| The Transforming Growth Factor-beta1 Expression in Normal Laryngeal Mucosa, Laryngeal Dysplasia and Laryngeal Carcinoma. |
| Young Wan Jin, Dong Yeup Lee, Chang Il Cha, Sang Hoon Park, Nam Pyo Hong, Hwoe Young Ahn |
| Department of Otolaryngology, College of Medicine, Kyunghee University, Seoul, Korea. enthn@unitel.co.kr |
| 정상 후두상피, 후두이형성증 및 후두암에서의 Transforming Growth Factor-β1 발현 |
| 진영완 · 이동엽 · 차창일 · 박상훈 · 홍남표 · 안회영 |
| 경희대학교 의과대학 이비인후과학교실 |
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| 주제어:
TGF-β1ㆍ악성화ㆍ후두암. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Transforming growth factor-beta1 (TGF-beta1) is a multifunctional regulator of cellular differentiation, motility and growth. Loss of sensitivity to the growth inhibitory effects by TGF-beta1 plays important roles in neoplastic progression. So expression of TGF-beta1 has been described in several tumors, but little is known about the role of TGF-beta1 in neoplastic progression of human larynx. The aim of this study was to investigate the role of TGF-beta1 in the neoplastic progression of human larynx.
MATERIALS AND METHODS:
We evaluated the expression of TGF-beta1 using immunohistochemical study in 6 cases of normal laryngeal mucosa, 6 cases of laryngeal dysplasia, 20 cases of laryngeal carcinoma.
RESULTS:
The results were as follows: 1) Normal laryngeal mucosa has no expression of TGF-beta1. 2) The expression of TGF-beta was 16.7% in laryngeal dysplasia, 50.0% in laryngeal carcinoma.
CONCLUSION:
The TGF-beta1 expression rate was correlated to the progression of laryngeal lesions when compared to normal laryngeal mucosa, laryngeal dysplasia and laryngeal carcinoma. |
| Keywords:
Transforming growth factor-beta1ㆍNeoplastic progressionㆍLaryngeal carcinoma |
서론
인체 세포는 성장촉진 및 억제인자 상호간의 조절 속에 정상적인 생활을 영위해 나가지만 여러가지 다양한 유전학적 변화에 의하여 이러한 조절인자의 불균형이 발생하게 되면 세포의 형질전환이 일어나게 되고 그 결과 생화학적 및 형태학적 성상이 달라진 변이세포가 비가역적으로 증식하게 되어 세포의 악성변형을 일으켜 결국 암으로 변이된다.1) 이러한 세포의 성장인자와 암과의 관계에 대한 객관적인 연관성을 찾기위한 연구로 최근 면역조직화학적인 연구들이 진전되면서 여러 악성종양의 본질 및 생물학적 특성을 파악하여 종양의 활성을 평가하는 연구가 행해지고 있으며, 또한 악성종양의 예후를 결정하고 세포 증식 과정에 관여하는 여러 물질들의 발견이 가능하게 되었다.1) 이중 transforming growth factor-β(이하 TGF-β)는 독특한 수용체에 반응하는 분자량 25,000 dalton의 동일 이합체(homodi-meric peptide)로서 다양한 기능을 가진 성장인자로 알려져 있다.2) TGF-β에는 현재까지 TGF-β1, β2, β3, β4 및 β5의 5종류의 아형이 존재함이 밝혀졌고,1)2) 이들 서로간에는 64∼82%의 유전자를 공유함이 밝혀졌다. 이중 TGF-β1이 사람에게 가장 많이 존재하는 아형이며 대부분의 종양에서 자가분비(autocrine) 및 측분비(paracrine) 효과를 가지고 종양의 성장에 관여하며,2) 이러한 TGF-β1의 성장억제 작용에 대한 세포반응의 소실이 종양화의 중요한 과정임이 대두되고 있다.3)4)
최근 면역조직화학적 방법이 소개되어 이를 이용해 갑상선 종양, 간암, 전립선암, 결장암 등의 다양한 암종에서 TGF- β의 양성발현을 살펴본 연구가 행해지고 있으며,5-8) 이상의 연구에서 TGF-β1을 이용한 종양세포의 염색에 있어 양성발현의 비율은 악성종양의 악성도의 지표로 생각되고 있다. 그러나 현재까지 후두에서 정상 상피, 암전구 단계 그리고 악성종양에서 TGF-β1의 발현도를 동시에 조사하여 질병의 진행단계와 그 발현도와의 상관관계를 살펴본 연구는 없었다.
이에 저자는 정상 후두조직과 후두이형성증, 후두암 환자에서 얻은, 정상에서 악성에 이르는 순차적인 병변의 파라핀 포매조직을 TGF-β1의 단클론 항체로 면역조직화학적 염색을 시행하여 TGF-β1이 후두암의 악성화 과정에 연관이 있는지 알아보고자 본 연구를 시행하였다.
재료 및 방법
대상
1993년 3월부터 1998년 7월까지 경희대학교 의과대학 이비인후과학교실에서 후두수술을 시행 받은 환자 중 병리조직학적으로 진단된 6례의 후두이형성증, 20례의 후두편평세포암 환자를 대상으로 하였다. 정상 후두조직은 6례의 후두결절 환자에서 채취하였다.
대상의 연령 분포는 후두 이형성의 경우 47세에서 78세(평균 55.0세), 후두암의 경우 50세에서 70세(평균 57.8세)였다.
방법
면역조직화학적 검사
각각의 조직을 10% 포르말린 용액에 고정시킨 후 파라핀 포매시키고 4 μm의 두께로 연속절편을 작성하여 gelatin 처리된 슬라이드에 붙인 다음 1매는 Hematoxylin-Eosin으로 염색하여 병변조직이 현저한 곳을 선정하였으며 다른 조직절편은 TGF-β1에 대한 면역조직화학적 염색을 시행하였다. 먼저 xylene으로 5분간 탈파라핀화하고 100 %, 90%, 80% 알콜로 처리한 후 증류수로 처리하였다. 3 % 과산화수소수로 15분간 처리하여 내인성 과산화효소를 억제시킨 후 pH 7.6의 Tris 완충액으로 5분간 2회 헹군 후 비특이적 염색을 없애기 위해 protein blocking agent(phosphate buffered saline, carrier protein, 15 mM sodium azide)로 5분간 2회 세척한 후 처리하고 실온에서 일차 항체인 mouse antihuman TGF-β1(1：200, Bio-source, Camarillo, USA)을 점적 후 실온에서 1시간 동안 반응시키고 다시 Tris 완충액으로 5분간 2회 수세 후 이차항체인 biotin과 결합된 horse antimouse IgG로 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 이후 streptavidin 시약으로 10분간 반응시킨 후 DAB(diaminobenzidine) 시약으로 양성세포가 갈색으로 충분히 염색될 때까지 관찰하면서 반응시간을 조절하였으며 1분간 Harris hematoxylin 염색으로 대조염색한 후 glycerol medium으로 봉입한 다음 광학 현미경으로 관찰하였다. 음성대조군으로는 일차 항체 대신에 phosphate buttered saline을 넣고 같은 방법으로 시행하였다.
면역염색의 평가
면역염색된 모든 조직은 저배율로 관찰하면서 염색이 잘 되어 있는 부분을 골라 각각의 절편을 고배율(×400)로 관찰하였다. 조직세포의 세포질내에 연갈색의 과립성 세포침착이 된 경우를 양성세포로 판독하였고 양성세포의 비율이 고배율에서 적어도 1% 이상인 경우를 양성으로 판정하였다.
통계학적 검증
정상 후두상피, 후두이형성증, 후두암에서 각각의 TGF-β1 양성률에 대한 비교는 Ridit-score에 의한 경향분석법을 이용하였다.
결과
정상 후두상피
정상 후두조직 6례에서 TGF-β1의 염색은 관찰되지 않았다(Fig. 1).
질병진행과 TGF-β1 양성발현율
후두이형성증의 경우 6례중 1례에서 세포질내 국소 염색양상을 보여(Fig. 2) 16.7%의 TGF-β1 양성발현율을 보였으며 후두암에서는 20례중 10례에서 기저세포층과 세포질내 미만성 염색양상을 보여(Fig. 3) 50.0%에서 TGF-β1의 양성발현율을 보였다(Table 1). 이상 후두 조직에서 병변이 진행할수록 TGF-β1의 발현이 통계학적으로 의미있게 증가하였다(ridit score＝5.948, p＝0.015).
고찰
종양전구단계 병변과 악성종양에서 증식능력의 평가는 환자의 치료계획을 세우거나 또는 환자의 예후를 추측하는 인자로 임상 응용이 기대되며, 최근 종양의 본질 및 생물학적 특성을 파악하여 종양의 활성을 평가하는 연구가 행해지고 있으며, 또한 악성종양의 예후를 결정하는 인자를 알아내기 위한 연구가 실시되어지고 있다.
이중 transforming growth factor-β(이하 TGF-β)는 독특한 수용체에 반응하는 25,000 dalton의 분자량을 가지는 2개의 동일한 112개의 아미노산이 서로 다른 염기배열을 하고 있는 폴리펩타이드로 구성된 disulfide-linked homodimetric protein으로 β1, β2, β3, β4, β5의 유전자가 있는데 사람에서는 β1, β2, β3만이 밝혀졌고 β4는 그 존재가 불확실하며 β5는 다른 동물에서 밝혀져 있으며, 이들 서로간에 64∼82%의 염기서열의 동질성을 갖고 있어 질적으로 매우 유사한 생물학적 활동을 하고 있는 것으로 밝혀졌다.9) 이중 TGF-β1은 사람에게 가장 많이 존재하는 아형으로 인체내 혈소판, 뼈 등에 가장 많이 존재하며 이외 여러종류의 상피세포 및 간 등 여러 장기에 존재한다.10) 또한 TGF-β1은 작용하는 세포 종류에 따라, 동일한 세포라도 세포농도, 배양조건, TGF-β1의 농도 등 실험조건에 따라 epidermal growth factor(EGF), platelet-derived growth factor(PDGF), fibroblast growth factor(FGF), tumor necrosis factor-α(TNF-α) 등의 다른 성장인자들에 상승작용 및 길항작용을 하기도 하며, 세포성장 및 분화를 촉진 또는 억제시키기도 하고, 세포외 기질의 생성과 조직 개형(remodeling)을 촉진시키는 등 여러 작용을 담당하고 있다.1)2)11) 알려진 주된 기능으로는 상피세포, 골수세포로부터 유도된 배양세포들에서는 강력한 성장억제인자로서의 기능이 밝혀졌고,12) 혈관생성과 염증세포의 이주에 매개체 역할을 하며, 콜라겐 및 섬유아세포의 합성을 증진시키는 작용을 하기도 하며,2) T와 B 임파구의 성장억제에 관여하여 면역 억제 기능을 담당하기도 하고,13) 각종 자가면역성질환이나 섬유화를 동반하는 여러 만성염증성질환의 병인에 관여함이 보고되고 있다.13-15) 또한 TGF-β1은 대부분의 종양에서 자가분비 및 측분비 효과를 가지며, 측분비 효과에 의해 혈관내피세포, 섬유아세포 등이 증식하여 혈관신생이 촉진되며 세포 기질외 합성과 조직 개형이 유발되어 종양의 성장에 관여한다.3)4)16) 또한 TGF-β1의 상피세포 성장억제 작용에 대한 종양세포에서의 반응소실(loss of aut-ocrine inhibitory effect)이 암의 증식과 침윤을 유발하게 함으로 암의 악성도와 종양진행을 예견하는 지표로 이용될 수 있다고 보고하고 있다.16) 종양세포가 TGF-β1의 성장억제 작용에 반응하지 않는 기전으로는 첫째, latent TGF-β1을 활성화시키는 능력을 세포가 상실했을 경우, 둘째, 신호전달체계의 변화로 TGF-β1과 그 수용체의 결합에서 생기는 신호를 적절하게 판단할 수 없는 경우, 셋째, 종양세포에 그 수용체가 없는 경우 등으로 생각되고 있다.16)
TGF-β1의 종양세포에 대한 작용을 알아보기 위해 여러 종양세포에서 TGF-β1의 발현을 보고하고 있는데, Zaho 등5)은 간세포성 종양의 여러 단계별 면역조직화학적 염색에서 정상 간세포와 이형성증에서는 TGF-β1이 존재하지 않았지만 종양세포에서는 TGF-β1의 발현을 보고하였으며 Cardillo 등6)도 13례의 결장선암과 34례의 결장선암종을 대상으로 TGF-β1의 발현도를 조사한 결과 정상상피조직에서는 발현되지 않은 TGF-β1이 양성종양에서 69%, 악성종양에서 88%의 발현율을 보였으며 양성종양의 경우에도 이형성증을 동반한 선암에서의 발현율이 이형성증을 동반하지 않은 경우보다 높음을 보고하여, 결장암의 발암과정의 초기에 TGF-β1의 deregulation이 일어남을 제시하였다. Timme 등7)은 정상전립선세포, 양성전립선비대증, 전립선암에서의 TGF-β1의 발현이 각각 8.6%, 26%, 59%로 나타나 전립선암에서의 악성화에 TGF-β1이 관여하고 있음을 보고하였으며 악성종양에서는 TGF-β1의 발현이 주로 세포내에서 발현됨에 비해 양성전립선비대에서는 간질세포에 주로 발현됨을 보고하였다. 종양세포에서 TGF-β1이 세포질내에 염색되는 경우는 TGF-β1의 합성 증가와 분비가 감소된 경우의 두가지로 생각할 수 있는데 Flanders 등17)은 세포질내에서 염색되는 TGF-β양상과 mRNA의 발현이 일치하므로 세포질에서의 발현은 합성되는 위치를 가리킨다고 하였으며 세포외에서 염색되는 경우는 TGF-β의 분비가 그 곳으로 증가되었음을 의미한다고 하였다. 본 실험에서도 종양세포내에서 TGF-β1이 염색되었기 때문에 TGF- β1이 종양세포에서 합성된 것으로 생각하였다.
두경부 영역에서의 연구에서도, Jassani 등8)은 갑상선 종양의 여러 단계별 면역조직화학적 염색에서 양성종양과 정상 갑상선 상피 세포에는 TGF-β가 존재하지 않았지만 악성종양에서는 TGF-β가 확인되었다고 보고하였으며, 특히 분화도가 나쁜 악성종양에서 그리고 임상적으로 진행된 암세포에서 TGF-β의 면역염색화학적 발현을 보고하였다. Eisma 등18)도 47례의 두경부 편평세포암을 이용한 TGF-β의 면역조직화학적염색 결과 47례 모두에서 종양간질세포에 강양성이 나타남을 보고하였으며, 40례에서 TGF-β 수용체 1형의 결여와 43례에서 TGF-β 수용체 2형의 결여를 보고하여 두경부종양세포에서의 세포성장에 TGF-β 수용체의 결여가 병인으로 작용함을 제시하였다. 그러나 Ita-ya 등19)은 31례의 두경부 편평세포암을 이용한 면역조직학적염색 결과 주위 간질세포와 정상세포에 비해 종양세포의 TGF-β 발현율의 차이가 없다고 보고하였으며, 임파절 전이와 종양크기 등의 임상적 병기와의 상관관계는 없다고 보고하였다. 국내 연구에서도 Oh 등1)은 30례의 후두편평세포암을 이용한 TGF-β2의 발현을 살펴본 연구에서 분화도가 높은 경우 88.9%, 중증도 및 분화도가 낮은 경우 100%의 양성발현율을 보고하여 TGF-β2의 발현강도 및 양상이 세포분화도가 낮을수록 높게 나타나지만, 임상적 병기와 비교해 볼 때 임파절 전이와 원발병소의 병기와의 유의성은 없다고 보고하였다. 본 연구에서와 발현율의 차이는 아형간의 차이로 사료된다.
결론
저자들은 1993년 3월부터 1998년 7월까지 경희대학교 의과대학 이비인후과학교실에서 후두수술을 시행 받은 환자 중 6례의 정상 후두조직, 6례의 후두이형성증, 20례의 후두암 환자를 대상으로 TGF-β1의 단클론 항체를 이용한 면역조직화학적 검사를 시행하여 정상 후두상피에서는 한 례도 없었던 TGF-β1의 양성발현이 후두이형성증에서는 6례중 1례로 16.7%, 후두암에서는 20례중 10례로 50%의 발현을 보여 TGF-β1이 후두암으로의 이행과정에서 발현이 증가됨을 알 수 있었다.
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