Voltage-Dependent Potassium Currents in Acutely Isolated Rat Medial Vestibular Nucleus Neurons.

Chun, Sang Woo; Lee, Jae Sung; Park, Byung Rim

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery > Volume 42(9); 1999 > Article

Original Article

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1999;42(9): 1081-1088.

Voltage-Dependent Potassium Currents in Acutely Isolated Rat Medial Vestibular Nucleus Neurons.

Sang Woo Chun, Jae Sung Lee, Byung Rim Park

¹Department of Physiology, College of Dentistry, Wonkwang University, Iksan, Korea. byungp@wonnms.wonkwang.ac.kr
²Department of Physiology, Wonkwang University School of Medicine, and MRRC at Wonkwang University, Iksan, Korea.

급속분리한 흰쥐 내측 전정핵 뉴론의 전압의존성 포타슘전류

천상우¹ · 이재성² · 박병림²

원광대학교 치과대학 생리학교실1;원광대학교 의과대학 생리학교실 및 의약자원연구센터2;

주제어: 내측 전정핵 뉴론ㆍ급속분리 뉴론ㆍWhole cell patch clampㆍ포타슘전류.

ABSTRACT

BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Medial vestibular nucleus (MVN) neurons are second-order afferent neurons that are involved in the reflex control of the head and eyes. Results from several studies utilizing the intracellular microelectrode recording techniques suggest the presence of several ionic conductances contributes to the regulation of the MVN neuron excitability in rats. In this study, the types and characteristics of voltage-dependent potassium currents were investigated in acutely isolated MVN neurons of postnatal rats. Material and
Methods:
Electrophysiological recordings were performed by means of the whole cell patch clamp techniques. Coronal slice (400 nm) of the vestibular nucleus region was sequentially treated with pronase 0.2 mg/ml and thermolysin 0.2 mg/ml, then single neurons were mechanically dissociated
RESULTS:
In a Ca2+ -free solution, low-threshold transient (IA) and high-threshold sustained (IK) currents were recorded. IK was activated (gamma=4.0-12.4 ms at 10 mV) and inactivated (gamma=180-720 ms at 10 mV) more slowly than IA. The half-maximum activation and inactivation potential were -3.1+/-3.4 mV and -38.8+/-3.6 mV, respectively. IA was activated rapidly (gamma=1.0-2.3 ms at 10 mV) and inactivated in 10-60 ms. The half-maximum activation and inactivation potentials were -22.3+/-4.5 mV and -58.4+/-3.8 mV, respectively. When a 4-aminopyridine of 10 mM was applied, IA was almost totally blocked. In a solution with 2 mM Ca2+, calcium dependent potassium currents were identified by application of a Ca2+ free solution and consisted of a transient and a sustained components. Exposure to 0.3 nM apamin induced a reversible reduction of a sustained components.
CONCLUSION:
These results suggest that MVN neurons express a variety of voltage-dependent potassium currents which are responsible for proper membrane excitability and firing of MVN neurons.

Keywords: Medial vestibular nucleus neuronㆍAcutely isolated neuronㆍWhole cell patch clampㆍPotassium current

서론 전정신경계의 손상은 오심, 구토, 현기증, 자발안진 및 두부편위와 같은 전정증상을 초래하는데 전정증상 중에서 일부는 시일이 경과함에 따라 점차 소실되기 때문에 이를 전정기능의 보상작용이라 한다. 전정보상작용에 대한 현재까지의 연구 결과에 의하면 전정기관의 손상 후 증상의 회복은 손상측 전정핵, 특히 내측 전정핵의 I형 뉴론의 전기활동성의 회복과 밀접히 관련되어 있다고 한다.1) 최근 뇌간 부위의 절편을 이용한 전기생리학적 실험에서 전정핵 뉴론의 전기활동성이 구심성 입력신호가 차단된 상태에서도 발생되는 것을 확인하고 전정기관 손상에 의한 전정핵 전기활동성의 불균형은 전정핵 뉴론이 갖는 고유의 막 특성에 의해 회복될 것이라는 가설(intrinsic mechanism hypothesis)이 제기되어 이에 대한 연구가 진행되고 있다.2)3) 특히 Gallagher 등4)의 실험에서 내측 전정핵 뉴론이 체외실험 상태에서도 생체내에서와 유사한 자발적 흥분발사율을 보이고 시냅스 전달을 차단한 이후에도 지속되어 내측 전정핵 뉴론이 내재적으로 긴장성 활성을 가지고 있음을 확인하고 이러한 특성이 막전압 의존적 통로 또는 내재적 향도잡이식 활성(intrinsic pacemaker type activity)에 기인할 것이라 추측한 이후 막전압 의존적 통로에 대한 연구에 관심을 가지게 되었다. 내측 전정핵에서 내재적 막특성에 대한 연구는 Gallagher 등4)의 보고 이후 대부분의 연구가 세포외 기록법을 이용한 내측 전정핵의 흥분발사율(firing rate)에 대한 여러 가지 신경전달물질이나 약물에 대한 효과를 확인하는 것이었다. 이후 Serafin 등5)은 세포내 기록법으로 내측 전정핵뉴론에서 이온통로의 종류를 통로차단제를 이용하여 지연성 정류형(delayed rectifier) 포타슘전류, A형 포타슘전류, 역치가 높은 칼슘전류, 역치가 낮은 칼슘전류, 지속성 소디움전류 등의 존재를 추측하였고, 또한 Johnston 등6)은 유사한 방법으로 포타슘통로를 중심으로 한 실험에서 지연성 정류형 포타슘전류(I K), A형 포타슘전류(I A), apamin 비 민감성 칼슘 활성화 포타슘전류(I C), apamin 민감성 전류(I AHP) 등이 존재함을 확인하고 이들의 역할에 의해 긴장성 활동성을 유지하리라 예상하였다. 그러나 이들의 실험은 이온통로 억제제에 의한 활동전압의 형태변화를 근거로 추측한 것으로 보다 정확하게 이온통로의 존재를 규명하기 위해서는 막전압고정법(voltage clamping)에 의한 확인이 필요하다. Patch clamp 기법은 이러한 세포의 이온전류를 기록하는데 유용하게 이용되는데 배양된 세포를 사용하거나 단백분해 효소처리 후 기계적 방법으로 조직에서 급속분리한 단일세포 또는 조직절편이 사용된다.7) 이 연구에서는 말초 전정수용체로부터 입력정보를 받아 개체의 균형유지에 관여할 뿐만 아니라 전정기관 손상 후 보상과정에 관여하는 내측 전정핵 뉴론의 기능을 보다 정확하게 이해하기 위하여 흰쥐의 내측 전정핵에서 단백분해 효소처리로 급속분리된 신경세포의 막전압의존성 포타슘통로의 종류를 확인하고 각각의 통로들에 대한 전기생리학적 특성을 조사하였다. 실험방법 내측 전정신경핵 세포의 분리 단일 내측 전정핵 세포는 Kay와 Wong 8)의 방법을 이용하여 분리하였다. 암수 구분 없이 생후 13~16일된 Sprague-Dawley 흰쥐를 ether로 마취한 후 소뇌와 뇌간부위를 적출하여 O2/CO2로 포화된 4℃의 인공 뇌척수액에 넣은 후 순간접착제(cyanoacrylate glue)를 이용하여 뇌조직을 고정시키고 조직절편기(DTK-1000, Dosaka Co., 일본)를 이용하여 내측 전정핵 부위를 400 μm두께로 관상면으로 절단하여 뇌절편을 만들었다. 뇌절편은 실온에서 1시간 이상 배양용액에 보관한 후 단백분해 효소인 pronase(0.2 mg/ml, Sigma Co., 미국)로 35℃에서 30~50분 동안 처리하고, thermolysin(0.2 mg/ml, Sigma Co, 미국)에 같은 온도로 15분간 처리하였다. 효소처리가 끝난 뇌절편은 효소가 없는 배양용액에 보관하였다. 내측 전정핵 부위는 뇌지도를 참고하여 21G 주사침으로 천공하여 얻었고 이를 기록하고자 하는 전류의 세포외 용액이 들어있는 용기에 옮긴 후 작은 피펫속으로 흡입, 분출하는 과정을 반복하여 단일세포를 분리하였다. 분리후 세포가 용기 바닥에 부착할 때까지 15분 정도 기다린 후 실험을 시작하였다. 실험용액 배양용액의 조성(mM)은 124 NaCl, 5 KCl, 1.2 KH2PO4, 1.3 MgSO4, 2.4 CaCl2, 10 glucose, 24 NaHCO3 등으로 구성되었으며, 95% O 2-5% CO2를 계속적으로 공급하였다. 포타슘전류의 기록을 위해서는 세포외 용액(mM)을 140 Choline-Cl, 1 KCl, 2 MgCl2, 1 C OCl2, 10 N-2-hyd-roxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid(HEPES), 30 Glucose, pH 7.4로 하였고, 세포내 용액의 조성(mM)은 140 KCl, 2 MgCl2, 1 CaCl 2, 10 HEPES, 5 ethylene glycol-bis( β-aminoethylester)-N,N,N',N'-tetraacetic acid(EGTA), 2 MgATP 이었으며 pH는 7.3으로 하였다. 또한 칼슘에 의해 활성화되는 포타슘 전류를 기록하기 위하여 세포외 용액에 2 mM의 칼슘을 추가하였고, 세포내 용액의 EGTA를 0.5 mM로 사용하였다. 실험에 사용한 시약은 지연성 정류형 전류를 확인하기 위하여 tetraethylam-monium(TEA；Sigma, St. Louis, MO, 미국)을 사용하였고 A형 전류에 차단효과가 큰 4-aminopyridine(4-AP；RBI, Natick, MA, 미국), 전도성이 낮은 칼슘 활성화 포타슘 전류의 차단제인 apamin(Sigma) 등을 사용하였다.세포에 대한 약물적용은 중력을 이용한 관류장치를 이용하여 용기내 용액을 교환하였다. 전기생리학적 기록방법 Patch-clamp 방법은 Hamil 등 7)이 사용한 whole-cell patch clamp 기록방법을 사용하였다. 미세 유리전극 제조기(Narishige, Tokyo, 일본)를 이용하여 외경 1.5 mm의 연질 유리미세관(Chase, Norcross, GA, 미국)을 사용하여 저항이 2~3 MΩ이 되도록 기록전극을 제작하였다. 막전압 고정과 전류측정에는 patch clamp 증폭기(Axopatch 1D, Axon Instruments, Foster, CA, 미국)를 사용하였고 이 증폭기는 AD변환기(Digidata 1200, Axon Instruments)를 통하여 컴퓨터에 연결하였으며, pClamp software(Version 6.0.3, Axon Instruments)를 사용하여 실험수행의 명령과 얻어진 전기신호의 저장 및 분석에 이용하였다. 발생된 전류는 4-pole lowpass Bessel filter로 5 KHz로 여과하였고 회로의 저항은 Axopatch 1D의 보정회로를 이용하여 보정하였으며 누출전류(leak current) 감산은 시행하지 않고 pClamp program을 사용하여 교정하였다. 모든 실험은 실온에서 시행하였다. 실험자료의 분석 막전압의존성 통로의 전도도는 G＝I/(E-Erev)의 식으로 계산하였으며, 이 식에서 G는 전도도, I는 전류의 크기, E는 막전압, Erev는 역전전압을 나타낸다. 활성화 곡선 혹은 불활성화 곡선은 다음과 같은 Boltzmann의 식으로 적합시켰다. I/Imax or G/G max＝I/[1＋exp(V½-V)/k], 이 식에서 V½은 최대치의 절반값일 때의 전압치이고, k는 기울기 값을 나타낸다. 또한 활성화 시정수는 I(t)＝[1-exp(-t/ ta)]4(τa는 활성화 시정수)의 식으로 계산하였고 비활성화 시정수는 I(t)＝Ik1×exp(-t/ t1)＋Ik2×exp(-t/t2)＋Ikn×exp(-t/tn)(Ik1,2,n은 최대 전류크기, τ1,2,n은 비활성화 시정수)의 식으로 계산하였다. 모든 결과는 평균±표준오차의 형식으로 표현하였다. 결과 분리한 신경세포 Pronase와 thermolysin을 처리하여 분리한 내측 전정핵 세포에서 세포체의 크기는 매우 다양하여 직경이 10∼30 μm이었으며, 형태는 구형, 타원형, 피라미드형, 방추형 등이었다. 그리고 세포돌기는 단극, 양극, 다극성의 다양한 형태를 보였다(Fig. 1). 본 연구에서는 신경세포와 신경교세포를 신경조직염색법으로 분리하지 않았으나 다른 연구자들의 예9)10)를 참고하여 비교적 형태가 크고(15 μm 이상), 구형 및 피라미드형의 세포체를 가지고 있고 세포막이 밝게 빛나고 거칠지 않은 세포를 선택하여 전류를 기록하였다. 지연성 정류형 전류 순수한 지연성 정류형 전류를 기록하기 위하여 세포외 용액에서 Ca2＋을 Co2＋ 2 mM로 대치하여 칼슘에 의해 활성화되는 포타슘 전류를 차단 시켰고 -30 mV로 150 ms동안 전자극(prepulse)을 가함으로써 A형 전류를 불활성화 시켰다. 유지전압을 -70 mV로 하고 -30 mV의 전자극 후에 -60 mV에서부터 ＋40 mV까지 단계적으로 10 mV씩 탈분극 자극을 가하여 지연성 정류형 전류를 기록하였는데 실험에 사용한 64개의 세포 모두에서 기록되었다. 기록된 포타슘 전류는 -40∼-30 mV에서부터 활성화되기 시작하였고 10 mV의 자극전압에서 비교적 느리게 활성화(τ＝4.0∼12.4 ms) 되었으나 매우 느린 비활성화(τ＝180∼720 ms)를 보였다(Fig. 2). 이 외향 전류를 구성하는 이온을 알아보기 위하여 역전전압(reversal potential)을 구해 보았다(Fig. 3A). 막전압을 -70 mV로 고정하고 ＋30 mV의 전자극을 250 ms 동안 가하여 외향전류를 활성화한 다음 전류의 시간적 감소(tail current)를 유발하기 위하여 -110 mV부터 -60 mV까지 10 mV 단계로 100 ms동안 자극하는 double pulse protocol을 사용하였다. 외향전류를 활성화시킨 뒤 다른 막전압으로 돌아왔을 때 tail current 의 방향이 바뀌는 막전압을 역전전압이라고 하는데 본 실험에 사용한 용액([K＋]o＝3 mM)의 역전전압은 -88.5±3.7 mV로 Nernst 등식에 의해 계산된 포타슘 평형전압 -96 mV와 유사하였다. 역전전압을 이용하여 전류의 전도도를 구한 후 지연성 정류형 전류의 활성화 특성과 비활성화 특성을 조사하였다. 비활성화 특성을 얻기 위한 자극은 -95∼＋10 mV까지 15 mV씩 단계적으로 2초 동안 전자극을 가하고 시험전압을 ＋10 mV에서 150 ms 동안 자극하였다. 이렇게 기록된 전류값을 Boltzmann등식에 적합시켜 활성화 곡선과 비활성화 곡선을 얻었는데 활성화 곡선의 최대 활성화의 ½전압은 -3.1±3.4 mV였고 k값은 12.4±2.4 mV이었으며, 비활성화 곡선은 각각 -38.7±3.4 mV, 11.3±1.1 mV였다(Fig. 2). 포타슘 통로의 차단제로 알려져 있는 TEA는 A형 전류보다는 지연성 정류형 전류에 대한 차단효과가 더 큰 것으로 알려져 있다. 세포외 용액에 10 mM의 TEA를 첨가한 용액으로 관류시켰을 때 대조군에 비해 감소된 전류를 기록하였는데 억제된 전류의 부분은 전형적인 지연성 정류형 포타슘 전류의 형태를 나타냈다(Fig. 4A). A형 전류 유지전압을 -70 mV로 하고 전자극을 각각 -90 mV와 -30 mV로 가한 후 -70 mV에서 ＋40 mV까지 10 mV씩 단계적인 전압을 가하였다. A형 전류는 -90 mV의 전자극을 가하여 얻은 전류에서 -30 mV의 전자극을 가하여 얻은 전류를 감산하여 얻었는데 64개의 세포중 51개의 세포에서 기록되었다. A형 전류는 -60∼-50 mV에서 활성화를 보이기 시작했으며 지연성 정류형 전류에 비해 빠른 활성화와(10 mV：τ＝1.0∼2.3 ms) 빠른 비활성화를(10 mV：τ＝10∼60 ms) 보였다. -90 mV로 전자극을 가한 후 0 mV로 80 ms동안 자극하여 외향전류를 활성화한 다음 -110∼-70 mV까지 10 mV단계로 150 ms 동안 자극을 가하여 tail current를 기록하였다(Fig. 3B). 역전전압은 -85.6±4.9 mV였는데 이는 계산된 포타슘의 평형전압과는 약간의 차이가 있었다. A형 전류의 비활성화 곡선은 -90 mV에서 -30 mV까지 10 mV씩 280 ms동안 전자극을 가한 후 -20 mV로 200 ms 동안 시험전압을 가하여 기록된 전류를 계산하였는데 최대 비활성화의 ½전압과 k값은 각각 -58.4±3.8, 6.1±0.7 mV이었으며 활성화곡선은 각각 -22.4±4.5, 13.2±2.3 mV였다(Fig. 5). A형 전류에 대한 차단 효과가 큰 4-AP의 억제 효과를 관찰하기 위하여 10 mM의 4-AP를 첨가한 용액으로 관류시킨 후 대조군과의 차이를 구하였는데 억제된 전류의 부분은 전형적인 A형 포타슘 전류의 형태를 나타냈고 4-AP의 차단효과는 대부분 A형 전류에 국한됨을 확인하였다(Fig. 4B). 칼슘에 의해 활성화되는 전류 칼슘에 의해 활성화되는 전류를 기록하기 위하여 세포외 용액에 2 mM의 Ca2＋을 추가하였고 세포내 용액의 EGTA를 0.5 mM로 감소시킨 용액을 사용하였다. 대조군에서 기록된 외향성 전류와 비교하여 칼슘을 제거한 세포외 용액을 관류시킨 후 감소된 전류가 칼슘에 의해 활성화되는 전류이다. 기록된 칼슘 의존적 성분은 빠른 활성화와 빠른 비활성화를 보이는 일시적인(transient) 부분과 비활성화를 보이지 않는 지속적인(sustained) 부분으로 구성되었는데(Fig. 6A), 일시적인 부분은 23개의 세포 중 21개에서 기록되었으며 지속적인 부분은 23개 중 14개의 세포에서 일시적인 부분과 같이 기록되었다. 일시적인 성분은 ＋10 mV 이상의 전압에서 전압의존적인 경향을 보여 N형의 I-V곡선을 나타냈고 지속적인 부분은 전압의존적인 경향을 보이지 않았다(Fig. 6B). 활성화와 비활성화의 시간, 전압의존성 등으로 볼 때 일시적인 전류는 Ic(fast calcium activated potassium current)이고 지속적인 부분은 I AHP(after hyperpolarization current)로 생각된다. 특히 지속적인 부분은 apamin에 의해 특이적으로 차단된다고 알려져 있는데 칼슘의존성 포타슘전류의 존재를 확인한 후 apamin이 포함된 세포외 용액에서 기록한 결과 전류의 감소는 지속적 부분에 국한됨을 확인하였다(Fig. 7). 고찰 중추신경계 뉴론에는 다양한 종류의 포타슘 통로들이 존재하고 있어 흥분 발사율의 형태와 세포막의 흥분성 조절에 중요한 역할을 담당하고 있다. 종래의 연구에서는 전정핵 뉴론에 존재하는 통로의 종류와 역할을 세포내 기록법으로 이온통로 차단제를 이용하여 유추한 결과 지연성 정류형 전류, A형 전류, 칼슘에 활성화되는 전류, 내향성 전류 등이 존재함이 보고되었다.5)6) 본 실험에서는 이러한 전류를 막전압고정법을 이용하여 내측 전정핵 뉴론에 존재하는 이온통로의 종류와 전기생리학적, 약리학적 특성을 조사하였다. 이 연구에서 분리된 신경세포의 세포체 크기는 10~35 μm로 다양하였고 세포돌기가 단극, 양극, 다극성의 형태를 보이거나 혹은 돌기가 절단된 상태였으며 세포체의 모양도 구형, 타원형, 피라미드형 및 방추형 등 다양하였다. 이는 세포체의 크기에 있어서 신경세포 염색 후 camera lucida drawing으로 확인한 결과 내측 전정핵 뉴론이 20.5±5.3 μm의 크기를 보인다는 Suarez 등9)의 연구와 유사하였다. Desmadryl 등10)은 전정신경절에서 neurofilament와 calretinin을 사용한 면역화학법을 이용하여 신경세포를 염색한 결과 신경세포는 구형의 세포체를 가지고 있고 세포직경이 크고 몇 개의 세포돌기를 보유하고 있어 크기가 작고 방추형인 신경교세포와 구분된다고 하였다. 따라서 본 연구에서는 세포염색법에 의해서 신경세포를 구분하지는 않았지만 여러 연구자들의 보고를 토대로 구형, 타원형 및 피라미드형 세포체를 가지고 크기가 15 μm이상인 세포를 선택하여 실험에 사용하였다. 실험결과 지연성 정류형 전류(IK), A형전류(IA), 빠른 활성화를 보이는 칼슘 의존성 포타슘전류(IC), 느린 활성화를 보이는 칼슘의존성 전류(IAHP) 등의 전류가 기록되었다. 칼슘이 포함되지 않은 용액을 사용하고 탈분극 자극을 가하여 얻은 포타슘 전류들은 전자극을 이용하거나 통로차단제를 이용하여 확인한 결과 대부분 일과성 부분과 지속성 부분을 함께 가지고 있는 것으로 보이며 이들은 각각 A형 전류와 지연성 정류형 전류로 생각된다. 지연성 정류형 전류의 활성화는 다른 뉴론 11)에서 보고된 바와 유사하여 -30 mV에서 활성화되기 시작하였고 최대 크기의 절반값은 -3 mV에서 나타났다. 또한 지연성 정류형 전류의 불활성화의 시정수는 본 실험에서 400 ms 정도의 시정수를 보였으나, 이것은 1∼2 초의 값을 보인 다른 연구12)와 전혀 불활성화를 보이지 않은 Kostyuk11)의 보고와는 차이가 있었다. 그러나 본 연구에서도 불활성화를 조사한 2개의 세포에서 전혀 불활성화가 되지 않는 특징을 가진 세포가 기록되기도 하였다. 10 mM의 TEA와 4-AP를 이용하여 포타슘 전류의 억제 정도를 알아본 실험에서 TEA는 A형 전류보다는 지연성 정류형 전류에 억제정도가 현저하였고 4-AP는 A형 전류에 선택적으로 작용함을 확인하였는데 이는 Segal과 Baker12), Thomson13) 등의 보고와 일치하였다. 지연성 정류형 전류는 자극에 의해 탈분극된 막전압을 재분극시켜 활동전압을 끝마치게 하는데 관여하는 것으로 알려져 있고, A형 전류는 일반적으로 신경세포의 흥분빈도를 낮추어 주는데 기여하는 것으로 알려져 있다.14) 즉 활동전압의 재분극시에 신경세포의 막전압이 과분극되면 A형 전류를 활성화시키고 Na＋이나 Ca2＋의 유입에 의한 막전압의 저분극화를 상쇄시켜 낮은 빈도의 흥분을 유발하는 것으로 생각된다. 이 실험 결과(Fig. 5)에서도 A형 전류 통로는 작은 과분극에 의해서 비활성화 상태에서 벗어날 수 있고 약간의 탈분극 자극에 의해서도 활성화되는 특징을 가지고 있는데 이러한 특징이 전술한 A형 전류의 기능과 관계가 있다. Numann 등15)은 해마세포에서 A형 전류의 활성화와 비활성화 특징을 조사하였는데 세포외 용액에 Co2＋가 포함된 용액으로 기록시 전압의존적 곡선이 양(＋)의 방향으로 이동됨을 보고하여 본 실험에서 기록된 값은 세포외 Co2＋에 의해 영향을 받았을 가능성을 배제할 수 없었다. Ca2+에 의해 활성화되는 전류는 활성화되는 시간에 따라 크게 빠른 활성화와 빠른 비활성화를 보이는 형(IC)과 느린 활성화를 보이고 비활성화를 보이지 않는 형(IAHP)으로 구분된다.16) 빠르게 활성화되는 칼슘의존적 전류는 해마 신경세포와 근육세포17) 등에서 보고되었고 느리게 활성화되는 전류는 상피세포, 척추동물의 뉴론18) 등에서 관찰되었다. 내측 전정핵 뉴론에서는 모양체 신경절 뉴론과 교감신경절 뉴론19)에서 보여준 바와 같이 두 가지 유형이 공존하는 것이 확인되었다(Fig. 6A). 이 두 가지 전류는 활성화의 차이뿐만 아니라 전압의존적 경향에서도 차이를 보이는데 I C형은 전압의존성을 보이고 I AHP는 전압의존성을 보이지 않는다. Retzius 세포에서 기록된 빠른 활성화를 보이는 전류는 전류전압 관계에서 N형의 모양을 보이는데20) 이러한 I-V곡선에서의 음성경사(negative slope)는 칼슘이온의 세포내 유입의 감소 때문에 나타나는 현상으로 이는 막전압이 Ca2＋의 역전전압 쪽으로 접근하면서 발생한다. 이 실험에서도 IC는 ＋20 mV 이상의 막전압에서는 전압의존적인 전류의 감소를 관찰하였고, I AHP는 전압의존성이 없었다(Figs. 6B and 7). Johnston 등6)은 내측 전정핵 세포에서 세포내 기록법으로 Ca2＋ 농도에 영향을 받는 전류에는 apamin에 민감한 전류와 apamin에 민감하지 않은 전류가 존재 함을 확인하였는데 전자는 I C에 해당되고(Fig. 6) 후자는 I AHP에 해당된다(Figs. 6 and 7). 본 연구에서는 효소처리에 의하여 급속분리된 내측 전정핵 뉴론에서 전압고정법을 이용하여 포타슘전류의 종류 및 전기생리학적 특징을 규명하였으며 차후에 전정반사 및 전정기관의 가소성에 관여하는 내측 전정핵의 기능을 보다 정확하게 이해하기 위하여 전류고정법을 병행하여 각각의 전류들이 내측 전정핵 뉴론에서 어떠한 역할을 하고 있는지 확인하는 연구가 시행되어야 할 것으로 생각된다. 결론 Pronase와 thermolysin으로 처리한 흰쥐의 내측 전정핵에서 신경세포를 분리하여 whole cell patch clamp 방법으로 세포의 포타슘전류를 기록, 분석하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 지연성 정류형 전류의 활성화 특성은 최대 활성화의 절반전압(V½)이 -3 mV, slope factor는 12 mV였고 비활성화 특성은 각각 -38 mV, 11 mV였으며 발생된 전류는 TEA에 의하여 민감하게 감소되었다. A형전류는 지연성 정류형에 비해 빠른 활성화와 빠른 비활성화를 보였고 활성화 특성은 각각 -22 mV, 13 mV, 비활성화 특성은 -58 mV, 6.1 mV였으며 4-AP에 의해 거의 모두 억제되었다. 칼슘에 의해 활성화되는 전류는 전압의존성을 보이는 빠르게 활성화되는 전류(IC)와 전압의존성이 없는 느리게 활성화되는 전류(IAHP)가 기록되었으며 후자는 apamin에 의해 선택적으로 차단되었다. 이상의 실험결과는 내측 전정핵 뉴론에 다양한 종류의 포타슘통로들이 존재함을 확인하였으며, 이는 내측 전정핵 뉴론의 내재적 막특성과 흥분성 조절에 관여하리라 사료된다.
REFERENCES
1) Smith PF, Curthoy IS. Mechanisms of recovery following unilateral labyrinthectomy: A review. Brain Res Rev 1989;14:155-80. 2) Llinas R, Muhlethaler M. An electrophysiological study of the in vitro, perfused brainstem-cerebellum of adult guinea-pig. J Physiol 1988;404:215-40. 3) Dalington CL, Smith PF. The recovery of static vestibular function following peripheral vestibular lesions in mammals: The intrinsic mechanism hypothesis. J Vestibular Res 1996;6:185-201. 4) Gallagher JP, Lewis MR, Shinnick-Gallagher P. An electrophysiological investigation of the rat medial vestibular nucleus in vitro In: Contemporary Sensory Neurobiology, Eds Correia MJ & Perachio AA, New York;1985. p.293-304. 5) Serafin M, De Waele C, Khateb A, Vidal PP, Muhlethaler M. Medial vestibular nucleus in the guinea-pig. II. Ionic basis of the intrinsic membrane properties in brainstem slices. Exp Brain Res 1991;84:426-33. 6) Johnston AR, MacLeod NK, Dutia MS. Ionic conductances contributing to spike repolarization and afterpotential in rat medial vestibular nucleus neurons. J Physiol (Lond) 1994;481:61-77. 7) Hamil OP, Marty A, Neher E, Sakman B, Sigworth F. Improved patch clamp techniques for high resolution current recording from cells and cell free membrane patches. Pflug Arch 1981;391:85-100. 8) Kay Wong. Isolation of neurons suitable for patch-clamping from adult mammalian central nervous systems. J Neurosci Meth 1986;16:227-38. 9) Suarez C, Rey CG, Tolivia J, Llorente JL, Gomez J. Morphometric analysis of the vestibular complex in the rat. Laryngoscope 1993;103:762-73. 10) Desmadryl G, Chambard JM, Valmier J, Sans A. Multiple voltage dependent calcium currents in acutely isolated mouse vestibular neurons. Neuroscience 1997;78:511-22. 11) Kostyuk PG, Veselovsky VS, Fedulova SA, Tysndrenko AY. Ionic currents in the somatic membrane of rat dorsal root ganglion neurons. III. Potassium currents. Neuroscience 1981;6:2439-44. 12) Segal M, Barker JL. Rat hippocampal neurons in culture potassium conductances. J Neurophysiol 1984;51:1409-33. 13) Thompson SH. Three pharmacologically distinct potassium channels in molluscan neurones. J Physiol (Lond) 1977;265:465-88. 14) Hille B. Ionic Channels of Excitable Membrane. 2nd edn, Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts;1992. p.1-607. 15) Numann RE, Wadman WJ, Wong RKS. Outward currents of single hippocampal cells obtained from the adult guinea-pig. J Physiol (Lond) 1987;393:331-53. 16) Cook NS. Potassium channels. John Wiley & Sons;1990. p.348-81. 17) Salkoff L. Drosophila mutants reveal two components of fast outward current. Nature 1983;302:249-51. 18) Goh JW, Kelly MEM, Pennefather PS, Chicchi GG, Cascieri MA, Garcia ML, et al. Effect of charybdotoxin and leiurotoxin I on potassium currents in bull frog sympathetic ganglion and hippocampal neurons. Brain Res 1992;591:165-70. 19) Miyazaki T, Dun NJ, Kobayashi H, Tosaka T. Voltage-dependence potassium currents of sympathetic preganglionic neurons in neonatal rat spinal cord thin slices. Brain Res 1996;743:1-10. 20) Stewart RR, Nicholls JG, Adams WB. Na ＋, K ＋ and Ca 2＋ currents in identified leech neurones in culture. J Exp Biol 1989;141:1-20.