소를 중이강내 주입한 후 외림프액에서 내독소가 12시간에서 5일 사이에 관찰되었고, 나선조, 혈관조, 유모세포의 변화 및 내림프수종 등의 내이병변이 관찰되었다고 보고한 바 있으며, Tarlow와 Cosmis 등13)은 E.coli 내독소를 100 ng에서 1000 ng을 외림프액에 주입하고 약 2시간 후 특징적인 덮개막(tectorial membrane)의 부종과 내유모세포와 외유모세포의 손상이 관찰되었는데 이것은 전기생리학적 기능장애와 비례하였다고 하였고, dexamethasone으로 처리한 경우는 청력소실과 병리학적인 변화가 현저히 감소한 것으로 보아 염증에 의한 변화가 내이의 변화와 관련이 있는 것으로 보고하였다. 본 연구의 목적은 E. coli 내독소를 이용한 실험적 삼출성중이염에서 고농도의 내독소가 기니픽 와우에 미치는 형태학적인 변화를 관찰함으로써 내독소에 의한 청력 소실의 원인을 찾는 데 있다. 실험동물 및 실험방법 실험동물 실험동물은 체중 300~500g의 이개반응 및 고막소견이 정상인 36마리의 기니픽 편측 귀를 이용하였다. 실험방법 실험군으로 30마리의 기니픽 편측 귀를 이용하였으며, E. coli 내독소(serotype 0111：B4 Sigma Chemical Co.)를 생리식염수에 녹여서 0.1 mg/ml, 1 mg/ml, 10 mg/ml의 농도로 만들었다. 실험동물을 ketamine hydrochloride(50mg/kg)으로 근주하여 마취시키고 70% 알콜로 외이도를 소독한 후 1 cc 주사기로 수술현미경하에서 고막을 통하여 다른 농도의 내독소를 각각 10측에서 중이강내로 0.3~0.5 ml 주입하였다. 각 동물은 내독소 주입 후 3일에 수술현미경하에서 고막을 통하여 중이강내 저류액의 존재를 확인하였고, 1주 후에 동물을 희생시켰으며 각 농도별로 10측 중 4측은 JB-4 블록을 이용하여 Toluidine blue, Hematoxylin & Eosin(H & E)염색하여 광학현미경으로, 3측은 주사전자현미경으로, 3측은 투과전자현미경으로 와우의 형태학적 변화를 관찰하였다. 대조군으로는 6마리의 정상 기니픽 편측귀에서 위와 동일한 방법으로 생리 식염수를 고막을 통하여 0.3~0.5 ml 중이강내에 주입하였고, 1주 후에 동물을 희생시켜 각각 2측에서 광학현미경, 주사전자현미경 및 투과전자현미경으로 와우의 형태를 관찰하였다. 광학현미경의 조직표본 제작 동물을 ketamine hydrochloride로 마취한 후 심장을 노출하여 카테터를 대동맥에 삽입하고 0.2M 인산완충용액으로 세척한 후 10% 포르말린용액으로 생체고정하고 동물을 희생시켜 측두골을 적출하였다. 적출된 와우의 첨단부를 노출하고 정원창막과 난원창을 천공시켜고 고정액을 스며들게 하기 위하여 고정액속에서 1시간 고정시킨 후 0.2M 인산완충용액으로 3회 세척하고 10% nitric acid에 24시간 탈석회화 시켰다. 탈석회화된 와우를 0.2M 인산완충용액으로 세척한 후 에탄올로 탈수시키고 0.9% JB-4 촉매 A에 함입시킨 후 촉매 B와 촉매 A의 1：25 혼합용액을 만들어 embedding capsule에 와우와 합께 삽입한 후 포매하여 1 μm두께의 절편을 만들어 Toluidine blue 염색 및 H & E 염색하여 광학현미경으로 관찰하였다. 주사전자현미경의 조직표본 제작 동물을 ketamine hydrochloride로 마취한 후 동물을 희생시켜 측두골을 분리하고 와우의 골벽을 stereoscope 하에서 제거한 후 와우만을 적출하여 4℃의 2% glutaraldehyde(0.2M phosphate butter, pH 7.2)용액에서 1시간 동안 고정하고, 0.2M 인산완충용액(pH 7.2)으로 3회 세척한 후 에타놀로 탈수시키고 건조시킨 후 이온도금기로 금도금하여 주사전자현미경으로 관찰하였다. 투과전자현미경의 조직표본 제작 동물을 ketamine hydrochloride로 마취한 후 심장을 노출하여 카테터를 대동맥에 삽입하고 0.2M 인산완충용액으로 세척한 후 4℃의 2% glutaraldehyde(0.2M phosphate butter, pH 7.2)용액으로 생체고정한 후 동물을 희생시켜 측두골을 적출하였다. 적출된 와우의 첨단부를 노출하고 정원창막과 난원창을 천공시키고 고정액이 스며들게 고정액속에서 1시간 고정시킨 후 0.2M 인산완충용액으로 3회 세척하고 10% nitric acid에 24시간 동안 탈석회화 시켰다. 탈석회화된 와우를 0.2M 인산완충용액으로 세척한 후 1% osmium tetroxide 용액에 1시간 동안 고정하고 인산완충용액으로 세척한 후 에탄올로 순차적으로 탈수시키고 epon에 포매하여 1 μm 두께의 절편을 만들어 Toluidine blue로 염색하였으며, 광학현미경하에서 코티씨 기관 및 혈관조를 확인하여 200 A˚ 두께로 초박절편을 만들어 uranyl acetate와 lead citrate로 염색하여 투과전자현미경(Hitachi H-600)으로 관찰하였다. 결과 실험적 삼출성중이염의 유발 기니픽의 중이강내에 생리식염수 및 제조한 각각의 농도의 E.coli 내독소를 주입한 후 1주에 동물을 희생시켜 중이강을 관찰한 결과, 대조군인 생리식염수를 주입한 6측에서는 저류액이 관찰되지 않았으며 수술현미경하에서 골포를 제거한 후 관찰된 중이점막도 정상적이었다. 반면 내독소를 주입한 실험군에서는 0.1 mg/ml의 농도를 주입한 10측 중 2측에서, 1 mg/ml 의 농도를 주입한 10측 중 3측에서, 10 mg/ml의 농도를 주입한 10측 중 7측에서 밀짚색의 저류액이 중이강내에서 관찰되었고 저류액에 대한 균주검사에서는 음성이었으며 실험군 및 대조군의 반대편 귀는 실험기간 중 염증소견이 관찰되지 않았다. 광학현미경 소견 대조군에서는 코티씨 기관 및 혈관조가 정상이었고, 실험군으로 내독소를 0.1 mg/ml 또는 1 mg/ml 주입한 경우에서 코티씨 기관 및 혈관조는 비교적 정상적이었으나(Figs. 1 and 2), 내독소를 10 mg/ml 주입한 경우에는 중간계, 고실계, 전정계에 부유물이 모두 관찰되었고, 혈관조에서는 부종 소견을 관찰할 수 있었다(Fig. 3). 주사전자현미경 소견 대조군에서는 정상적인 와우의 유모세포들이 규칙적으로 배열되어 있었고, 유모세포의 변형은 관찰되지 않았다(Fig. 4). 실험군으로 0.1 mg/ml의 내독소를 투여한 경우는 내유모세포와 외유모세포의 형태가 잘 유지되어 있었으나 간혹 외유모세포의 제 3 열에서 입체섬모(stereocilia)의 변형 및 부분적 소실이 관찰되었다(Fig. 5). 1 mg/ml의 내독소를 투여한 경우는 외유모세포의 제 3 열에서 일부 입체섬모의 소실과 변형이 많았고, Deiters 세포의 지골형돌기(phalan-geal process)의 표면에 팽윤이 관찰되기도 하였다(Fig. 6). 10 mg/ml의 내독소를 투여한 경우는 외유모세포의 소실이 심하였으며, 일부에서는 내유모세포에서 입체섬모의 파괴가 관찰되었다(Fig. 7). 기저부, 중간부 및 첨단부에서 입체섬모 손상의 차이는 관찰되지 않았다. 투과전자현미경 소견 대조군에서는 혈관조가 정상이었으나, 실험군에서는 0.1 mg/ml와 1 mg/ml투여군에서 광학현미경으로 관찰되지 않는 혈관조의 부종 소견이 관찰되었으며(Fig. 8), 10 mg/ml의 농도에서 부종이 더욱 심하였다(Fig. 9). 0.1 mg/ml와 1 mg/ml의 농도에서는 외유모세포의 변형이 관찰되지 않았고, 10 mg/ml의 농도에서도 외유모세포의 파괴는 관찰되지 않았으나 외유모세포의 세포질내 파괴와 세포막의 팽윤이 일부 관찰되었다(Fig. 10). 고찰 본 연구결과에서 0.1 mg/ml의 내독소를 투여한 경우는 내유모세포와 외유모세포의 형태가 잘 유지되어 있었고, 1 mg/ml의 내독소를 투여한 경우는 외유모세포의 제 3열에 일부 입체섬모의 소실을 관찰할 수 있었으며, 10 mg/ml의 내독소를 투여한 경우는 외유모세포와 일부 내유모세포의 입체섬모 소실이 심하였다. 또한 내독소의 증가에 따라 혈관조의 부종도 증가하였다. 이는 내독소가 내이에 독성을 일으켜 내이손상을 초래하며 병리형태학적으로 혈관조와 유모세포에 영향을 주는 것으로 생각되며, 내독소가 실험동물의 혈관조에서 이온불균형(ion imbalance)을 초래하거나 또는 덮개막(tectorial membrane)이나 입체섬모에 영향을 주어 감각신경성 난청을 초래한다는 소견과 일치한다.14)15) 본 연구에서 E.coli 내독소를 주입한 후 기간별로 관찰하지 않고 1주에 관찰한 이유로는 중이강내에 0.1 mg/ml 농도의 내독소를 주입하는 경우에 대부분 내독소 용액은 12시간 이전에 소실되고, 12시간부터 저류액이 형성되며 1주내에 소실되게 된다.16) 점막의 변화도 1주이후 정상화되므로, 고농도의 내독소를 투여하여 염증을 장기간 유지시키고 1주 후에 관찰하였으며 기간별 관찰은 추후에 보고하고자 한다. 본 연구에서 사용한 E. coli 내독소는 구성성분에 있어서 H. influenza나 S. typhimurium과 독성의 차이는 크게 없으며, 실험 동물에서 삼출성중이염도 동일하게 유발된다.16) 그러나 인체 삼출성중이염 저류액에서 관찰되는 내독소의 양은 극히 적으며2)5) 그 농도로 실험 동물에서 감각신경성난청을 유발할 수는 없다. 반면, 인체 삼출성중이염은 내독소에 장기간 노출될 가능성이 있으므로 저농도의 내독소에 의한 장기간 자극에 의한 실험 동물의 모형으로 내독소에 의한 감각신경성난청을 입증할 필요가 있으나 아직 이에 대한 실험은 빈번한 고막천공으로 인하여 이차 감염의 가능성으로 어렵다. 본 연구에서 사용한 내독소 농도는 삼출성중이염의 저류액에서 관찰되는 농도보다 약 10 7~10 9배 강하나, 실험동물에서 내독소를 내림프액내로 주입하여 전기생리학적인 측면이나 병리조직학적인 측면에서 청력소실 및 외유모세포의 손상을 관찰한 연구와 비교해 보면,1)4)7)11) 내림프액내에 투여된 내독소는 농도면에서 중이강내에 주입한 경우보다 적은 양에서도 내이의 변화를 초래할 수 있으므로 본 연구에서 최고 10 mg/ml를 사용하게 되었다. 내독소가 직접 내이에 영향을 주어 내이 손상을 일으키는지 혹은 간접적으로 영향을 주는지에 대하여는 논란이 있다. Huang5)의 보고에 의하면 내독소는 배양된 유모세포에 직접 작용하여 생존을 억제한다고 하였으며, Darrow11)는 고농도의 내독소에서만 유모세포의 파괴가 가능하므로 염증성 산물(inflammatory mediator)에 의한 유모세포의 손상을 가정하였다. 이와 같이 생체외 또는 생체내에서 차이가 나는 것은 세포배양시 유모세포의 추출로 인한 세포막변화가 초래될 수 있고 세포배양방법의 차이가 유모세포에 영향을 줄 수 있으며, 생체내 실험에서는 기저막이 내독소와 결합함으로써 유모세포의 손상을 감소시켜 차이가 발생할 수 있다. 본 연구에서 와우의 회전별 차이가 없었는 데 이는 다른 연구에서 내독소는 고음역의 감각신경성 난청을 초래하고, 형태학적으로 기저부의 손상이 많다는 보고10-12)와 차이가 있을 수 있다. 이것은 내독소의 농도에 따른 차이 일수도 있으며 주입방법의 차이에 의하여 다를 수도 있다. 그러나 실험동물에서 정상 정원창막을 통과하는 내독소의 양은 중이강내에 주입한 내독소 양의 약 1/10,000 정도 밖에 않되므로 정원창막이 내이를 보호하고 실제적으로 투과하는 내독소의 양은 많지 않을 수 있다.17) 또한 저류액의 지속 시간과 관계없이 초기 내독소의 투여양이 중요하다. 따라서 내독소가 청력소실을 초래하는 기전에 대하여 유모세포에 대한 직접적인 손상으로 염증매개체(inflammatory mediator)가 관여하며,5)11)18) 특히 독성물질에 의하여 이차 염증반응과 IL-2에 의한 와우손상 가능성이 있으며19) 내독소에 의한 청력소실 기전에 대한 연구는 향후 더 필요할 것으로 생각된다. 결론 E.coli 내독소를 기니픽 중이강내에 주입 후 1주일에 와우의 병리조직학적 변화를 관찰한 결과, 내독소 0.1 mg/ml 및 1 mg/ml의 농도에서는 기니픽 외유모세포 제 3 열의 입체섬모의 손상 및 혈관조의 부종소견이 관찰되었으며, 10 mg/ml의 농도에서는 내유모세포와 외유모세포의 입체섬모 손상, Deiters세포의 세포막 팽윤 및 혈관조의 심한 부종소견이 관찰되었다. 따라서 고농도의 내독소는 와우에 손상을 주어 감각신경성 난청을 초래할 것으로 생각되었다.
REFERENCES
1) Bernstein JM, Praino MD, Neter E. Detection of endotoxin in ear specimens from patients with chronic otitis media by means of the Limulus amebocyte lysate test. Can J Microbiol 1980;26:546-8. 2) DeMaria TF, Prior RB, Briggs BR, Lim DJ, Brick HJ. Endotoxin in middle ear effusions from patients with chronic otitis media with effusion. J Clin Microbiol 1984;20:15-7. 3) Sakakura K, Hamaguchi Y, Harada T, Yamagiwa M, Sakakura Y. Endotoxin and lysosomal protease activity in acute and chronic otitis media with effusion. Ann Otol Rhinol Laryngol 1990;99(5 Pt 1):379-85. 4) DeMaria TF. Endotoxin and otitis media. Ann Otol Rhinol Laryngol 1988;97:31-3. 5) Huang M, Dulon D, Schact J. Outer hair cells as potential targets of inflammatory mediators. Ann Otol Rhinol Laryngol 1990;(Suppl 148):35-8. 6) Aviei A, Ostfeld E. Acquired irreversible sensorineural hearing loss associated with otitis media with effusion. Am J Otolaryngol 1982;3:217-22. 7) Arnold W, Ganzer U, Kleinmann. Sensorineural heaing loss in mucous otitis. Arch Otol-Rhinol-Laryngol 1977;19:91-3. 8) Prado S, Paparella MM. Sensorineural hearing loss secondary to bacterial infection. Otolaryngol Clin North Am 1978;11:1. 9) Morizono T, Ikeda K. Effect of Escherichia coli endotoxin of cochlear potentials following its application to the chinchilla middle ear. Eur Arch Otorhinolaryngol 1990;247:40-2. 10) Spandow O, Anniko M, Hellstrom S. Inner ear disturbances following inoculation of endotoxin into the middle ear. Acta Otolaryngol 1989;107:90-6. 11) Darrow DH, Keithley EM, Harris HP. Effects of bacterial endotoxin applied to the guinea pig cochlea. Laryngoscope 1992;102:683-8. 12) Kawauchi H, DeMaria TF, Lim DJ. Endotoxin permeability through the round window membrane. Acta Otolaryngol 1988;Suppl 457:100-15. 13) Tarlow M, Comis SD, Osborne MP. Endotoxin induced damage to the cochlea in guinea pigs. Arch Dis Child 1991;66:181-4. 14) Guo Y, Wu Y, Chen W, Lin J. Endotoxic damage to the stria vascularis: The pathogenesis of sensorineural hearing loss. J Laryngol Otol 1994;108:310-3. 15) Comis SD, Osborne MP, Tarlow MJ. The effect of bacterial endotoxin upon the morphology of the tectorial membrane and stereocilia in the guinea pig cochlea. Scanning Microsc 1991;5:1129-33. 16) Jung HH, Choi JO, Yoo HK. Otitis media with effusion induced by E. coli endotoxin. Korean J Otolaryngol 1991;34:879-94. 17) Lundman L, Juhn SK, Bagger-Sjoback D, Svanborg C. Permeability of the normal round window membrane to Hemophilus inluenzae type b endotoxin. Acta Otolaryngol (Stockh) 1992;112:523-9. 18) Morrison DC, Ulevitch RJ. The effects of bacterial endotoxin on host mediator system. Am J Pathol 1978;93:527-617. 19) Lundman L, Dan BS, Juhn SK, Morozono T. Pseudomonas aeruginosa exotoxin A and hemophilus influenzae type b endotoxin. Acta Otolaryngol (Stockh) 1992;493:69-76.