Effect of Antioxidants on the Toxicity of Oxygen Radicals to the Cultured Mouse Schwann Cells in vitro.

Jang, Chul Ho; Choi, Tae Wook; Kim, Jin Ok; Kwak, Kee Yong; Song, Yong Chang; Park, Seung Taeck

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery > Volume 42(10); 1999 > Article

Original Article

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1999;42(10): 1213-1217.

Effect of Antioxidants on the Toxicity of Oxygen Radicals to the Cultured Mouse Schwann Cells in vitro.

Chul Ho Jang, Tae Wook Choi, Jin Ok Kim, Kee Yong Kwak, Yong Chang Song, Seung Taeck Park

¹Department of Otolaryngology, Wonkwang Medical School, Iksan, Korea.chul@wonnms.wonkwang.ac.kr
²Department of Anatomy, Wonkwang Medical School, Iksan, Korea.

배양된 생쥐 슈반세포에서 산소유리기의 독성과 항산화제의 영향

장철호¹ · 최태욱¹ · 김진옥¹ · 곽기용¹ · 송영창¹ · 박승택²

원광대학교 의과대학 이비인후과학교실1;해부학교실2;

주제어: 배양된 슈반세포ㆍ산소자유기ㆍ항산화제.

ABSTRACT

BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Oxygen radical scavengers and inhibitors are known to have protective functions (or roles) against hypoxia and noise exposure in the cochlea and brain. The purpose of this study was to examine the toxic effect of oxygen radicals (xanthine oxidase and hypoxanthine) on cultured mouse facial nerve Schwann cells, and determine if antioxidants (TPEN and DFO) might ptotect Schwann cells from oxidant-induced neurotoxicity.
MATERIALS AND METHODS:
Dissociated cell cultures were prepared from the facial nerve of a mouse. After dissociation of Schwann cells, isolated cells were washed, resuspended in feeding medium, and plated onto poly-L-lysine-coated Aclar plastic cover slips (12 mm diameter) in petri dishes or in 96 well multichambers at cell density of 2X105 ceIls/coverslip or lX10(5) ceIls/we11. The feeding medium consisted of Eagle's minimum essential medium (MEM) containing 5% horse serum, 5 mg/ml D-glucose, and 25 ng/ml gentamicin. Cultures were grown in 5% CO2/95% atmosphere at 37degreesC, and the medium was renewed twice a week. Cultures grown for 4-5 days were utilized for experiments. Oxygen radical exposure was done using XO and HX, and antioxidant pretreatment was carried out using tetrakis (2-pyridylmethyl) ethylenediamine (TPEN) and desferrioxamine (DFO). Cytotoxicity assay was performed by MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide cytotoxic assay and inverted microscopy.
RESULTS:
Cell viability of cultured mouse Schwann cells treated with markedly decreased in a dose-dependent manner. Cultured mouse Schwann cells exposed to XO/HX for 4 hours showed degenerative changes such as the decrease of cell number and process. Pretreatment of 80 uM TPEN for 2 hours increased remarkably the cell viability of cultured Schwann cells exposed to 20 mU/ml XO/0.1 mM HX, while DFO did not show any protective effects on oxidant-induced neurotoxicity in these cultures.
CONCLUSION:
It is suggested that oxygen radicals induce neurotoxic effect on cultured mouse Schwann cells, and that selective antioxidants such as TPEN is very effective in blocking oxidant-induced neurotoxicity.

Keywords: Cultured Schwann cellsㆍOxygen radicalㆍAntioxidant

서론 산소유리기(oxygen radical)는 산소의 불완전한 환원으로 생성되는 산소산물로써 신경세포 및 다양한 세포에 손상을 주며 체내에서는 이를 제거하기 위해 superoxide dismutase같은 효소들이 생산되는데 이 제거체계의 능력을 넘어 과생산 되는 경우 여러 가지 기전을 통한 세포 손상을 일으킨다. 최근의 연구에서 산소유리기는 흥분성아미노산(excitotoxic amino acid)의 분비촉진이나 세포내의 칼슘농도의 증가와 같은 현상을 유발시킴으로써 세포를 손상 또는 사멸시킨다고 한다. 또한 산소유리기와 질소유리기와 같은 유리기들은 서로 공동으로 작용함으로써 독성이 강한 peroxynitrite라는 물질을 생성하여 그 결과 신경세포의 손상을 일으키고 철이온들과 작용하여 산소유리기의 생성을 촉진시킨다고 한다.1)2) 이과영역에서 뇌조직과 와우조직에서 허혈, 소음성난청 등에 관련된 산소유리기에 대한 연구들3-5)이 이루어지고 있으나 안면신경의 변성후 재생에 중요한 슈반세포에 관한 연구는 드문 편이다. 본 연구는 산소유리기의 산화적 손상에 대한 안면신경 슈반세포의 신경독성의 기전 규명과 이에 대한 치료적 접근을 하기 위하여 배양한 생쥐의 슈반세포를 산소유리기에 노출시킨 다음 산소유리기에 의한 신경독성 효과를 분석하고 또한 산소유리기의 독성효과에 대한 항산화제인 TPEN(tetrakis(2-pyridylmethyl)ethylenediamine)과 DFO(desferrioxamine)의 방어효과를 조사하였다. 재료 및 방법 세포 배양과 약제의 처치 실험동물로는 생후 3일째된 CD-1계통의 생쥐를 사용하였다. 본 실험에 사용된 약제들인 xanthine oxidase(XO), hypoxanthine(HX), DFO 및 TPEN은 Sigma사(St. Lowis, USA)에서 구입하였으며, 이들 약제들을 증류수에 용해하여 각각 일정농도의 저장액을 만들어 냉암소에 저장한 다음 필요시 최종농도로 희석하여 배양액에 직접 넣어 사용하였다. 슈반세포의 분리를 위하여 생쥐의 안면신경을 고실분지에서 채취하여 0.25% trypsin용액으로 처리한 후 37℃에서 5% CO2/95% air로 조절된 항온기내에서 일정시간 배양하였다. 이같이 처리한 신경세포는 Eagle's minimum essential medium(EMEM, Gipco)으로 3∼4회 수세한 다음 800 g에서 10분간 원침시킨후 poly-L-lysine(Sigma)으로 전 처치된 96-multiwell 배양용기에 도입하였다. 도입한 세포는 항온기내에서 5일 동안 배양하였으며 이때 배양액은 EMEM에 10% fetal bovine serum을 넣어 사용하였다. 배양중인 슈반세포를 여러 농도의 XO와 HX가 포함된 배양액 내에서 4시간 동안 배양한 후 산소유리기가 슈반세포에 미치는 독성효과를 조사하였다. 또한 항산화제의 처리는 실험직전까지 배양한 슈반세포를 산소유리기에 노출시키기 2시간 전에 여러 농도의 TPEN이나 DFO가 포함된 배양액에서 세포를 배양한 후 이를 다시 XO/HX에 4시간 노출시킨 다음 산소유리기의 독성에 대한 항산화제의 영향을 조사하였다. 세포독성 및 방어효과 검정을 위하여 세포생존률 분석과 형태학적 관찰을 시행하였다. 세포의 생존률 분석 세포생존률 분석은 배양 슈반세포에 여러 농도의 XO/HX를 처리한 후 산소유리기가 슈반세포에 미치는 독성효과 및 산소유리기에 대한 항산화제의 신경방어 효과를 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylte-trazolium bromide) assay법에 의하여 분석하였다. MTT assay는 Mosmann의 6) 방법에 따라 5∼40 mU/mlXO와 HX가 포함된 배양액에서 세포를 1∼6시간 동안 각각 배양한 것이나, XO/HX에 세포를 처리하기 2시간 전에 20∼80 uM TPEN 및 30∼120 uM DFO로 전처리하여 배양이 완료된 세포를 PBS로 서너번 세척후 실험 전날 제조한 50 mg/ml의 MTT의 저장액을 희석 처리하여 반응시킨 다음 spectrophotometer로 570 nm에서 6번의 흡광도 측정치를 평균하였다. 형태학적 관찰 형태학적인 관찰은 세포를 배양중인 용기를 직접 도립위상차현미경(Nikon)하에 놓고 검경하였으며 필요시 부착된 사진기로 촬영하였다. 실험결과의 통계학적 유의성 검정은 ANOVA검정후 Student's t-test에 의하여 조사하였으며 P-value가 0.05이하일 경우에 유의한 것으로 판정하였다. 결과 XO/HX의 세포독성 XO가 5∼40 mU/ml의 농도로 각각 포함된 배양액에서 슈반세포를 4시간 동안 노출시킨후 MTT assay에 의하여 세포의 생존율을 분석한 결과 5 mu/ml와 10 mU/ml XO를 처리한 경우 대조군(100%)에 비하여 각각 78%와 64%로 나타났으며 20 mU/ml XO에서는 49%(p<0.05)로 나타났다. 또한 40 mU/ml에서는 26%(p<0.05)으로 나타났다(Fig. 1). 시간의 변화에 따른 XO/HX의 영향을 분석하기 위하여 20 mU/ml XO와 0.1 mM HX를 혼합한 배양액에서 신경세포를 1∼6시간 동안 배양한 결과 세포의 생존율은 1시간 배양에서는 대조군(100%)에 비하여 79%로 나타났으나 2 시간과 4시간 배양에서는 각각 75%와 51%(p<0.05)로 나타났다. 또한 6시간 배양에서는 43%(p<0.05)로 나타났다(Fig. 2). 항산화제의 방어효과 배양 슈반세포를 20 mU/ml XO/ 0.1 mM HX에 노출시키기 2시간 전에 항산화제인 DFO와 TPEN이 각각 여러 농도로 포함된 배양액에서 처리한 다음 이의 영향을 MTT assay에 의하여 조사한 결과 XO/HX만 처리한 경우 세포의 생존율은 대조군(100%)에 비하여 47%(p<0.05)로 나타난 반면 20 uM TPEN처리에 있어서는 61%로 나타났으며 40 uM처리에 있어서는 73%로 나타났다. 특히 80 uM의 처리에 있어서는 XO/HX만의 처리에 비하여 82%(p<0.05)로 높은 생존율을 나타냈다(Fig. 3). 반면 DFO를 처리한 경우 세포의 생존율은 XO/HX만의 처리에 있어서는 대조군(100%)에 비하여 38%(p<0.05)로 나타났으며 30 uM DFO에서는 42%(p<0.05)로 나타났다. 또한 60과 120 uM의 DFO처리 경우 각각 53% p<0.05)와 49%(p<0.05)로 나타났다(Fig. 4). 세포의 형태학적 관찰 대조군에서는 숫적으로 많은 신경세포들이 다수의 돌기를 내어 상호 밀접하게 연결하고 있었다(Fig. 5A). 20 mU/ml XO/0.1 mM HX에 4시간 동안 노출시킨 산소유리기 처리군에서는 세포의 수적 감소를 비롯하여 돌기가 소실되었으며 그 결과 세포간의 연결이 감소되었다(Fig. 5B). 그러나 TPEN을 80 uM을 처리한 경우 세포수의 증가를 비롯하여 신경돌기 및 세포간 연결이 대조군과 비슷하였으나(Fig. 5C) DFO를 처리한 실험군에서는 TPEN을 처리한 실험군과는 달리 XO/HX만을 처리한 실험군에 비하여 유의한 방어효과를 보이지 않았다. 고찰 산소유리기는 노인성 치매를 비롯한 뇌허혈과 같은 많은 신경병변에 있어서 병리적 요인으로 밝혀지고 있다. 산소유리기는 NMDA(N-methyl-D-aspartate) 수용체를 과활성화 시킴으로써 세포내 칼슘이온 유입을 허용하며 세포내 NOS(nitric oxide synthase)를 자극하여 NO(nitric oxide)의 생성을 촉진시킨다고 한다.7) 최근 이과영역에서는 소음성 난청, 와우허혈에 의한 돌발성 난청, 아미노글라이코시드 항생제 이독성에 산소유리기가 관여됨이 밝혀지고 있으며 산소유리기 방어제의 효과에 관한 동물실험이 진행되고 있다.3-5) 안면신경의 변성과 재생에 있어서 중요한 역할을 하는 슈반세포에 대한 연구는 비교적 드문 편이다. 본 실험에서 XO/HX를 배양한 슈반세포에 노출시킨 결과 처리한 농도에 비례하여 세포의 생존율을 유의하게 감소시켰다. 이러한 결과는 중추신경인 배양된 생쥐 척수신경세포, 희소돌기 아교세포에 대한 산소유리기의 독성 효과와 비슷하였다.8)9) 즉 산소유리기의 산화적 손상에 의해 신경세포들의 퇴화가 초래됨을 나타낸다. 산화적 손상의 원인은 XO와 HX에 의해서 생성된 superoxide와 같은 자유라디칼(free radical)이 항산화계의 효소 활성에 손상을 줌으로써 미처 제거되지 못한 산소유리기들이 신경세포에 손상을 초래하였을 가능성이 클 것으로 사료된다.10) 이밖에도 생성된 superoxide나 hydroperoxide와 같은 산소유리기들이 NO와 같은 질소자유기들과 작용하여 이차적으로 신경세포나 세포막의 지질과산화반응을 유발하여 그 결과 슈반세포의 기능적 손상이나 또는 이와 관련된 각종 효소에 영향을 줌으로써 세포의 퇴화를 촉진시켰을 가능성도 높다. 따라서 본 실험에서는 항산화계에 산소유리기가 관련되어 있는지를 조사하기 위하여 항산화제의 일종인 TPEN과 DFO를 산소유리기에 노출시키기 전에 배양신경세포에 처리한 후 이들이 산소유리기에 의해 유도된 신경독성에 미치는 영향을 조사한 결과 TPEN은 배양 슈반세포에 대한 산소유리기의 신경독성을 매우 효과적으로 방어하였다. 이 같은 원인으로는 TPEN이 Zn/Fe의 chlelator로써 Zn ion의 억제에 의한 산화적 손상을 무시할 수는 없지만 그 보다도 본 실험에서는 TPEN이 ferric ion을 불활성화 시킴으로써 XO/HX에 의해 형성된 산소유리기와의 상호작용이 억제되어 그 결과 hydroxyl radical의 생성이 감소되었기 때문일 것으로 생각된다.7) 또한 TPEN은 Ca2+ ion을 착화시키기 때문에 산소유리기에 의한 흥분성 아미노산과 NMDA 수용체간의 작용을 억제하여 그 결과 산소유리기의 산화적 손상에 의한 독성으로부터 신경세포를 보호하였을 것으로 생각된다.1) 이러한 실험 결과는 철이온이 산소유리기에 의한 산화적 손상과 밀접한 관련이 있음을 증명해 준다고 하겠으며, 이는 본 실험의 세포 형태학적 관찰 소견에 있어서도 위와 같은 가능성을 제시하고 있다 하겠다. 한편 TPEN과 유사한 DFO는 본 실험에서 산소유리기에 의한 신경독성에 대하여 유의한 방어효과를 나타내지 못했다. 이러한 이유에 대한 가능성의 하나로 TPEN과 DFO간의 화학 구조의 차이에 따른 약리학적 성질도 배제할 수 없지만 이 보다는 TPEN은 세포막 투과성인 반면 DFO는 세포막 투과성이 아니기 때문에 이같은 세포막의 투과성 차이 등에 기인한 것으로 생각된다. 이외에 또 다른 가능성으로는 TPEN은 DFO와는 달리 Ca2+ ion을 착화시키는 성질이 있어,1) 아마도 세포막 투과성의 차이를 비롯한 이들 요인들의 복합적인 작용에 의한 결과일 가능성이 더 클것으로 생각된다. 그러나 이에 대해서는 앞으로 많은 연구가 이루어져야 할 것으로 생각된다. 저자들은 향후 배양된 슈반세포를 안면신경 손상부위에 심어주어 효과적인 안면신경재생에 관한 연구를 연속적으로 시행하고자 하며 본 연구결과는 안면신경 재생연구의 기초적 자료 구축에 도움이 될 것으로 사료된다. 결론 생쥐 안면신경 슈반세포를 배양하여 산소유리기에 노출시키고, 항산화제를 전처치하고 노출시켜 세포의 생존율 분석과 형태학적 관찰을 통하여 다음 결과를 얻었다. 1) 배양된 슈반세포에 노출시킨 XO/HX의 농도에 비례하여 세포의 생존율을 유의하게 감소시켰다. 2) 항산화제인 TPEN은 배양 슈반세포에 대한 XO/HX에 의한 신경독성을 효과적으로 방어하였다.
REFERENCES
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