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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1999;42(11): 1413-1418. |
| Expressions of p16 and p21 Protein in Laryngeal Squamous Cell Carcinomas. |
| Joong Ho Ahn, Hyeong Seok Kim, Sang Yoon Kim, Joor Yung Huh, Jae Gul Chung, Soon Yuhl Nam |
1Department of Otolaryngology, Asan Medical Center, University of Ulsan College of Medicine, Seoul, Korea. synam@www.amc.seoul.kr
2Department of Diagnostic Pathology, Asan Medical Center, University of Ulsan College of Medicine, Seoul, Korea. |
| 후두 편평세포암종에서 p16 및 p21 단백의 임상병기에 따른 발현양상 |
| 안중호1 · 김형석1 · 김상윤1 · 허주령2 · 정재걸2 · 남순열1 |
| 울산대학교 의과대학 서울중앙병원 이비인후과학교실1;진단병리과학교실2; |
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| 주제어:
p16ㆍp21ㆍ종양억제인자ㆍ후두암ㆍ면역화학염색. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Cyclin-dependent kinase inhibitor (CDKI) is known to play an important role in oncogenesis, but its clinical effect in head and neck cancer has not been reported yet. This study was designed to evaluate the correlation between the pattern of expression in p16 and p21, and tumor progress in laryngeal squamous cell carcinoma.
MATERIALS AND METHOD:
Paraffin-embedded tissue specimens from 54 patients, who were operated for laryngeal squamous cell carcinoma between Dec. 1990 and Apr. 1997, were immunohistochemically stained for p16 and p21 protein. The clinical features from these patients were retrospectively evaluated.
RESULTS:
In p16, the proportion of early T stage (T1, T2) and early N stage (N0) was relatively larger in the diffusely staining type than in the other staining pattern; but, the correlation between expression of p16 and T N stage was not significant (p=0.07, 0.65). In p21, proportion of early T stage (T1, T2) and early N stage (N0) was relatively larger in the diffusely staining type than in the other staining pattern; and again, the correlation between expression of p21 and T N stage was not significant (p=0.06, 0.10).
CONCLUSION:
Other factors were suggested to be strongly related to the clinical aspects of laryngeal squamous cell carcinoma, such as N stage and T stage than p16 and p21.
Further study will be needed to understand the role of p16, p21 in oncogenesis of laryngeal squamous cell carcinoma. |
| Keywords:
p16ㆍp21ㆍTumor suppressor geneㆍLaryngeal squamous cell carcinomaㆍImmunohistochemical stain |
서론
악성종양의 발생에 관하여는 oncogene과 더불어 cyclindependent kinase inhibitor(CDKI)가 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 잘 알려진 p53의 경우 G1-checkpoint에서 세포주기 억제를 일으켜서 세포증식을 억제(apoptosis)하는 것으로 이해되고 있다.1)2) 정상 p53 단백은 정상세포에서 DNA가 손상되었을 때 세포 내에서 축적됨에 따라 세포분열이 G1-checkpoint에서 멈추게 하여 손상된 DNA가 복구될 시간적 여유를 갖도록 하는 것으로 알려져 있다.3) 이와 같은 기전을 이론적 바탕으로 p53 단백은 두경부 편평세포암종에서 예후와 관련된 많은 연구가 이루어져 있으나 CDKI의 한 종류인 p21단백과 p16단백의 두경부암종에 관한 연구는 그리 많지 않다.
p21 단백은 p53 단백에 의해 증가되는 CDKI로 p53 단백에 의해 매개된 G1-arrest에 관여하는 것으로 알려져 있는데 cyclin-dependent kinase(CDKS)에 결합하여 세포주기를 G1에서 멈추게 하고 DNA replication을 억제하는 것으로 알려져 있다.4)5) 유방암과 자궁경부암의 연구에서 알려진 바와 같이 p21 단백은 흔히 종양의 악성도가 높을수록 발현율이 높은 것으로 알려져 있다.4)9)
Chromosome 9p21에 위치한 것으로 밝혀진 또 하나의 CDKI인 p16은 cell cycle 조절에 중요한 역할을 하는 retinoblastoma/cyclin D1/p16 pathway에 관여하며 cyclin D1에 의해 이루어지는 pRb의 phosphorylation을 억제하여 cell cycle에서 S phase로 들어가는 것을 조절하는 것으로 알려져 있다.6)7)
저자들은 후두 편평세포암종의 종양세포에서 p16 및 p21 단백의 발현양상이 임상적인 양상과 어떠한 관련성을 보이는가를 연구하여 임상적인 이용의 가능성 여부를 알아보고자 하였다.
대상 및 방법
본원 이비인후과를 방문하여 후두 편평세포암종으로 진단하여 1990년 12월부터 1997년 4월까지 수술적 치료를 받은 환자 54명을 대상으로 의무기록지를 통한 후향적 병력조사를 기초로 하여 수술 당시의 임상소견과 면역조직화학검사를 통한 p16 및 p21 단백의 발현강도 및 분포양상을 관찰하여 임상적 측면과의 관련성을 조사하였다. 대상환자군의 연령은 27세에서 79세까지 평균 60.6세로서 남성이 51명, 여성은 3명이 있었다.
대상환자 54명은 M0의 환자들로서 원발 병소의 크기에 따른 T 병기는 T1 11명(20.4%), T2 16명(29.6%), T3 18명(33.3%)이고 T4가 9명(16.7%)이었다. 경부 전이에 따른 N 병기는 N0 33명(61.1%), N1 7명(13%), N2 11명(22.2%)이었으며 N3는 3명(5.6%)이었다. 또한 발생부위에 따라 성문암 18예(33.3%), 성문상부암 31예(87%), 원발부위를 정확히 가늠하기 어려워 transglottic cancer로 분류된 경우는 5예 있었다.
과거력상 방사선 치료를 받고 재발한 경우가 7명(13%)이었고 음주력은 아주 심한 습관적 음주자가 13명(24.1%), 전혀 음주의 과거력이 없었던 경우가 16명(29.6%)이었다. 흡연의 경력이 없었던 경우가 7명(13%), 40 pack-years의 흡연경력을 가지고 있었던 경우가 19명(35.2%)이었다.
수술은 후두 전적출술을 시행한 경우가 38명(70.4%)였으며 성문상부 절제술이나 성문부 부분절제술을 시행할 수 있었던 경우가 각각 6예씩(11.1%)있었고 후두와 인접한 인두에까지 절제 범위를 확장해야 했던 경우는 4예(7.4%)가 있었다. 경부곽청술을 시행하지 않은 경우는 15예(27.8%)가 있었으며 편측 경부곽청술을 시행한 경우가 20명(37%), 양측 경부곽청술을 시행한 경우가 19명(35.2%)이었다.
면역 조직 화학 염색
조직은 10% 중성 포르말린에 고정하고 파라핀에 포매하여 4 μm 두께의 절편을 제작하였다. 모든 예에서 통상적인 Hematoxylin-Eosin 염색을 시행하여 병리조직학적 검사를 실시한 후, 종양이 포함된 대표적인 절편을 선택하여 p16과 p21 핵단백질에 대한 면역조직화학염색을 시행하였다. 4 μm로 박절한 절편을 organosaline으로 도포한 슬라이드에 부착하고 정온기에 충분히 건조시킨 후 이를 통상적인 방법으로 탈파라핀화하고 무수알코올에서 탈수시켰다. Microwave로 가열하여 항원회복을 시도한 뒤 20분간 metanolic H2O2(Autoblocker)에 반응시켜 내인성 peroxidase를 억제시켰다. 정상 단백과의 비특이적 반응을 없애기 위해서 정상 단백과 반응하는 protein blocker와 30분간 반응시켰다. p16 및 p21단백에 대한 1차항체(Santa Cruz Biotiechnology, Inc.)와 각각 1시간 동안 반응시킨 후 다시 2차항체(Biotin-conjugated antibody；Immun-Cruz TM Staining Systems)와 10분 동안 반응시키고 Streptavidin-biotin complex detection system으로 diaminobenzidine을 이용해서 발색하였으며, Harris-hematoxylin으로 대조염색을 시행하였다.
염색결과는 림프구, 정상 상피조직 등 기존에 알려진 positive internal control이 분명한 양성을 보일 경우에만 종양세포의 염색성을 판독하였다. 양성의 기준은 세포질내에서의 염색여부와는 상관없이 세포핵내에서의 염색 여부로 결정하였다. 각각의 면역조직화학염색된 조직에 있어 염색의 종양내 분포유형을 전혀 염색이 안된 경우(none)를 제 I형, 종양세포의 25%이하에서만 염색된 경우(a few)를 제 II형(Fig. 1), 종양세포의 75%이상에서 염색이 된 경우(diffuse)를 제 IV형(Fig. 2), 제 II형과 제 IV형의 중간정도(25~75%)로 염색이 된 경우(focal)를 제 III형으로 정의하여 4가지 유형으로 분류하였다. 또한 면역염색이 양성인 경우 각각의 발현강도를 양성흔적(trace, ＋/-), 약양성(weakly positive, ＋), 중등도 양성(moderately positive, ＋＋), 강양성(strongly positive, ＋＋＋)의 4단계로 나누어서 관찰하였으며 발현강도의 판정에는 가장 강하게 발현된 경우를 최종적인 결과로 채택하였다. 본 연구에서는 복잡한 단계를 거치는 면역조직 화학염색의 과정상 항원소실의 가능성을 비롯한 여러 가지 오류 및 조직표본의 장기간 보존에 의한 위음성의 가능성을 배제하기 위하여 positive internal control이 전혀 염색이 되지 않은 경우는 임상양상과의 관련성 분석에서는 제외하기로 하였다.
통계 처리방법
본 연구는 chi-squre test를 이용하여 통계처리를 하였으며 p value는 0.05 이하인 경우를 유의하다고 판정하였다.
결과
면역조직화학검사상 p16 단백의 종양세포내 발현의 분포양상은, 제 I형이 10예(18.5%)였고 대부분 음성이나 몇몇 세포에서만 나타난 제 II형이 12예(22.2%), 제 III형이 14예(25.9%), 그리고 대부분의 세포에서 발현양상을 보인 제 IV형이 18예(33.3%)였다. p21 단백의 종양세포내 발현의 분포양상은 제I형이 2예(3.7%)였고, 제 II형 19예(35.2%), 제 III형 9예(16.7%), 제 IV형이 24예(44.4%)로서 p16 단백과는 다른 양상을 보였다.
원발부위별로 살펴보면 p16 단백의 발현양상은 성문상부 암에서 제 II형이 8예(25.8%)로 3예(16.7%)를 나타낸 성문부 암보다 약간 많은 것으로 나타났으나 통계적 의의는 없었다.(p＝0.90), p21 단백의 발현양상은 성문상부 암에서 제 II형이 14예(45.2%)로 나타나 4예(22.2%)를 나타낸 성문부 암보다 현저히 증가한 양상을 보여 p16 단백보다 더 큰 차이를 나타냈으나 통계적 의의는 없었다(p＝0.38)(Table 1).
종양의 T stage에 따른 p16 단백의 발현양상은 제 IV형의 경우 T1, T2의 조기 후두암일 경우가 제 III형이나 제 II형에서 보다 높았으며(p＝0.07), p21 단백의 경우는 제 IV형이 제 II형보다 T 1, T 2의 조기후두암의 비율이 높았고 제 III형은 제 IV형보다 조기 후두암의 비율이 높았으나 통계적 의의는 없었다(p＝0.06)(Table 2).
경부임파선 전이에 따른 p16 단백의 발현양상은 제 IV형의 경우 N0가 72.2%(13예/18예)로 가장 많았으며 제 III형이나 제 II형에서는 N0가 각각 57.1%(8예/14예), 41.6%(5예/12예)로 상대적으로 적은 분포를 보였으나 통계적 의의는 없었다(p＝0.65). 경부임파선 전이에 따른 p21 단백의 발현양상은 제 IV형이나 제 III형의 경우 N0가 각각 70.8%(17예/24예), 77.8%(7예/9예)로 제 II형에서 N0가 47.4%(9예/19예)였던 것에 비해 높은 양상을 보였으나 통계적 의의는 없었다(p＝0.10)(Table 3).
p16 단백의 조직내에서의 발현강도는 양성흔적이 3예(5.6%), 약양성이 14예(25.9%), 중등도 양성이 13예(24.1%), 강양성이 14예(25.9%)로 비교적 고른 분포를 보였다(p＝0.50). p21 단백의 발현강도는 p16 단백보다 더 강하게 발현되는 양상을 보여서 양성흔적을 나타낸 경우는 1예였으며 약양성은 보인 경우와 중등도 양성을 보인 경우는 각각 14예(25.9%)였고 강양성을 보인 경우가 조금 많아서 23예(42.6%)의 순서이었으나 통계적 유의성은 없었다(p＝0.62). 원발부위에 따른 p16 단백과 p21 단백의 발현강도는 큰 차이를 보이지 않았다(Table 4).
p16 단백의 발현강도는 중등도 양성이상으로 강하게 염색되는 경우에서 T1, T2의 조기후두암의 비율이 높았다(p＝0.26). p21 단백은 중등도 양성이상으로 강하게 발현되는 경우에 T1, T2의 조기후두암의 비율이 높았으나 통계적 유의성은 없었다(p＝0.24)(Table 5).
p16 단백과 p21 단백의 발현강도는 경부임파선 전이여부에 따른 차이를 보이지 않았다(p＝0.86, 0.47)(Table 6).
고찰
원발부위 종양의 생물학적인 행동양식이 환자의 예후에 영향을 미칠 것이라는 것은 누구나 동의하는 사실이지만 생물학적인 행동양식을 규명하기는 매우 어렵다.
세포주기는 복잡한 과정으로 p53, p21, p16, 그리고 cdc25 등과 같은 다양한 종류의 조절단백이 균형 있게 작용하여 세포를 두 개의 자세포로 분열시키는데 역할을 하게 된다.13) 세포 주기는 polyomavirus, papillomavirus, 그리고 adenovirus 등의 바이러스에 의해 또한 악성 종양에서 변화되며 이는 조절단백의 변화나 소실에 의하여 매개되는 것으로 알려져 있다.13)
CDKI인 p16 단백과 p21 단백의 저발현 상태는 세포주기 조절의 변화를 초래한다고 생각되며 곧 악성종양의 행동양식에도 변화를 나타낼 것이라는 이론을 가능케 한다. 본 연구는 이러한 추론을 바탕으로 성립된 것으로 종양의 원발부위 한계와 경부림프절 전이상태 연구의 한계가 설정되어 있다.
p16 단백은 p16 유전자의 homozygous deletion, methylation of the promotor, 그리고 point mutation 등의 세가지 경로를 통하여 기능을 상실하는 것으로 알려져 있다.15) 하지만 30∼40%에서는 정상 p16 단백의 손실을 보이고8) p21 단백은 돌연변이보다는 자체의 소실에 의하여 기능을 상실하는 것으로 알려져 있어 암세포에서 그 발현여부를 관찰하는데 있어 비교적 면역조직화학 염색법이 믿을만한 것으로 생각하여8) 면역조직화학 검사를 시행하여 p16 및 p21 단백의 발현을 연구하였다. 그러나 면역조직화학검사상 결과판독에 어려움이 있어 발현양상과 발현강도 두 가지 척도를 가지고 결과를 기술하고 증례의 수가 적어 각각의 척도에 따라 T 병기와 N 병기와의 관련성을 알아보고자 하였다.
원발부위 종양의 T 병기에 따라서 종양의 범위가 크지 않을 경우에 p16 단백의 발현양상이 고르고 강하게 나타나는 경향이 있었으며 p21 단백의 발현은 T 병기에 따라 일정한 양상을 보이지 않았다. 통계적으로 유의한 결과를 보이지는 않았으나 p16 단백의 발현에 결함이 발생하였을 경우 원발부위 종양의 성장에 억제가 풀림으로서 위와 같은 결과가 나타나는 것으로 사료된다. 경부림프절 전이에 따라 p16 단백과 p21 단백의 발현은 N0였을 때 발현양상이 diffuse type이 많았으나 N 병기에 따라서 발현양상이 유의한 관계를 보이지는 않았다. 발현강도에 따라서도 N 병기는 유의한 차이를 보이지 않아서 경부림프절 전이에는 p16과 p21 단백 이외에도 다른 인자가 강하게 관여하고 있을 것으로 생각된다. 이는 Tatemoto 등14)의 연구에서 경부림프절 전이 여부에 따라 p21 단백의 발현율에 유의한 차이가 있다는 보고와 차이가 있는 것으로 여기에는 면역조직화학염색 기법상의 문제, 증례 숫자의 부족 등이 원인이 될 수 있을 것이다. 또한 위에서 언급한바와 같이 다른 인자의 관여도 배제할 수 없을 것이다.
두경부 편평세포암종의 70%, 유방암의 65% 그외 악성 흑색종, 자궁경부암 등에서의 p16 유전자의 소실을 보고하고 있는바8)9)16) 본 연구에서는 이와 같은 명확한 관련성을 보이지는 못하였으나 원발부위 종양의 T 병기나 N 병기와는 관련이 적어도 예후와 관련을 보일 수 있다는 다른 연구자의 연구결과10)는 앞으로의 연구방향을 지적해 준다고도 볼 수 있다. 물론 이와는 반대의 입장을 보이는 연구결과11)가 있고, 또한 유전자 수준의 다른 연구에서 볼 수 있듯이12) 종양억제유전자인 p16이나 p21의 변이는 일부에서 발견되는 현상이며 모든 악성종양의 생물학적인 성향의 전부를 결정할 수는 없을 것으로 생각한다면, 앞으로의 연구가 보다 더 장기적인 추적관찰과 많은 연구대상을 필요로 할 것으로 사료된다.
결론적으로 p16 및 p21 단백은 정상적인 세포 주기의 변화를 주어 암세포의 발생에 관여하는 인자이지만 본 연구에서의 결과는 두경부 편평세포암에서 통계학적으로 유의하게 변화하지 않은 것으로 나타났다. T 병기상 T1, 2의 조기 병기에서는 p16, p21의 III, IV형 발현율이 T3, 4의 진행성 병기에서는 I, II형 발현율이 상대적으로 높은 것으로 나타났다.
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