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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1999;42(9): 1093-1097. |
| Ciliary Beat Frequency of Middle Ear, Eustachian Tube and Other Upper Respiratory Tract in Mice. |
| Ha Won Jung, Seung Ha Oh, Won Seok Yu, Kang Soo Lee, Ji Hun Mo, Sang Jun Jeon, In Sang Kim, Chong Sun Kim |
| Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery Seoul National University College of Medicine, Seoul, Korea. shaoh@plaza.snu.ac.kr |
| 생쥐 중이와 상기도 점막의 섬모세포운동 |
| 정하원 · 오승하 · 유원석 · 이강수 · 모지훈 · 전상준 · 김인상 · 김종선 |
| 서울대학교 의과대학 이비인후과학교실 |
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| 주제어:
생쥐ㆍ섬모운동ㆍ섬모길이. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
The aim of this study is to analyze ciliary beat frequency (CBF)and ciliary morphology of the middle ear bulla and the upper respiratory tract in mice.
MATERIALS AND METHODS:
Fifteen mice with 37-42 gram weight were dissected and specimens were taken from the middle ear bulla, the eustachian tube, the inferior turbinate, the nasopharynx, and the upper trachea. The CBF of each specimen was measured using a video-computerized analysis system and the morphology of cilia was also studied using scanning electron microscopy (SEM).
RESULTS:
The measured CBF ranged from 9.38 Hz to 13.59 Hz, and there were no significant differences in the CBF values among the middle ear bulla, the eustachian tube, the inferior turbinate and the nasopharynx, except for the upper trachea. The mean CBF value of the upper trachea was 11.6 Hz, which was significantly lower than those of other parts.
SEM showed that the cilia of the upper tracheal region were shorter than those of other parts.
CONCLUSION:
The CBF value of the middle ear bulla is similar to those of other parts in the upper respiratory tract except for the upper trachea. In the upper trachea, the CBF is lower and ciliary lenghth of epithelium is shorter than those of other parts. |
| Keywords:
Ciliary beat frequencyㆍCiliaㆍMouseㆍScanning electron microscopy |
서론
포유류의 호흡기 점막은 섬모세포, 무섬모세포, 기저세포, 배세포 등으로 구성되어 있으며 섬모세포의 표면에는 250∼300개의 섬모가 존재한다. 섬모의 운동은 이물질을 제거하는 인체 점막의 중요한 방어기전 중의 하나이다. 이러한 점액섬모기능의 장애는 호흡기질환, 중이염 및 부비동염 등의 원인이 될 수 있다.1)2)
점액섬모기능의 연구에는 사카린 또는 방사선동위원소를 이용하는 방법 등이 이용되지만 점액의 여러 다른 특성이 점액섬모기능에 복합적으로 영향을 주어서 결과의 해석이 어려웠다. 점액의 특성을 배제한 섬모만의 운동성을 연구하는 방법으로 최근에는 시각적인 방법, 스트로보스코프를 이용하는 방법, 영상을 이용하는 방법, 광전기적인 방법 등을 통하여 CBF(ciliary beat frequency, 섬모운동횟수)를 측정함으로써 섬모의 운동성을 평가하는 방법들이 사용되고 있다.
본 연구는 본 교실에서 개발한 Video computerized analysis system3)을 이용한 영상조작법(Image processing)을 사용하여 생쥐의 중이 및 이관 점막의 CBF를 측정하였으며 이를 다른 상기도 점막의 CBF와 비교하였다. 생쥐는 실험동물로서 흔하게 이용되어지면서도 그동안 생쥐의 중이 및 이관의 섬모운동에 대한 연구가 미비했었다. 이 연구에서는 생쥐의 중이 및 이관과 다른 상기도 부위의 CBF 정상치를 구하여 향후 생쥐를 이용하여 점액섬모운동을 연구하는 여타 실험에서 참조되어질 수 있도록 하고, 생쥐의 부위에 따른 상기도의 섬모운동의 특성을 알아보고자 하였다. 특히, 생쥐 중이 및 이관의 섬모 형태 및 운동의 특성을 다른 상기도 부위와 비교함으로써 중이 질환의 발생에 관계하는 요인 중 하나인 중이 및 이관의 섬모운동에 대하여 고찰해 보고자 하였다.
재료 및 방법
실험동물
체 중 37∼42 g(평균 40 g)의 Preyer반사가 양성인 건강한 Sprague-Dawley 생쥐 15마리를 대상으로 하였으며, 이들은 실험 전에 일정한 사료와 환경 하에서 1주일동안 사육한 후 사용하였다. 생쥐를 각각 100 mg/kg의 Xylazine과 125 mg/kg의 sodum pentothal을 복강주사하여 마취한 후, 현미경을 이용한 미세수술로 중이(bulla), 이관, 하비갑개, 비인두 및 상부 기관의 다섯 부위에서 조직을 채취하였다. 중이의 경우 섬모가 있는 점막이 부분적으로 존재하므로 되도록 넓은 부위를 여러 곳에서 채취하여 섬모가 있는 부위가 포함되도록 하였다. 한편, 중이에 저류액을 보이거나 중이점막이 비후한 생쥐는 실험대상에서 제외하였다.
조직처리
채취된 조직은 항생제(ampicillin)가 포함된 생리식염수로 여러번 세척하여 점액층을 제거한 후 Dulbecoo's modified Eagle's medium-Ham's nutrient F12(DHEM-F12；Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)media가 채워진 측정용기(Falcon(r), Becton Dickinon Labware, US, 직경 35 mm)에 넣고, 37℃ CO2 배양기에 30분 이상 거치시켜 안정화시켰다. 측정용기는 바닥에 현미경관찰용 커버글라스를 부착하여 1000배의 시야에서 섬모의 움직임을 관찰할 수 있게 하였다. 조직 관찰시 채취조직의 움직임을 막기 위하여 조직은 백금선 조각으로 눌러 측정용기의 중앙에 움직이지 않도록 고정시켰다.
전자현미경 관찰을 위한 조직은 CBF 측정시와 같은 미세조작으로 채취한 후 항생제(ampicillin)가 포함된 생리식염수를 이용하여 점액층을 제거한 후 1% glutaraldehyde 고정액으로 고정하였다.
주사전자현미경 검사
채취한 각 부위의 점막을 2.5% glutaraldehyde 용액(0.1 M phosphate buffer, pH 7.4)에 4℃에서 2시간 동안 전고정한 후 0.1 M phosphate buffer로 3회 세척하였다. 그 후 1% OsO4 용액(0.1 M phosphate buffer, pH 7.4)으로 실온에서 2시간 후고정하였고 다시 0.1 M phosphate buffer로 3회 세척후 50%에서 100% ethanol로 단계적으로 탈수시켰다. 이후 isoamyl acetate로 치환하고 액화 CO2 임계점 건조기(Bio-rad(r))를 이용하여 건조시켰다. 이렇게 처리한 조직을 silver paster로 시료대에 접착 고정시켰고 ion coater(Bio-rad(r))를 이용하여 gold palladium을 금속중착시킨 후 주사전자 현미경(Jeol(r)JSM-820)으로 관찰하였다.
각각 600배와 3,000배의 전자현미경 시야에서 사진을 촬영하였으며, 전자현미경 사진 중 각 부위에서 상태가 양호하면서 길이를 재기에 적합하도록 전체 섬모길이가 노출되고 비교적 구부러짐이 없는 10개의 섬모를 선택하여 길이를 측정하고 평균을 구하였다.
섬모운동횟수 측정
조직을 37℃ CO2 배양기에 30분 이상 거치시킨 다음 가열용기로 옮겨, 100배 시야의 도립현미경으로 보아 섬모운동이 가장 활발한 부위를 포착하였고 Digistar(r)CCD camera(Xomed, Jackson Ville, Florida, USA)를 통하여 영상을 모니터로 출력시킨 후 video tape recorder로 녹화하였다. 다음 활발한 섬모운동을 가진 하나의 세포를 포함하도록 일정한 부위를 선택하였다. 선택된 부위의 섬모운동은 규칙적인 빛의 진동에 의한 신호를 변화시켰으며 이 변화는 증폭과정을 거쳐 CCD를 통하여 national television system committe(NTSC)analog signal로 전환되었고 이는 다음 과정에서 다시 컴퓨터에 의해 디지털화 되었다. 이렇게 디지털화된 신호를 fast fourier transformation(FFT)에 의해 분석하였다. 측정은 가장 활발한 섬모운동을 보이는 세포에서 측정하였으며, 각각의 조직마다 서로 다른 다섯 측정 시야에서 CBF를 측정하여 이의 평균을 구하였다.
결과분석
생쥐의 중이 및 기도점막섬모상피의 부위에 따른 CBF의 차이는 분산분석법(ANOVA)을 이용하여 분석하였다(SAS release 6.11).
결과
주사전자현미경 소견
중이, 이관, 하비갑개 및 비인두의 섬모상피세포의 모양과 분포는 별다른 차이를 보이지 않았으나(Fig. 1), 상부 기관의 점막은 다른 부위에 비해 섬모로 덮여있지 않은 원주상피세포(nonciliated columnar epithelium)의 분포가 다른 부위에 비하여 월등히 높았다(Fig. 2).
섬모운동횟수와 섬모의 길이
생 쥐의 조직에서 CBF는 11.6∼13.2 Hz의 값을 보였고, 중이, 이관, 하비갑개, 비인두, 상부 기관은 각각 12.7±0.57 Hz, 12.7±0.77 Hz, 12.6±0.62 Hz, 13.2±0.37 Hz, 11.6 ±0.79 Hz의 값을 보였다. 중이, 이관, 하비갑개, 비인두의 CBF는 서로간에 통계적으로 유의한 차이가 없었으며, 상부 기관의 CBF만이 11.6±0.79 Hz로 다른 부위에 비해 통계적으로 의미있게 낮은 값을 보였다( p<0.0001)(Fig. 3).
섬모의 길이는 중이, 이관, 하비갑개, 비인두, 상부 기관 각각 3.84±0.58 μm, 2.13±0.51 μm, 2.88±0.33 μm, 3.41±0.50 μm, 1.47±0.16 μm의 값을 보였으며, 상부 기관의 섬모길이가 상기도의 다른 부위에 비해 비교적 짧았다(Fig. 4).
고찰
섬모의 구조는 원생동물에서부터 인간까지 모두 단면상 9개의 이중말초미사(double peripheral filaments)와 2개 의 중심미사를 가진 9＋2 구조의 동일한 구조를 가지고 있다.4)포유류의 전형적인 섬모원주상피세포는 세포 첨부에 약 250∼300개의 섬모를 가지고 있지만, 섬모화된 세포의 분포는 해부학적인 위치에 따라 달라진다.
그동안 이러한 섬모기능의 연구를 위하여 섬모운동을 정량적으로 측정하기 위한 여러 가지 방법이 사용되어 왔으나, 정확성이 떨어지거나, 같은 부위를 지속적으로 관찰할 수 없거나, 개별 세포의 섬모운동을 나타낼 수 없거나, 또는 관찰자의 주관적인 요소가 작용하는 등의 문제점들이 있었다.3)본 교실에서 개발한 Video computerized analysis system은 하나의 섬모세포를 선택하여 지속적으로 관찰하여 신호를 디지털화하고 컴퓨터에 의해 분석함으로써 개별적인 세포의 섬모운동을 객관적이고, 정량적으로 측정할 수 있는 장점을 가지고 있다.3)
실험시 섬모의 운동은 pH, 온도, 물리적인 자극 등 여러 가지 변수에 의해 영향을 받으므로 일정한 변수를 유지하여야 측정치의 실험적 반복성을 유지할 수 있다. 본 연구에서는 용액의 pH를 7.3 또는 7.4로 유지하였으며 특별히 고안된 가열용기를 이용하여 실험하는 동안 내내 37℃의 온도를 유지하였다.
연 구대상으로서의 생쥐는 이관이 단순한 구멍인 기니픽과 달리 이관이 발달되어 있어서 중이 및 이관의 섬모운동의 연구에 적합하다. 현재까지 영상조작법을 이용하여 측정한 생쥐의 중이와 이관의 섬모운동은 아직 보고된 바 없다. 생쥐 중이점막의 평균 CBF는 12.7±0.57 Hz로 이관, 하비갑개 및 비인강의 CBF와 비슷한 섬모운동을 보였다(Fig. 1). 다만 생쥐의 중이 점막에서의 섬모운동은 이관, 하비갑개 및 비인강에 비해 활발하여 CBF를 측정할 점막을 비교적 쉽게 관찰할 수 있었다. 이는 백서의 경우 중이의 일부분인 2개의 경로만이 섬모로 덮여있다고 알려져 있듯이 동물의 종에 따라 섬모가 있는 점막이 부분적인 것을 의미한다.5)생 쥐 상부 기관의 평균 CBF는 11.6±0.79 Hz로 다른 상기도 부위에 비해 의미있게 감소된 결과를 보였는데(Fig. 3), 이는 사람에서의 CBF가 비강과 기관지에서 14.0 Hz이고 세기관지로 내려가면 10.3 Hz까지 떨어진다고 알려진 바와 같이 기도의 하부로 갈수록 CBF가 감소함을 알 수 있다.6)Joki와 Saano는 여러 포유동물의 상기도에서 광전기적인 방법(photoelectric method)을 이용하여 CBF를 측정하였는데 CBF는 11.3 Hz에서 16.9 Hz의 분포를 보였고 종별로 별다른 차이를 보이지 않았으나 대체로 하기도보다는 상기도에서 더 높은 섬모운동을 보였다.7)
생쥐 상기도에서의 섬모의 길이는 중이점막이 가장 길어서 평균 3.84±0.58 μm의 값을 보였으며 상부기관이 1.47 ±0.16 μm로 가장 낮은 값을 보였는데 이는 사람 또는 다른 동물에서의 실험에서 상기도에서 하부기관으로 갈수록 섬모의 길이가 짧아지는 것과 유사한 결과를 보여준다(Fig. 4).8)CBF와 섬모 길이와의 관계는 대체로 상관이 있을 것으로 여겨지나 Morgan 등은 CBF와 섬모의 길이와의 연구에서 연관이 없다고 보고하였다.9)점액섬모청소율(mucociliary clearance)은 CBF의 변화를 포함한 섬모상피세포의 손실, 섬모의 구조적인 변화, 점액이나 섬모주위 유동액의 양 또는 질적인 변화 등의 여러 가지 인자에 의해 영항을 받는다.10)이러한 여러 요소가 점액섬모청소율을 결정하며 CBF와 점액섬모청소율이 직접적인 선형적인 연관은 없을지라도11)CBF의 저하는 점액섬모청소율의 감소의 한 원인으로 여겨진다.
생쥐에서의 섬모상피세포의 분포는 중이와 이관에서는 서로간에 뚜렷한 차이를 보이지 않았으며, 상부 기관에 이르러 현저히 감소됨을 관찰할 수 있었다(Figs. 1 and 2). 이는 기니픽과 백서를 대상으로 한 다른 연구에서 기관내에서 하부 기관 점막으로 이행할수록 섬모세포가 줄어드는 것과 비슷한 소견이다.12)13)
결론
생쥐 상기도 점막의 CBF는 11.6±0.79 Hz에서 13.2±0.37 Hz의 분포를 보였다. 중이, 이관, 하비갑개, 비인두에서의 CBF는 비슷한 값을 보였으며, 상부 기관에서만 다른 부위에 비하여 통계적으로 유의하게 낮은 값을 보였다. 섬모의 길이는 1.47±0.16 μm에서 3.84±0.58 μm의 분포를 보였으며, 상부 기관의 섬모의 길이가 다른 부위에 비해 짧았고 섬모상피의 분포도 적었다.
위의 결과는 생쥐의 상기도내에서 상부 기관을 경계로 섬모의 길이와 섬모상피의 분포에 뚜렷한 감소가 일어남을 보여준다. 또한 위의 결과에서 중이 점막은 상부 기관을 제외한 다른 상기도의 점막과 구조적, 기능적으로 비슷한 점액섬모운동의 특성을 보여, 여러 상기도질환에서 점액섬모운동의 변화를 일으키는 인자들이 중이내 점액섬모운동에도 비슷한 변화를 일으킬 것으로 추정할 수 있으며, 상기도질환에서 중이의 병적 변화가 상기도의 병적 변화와 밀접하게 연관되어 나타날 수 있음을 시사한다.
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