| Expression and Role of Adhesion Molecules in the Nasal Mucosa of the Rat with Experimentally Induced Allergic Rhinitis. |
| Yang Gi Min, Chul Hee Lee, Chae Seo Rhee, Ja Bock Yun, Ik Tae Kim, Tae Young Kwon, Seok Won Park, Sang Jun Jeon |
1Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery Seoul National University College of Medicine, Seoul, Korea. ygmin@plaza.snu.ac.kr
2Department of Otorhinolaryngology, Inje University, Sanggye Paik Hospital, Seoul, Korea.
3Department of Otorhinolaryngology, Hallym University, College of Medicine, Seoul, Korea. |
| 실험적으로 유발시킨 알레르기성 비강점막의 유착분자 발현 양상 및 역할에 관한 연구 |
| 민양기1 · 이철희1 · 이재서1 · 윤자복2 · 김익태3 · 권태영1 · 박석원1 · 전상준1 |
| 서울대학교 의과대학 이비인후과학교실1;인제대학교 의과대학 상계백병원 이비인후과학교실2;한림대학교 의과대학 이비인후과학교실3; |
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| 주제어:
비강 점막ㆍ접착분자ㆍ알레르기 동물모델ㆍ억제 반응. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Airway allergic reactions are induced by infiltrating inflammatory cells into the human airway tissues through interactions between vascular endothelial cells, inflammatory mediators and adhesion molecules. Accordingly, it is important to study the role of adhesion molecules for the evaluation of pathophysiology of allergy. The aim of this study is to investigate the effect of monoclonal antibodies against intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and leukocyte function associated molecule-1 (LFA-1) on the pathophysiology of allergy in ovalbumin-sensitized rats.
MATERIALS AND METHODS:
We developed an allergy model in rat using the intraperitoneal injection and intranasal nebulization of ovalbumine solution. We evaluated in vivo effects of ICAM-1 and LFA-1 monoclonal antibodies on the expression of ICAM-1 and LFA-1 in ovalbumin sensitized rats.
RESULTS:
Nasal symptoms after allergen challenge were significantly suppressed and the number of eosinophil in nasal mucosa were significantly inhibited by the treatment of adhesion molecule antibodies. Anti-ICAM-1 and anti-LFA-1 monoclonal antibodies suppressed the expression of ICAM-1 and LFA-1 in nasal mucosa of ovalbumin-sensitized rats.
CONCLUSION:
It is suggested that allergy can be managed by a useful treatment method using adhesion molecule antibody. |
| Keywords:
Nasal mucosaㆍAdhesion moleculeㆍAllergy animal modelㆍInhibition |
서론
염증이란 염증유발인자(병원체, 항원 등)에 대한 생체의 반응으로 혈관으로부터 유리된 염증세포가 조직으로 침윤되는 것이라고 할 수 있다. 이러한 염증세포가 조직 내로 침윤되는 것은 혈관 내피세포, 염증세포, 세포간질 및 상피세포 등에 존재하는 접착분자(adhesion molecule)들 간의 상호작용에 의한다는 것이 밝혀졌으며1)2) 지금까지 밝혀진 염증반응에서의 염증성 매개물질이나 싸이토카인 등의 역할 중 많은 부분이 다양한 접착분자의 발현을 통하여 이루어진다는 것이 알려지게 되었다.3-6)
ICAM-1은 면역글로불린과에 속하는 유착물질로써 백혈구 표면에 있는 β2 인테그린과 반응하여 백혈구가 내피세포에 유착 가능하게 해주는 물질이다.7) 알레르기 환자에서 ICAM-1의 발현이 증가하는가에 대해서는 다소 논란이 있어, 정상인에 비해 알레르기 환자의 비 점막에서는 ICAM-1의 발현이 증가했다는 보고 8)가 있는 반면, 그렇지 않다는 보고도 있다.9) 그러나 알레르기 비염환자의 비 점막에서 ICAM-1의 표현 정도와 호산구 등의 염증세포의 침윤 정도와 관련이 있다는 보고는 ICAM-1이 알레르기비염의 형성 과정에서 중요한 역할을 담당한다는 것을 시사한다.10)
본 연구는 백서를 사용하여 알레르기 비염 모델을 제작하고 이를 이용하여 접착분자 중에서 ICAM-1과 LFA-1에 대한 단일클론 항체를 백서에 투여한 후 비강 조직내 염증세포 특히 호산구의 침윤의 변화를 알아보고 또한 접착분자의 발현양상의 변화를 봄으로써 접착분자 조절을 통한 알레르기 비염 치료방법의 가능성을 알아보고자 했다.
재료 및 방법
실험동물을 이용한 알레르기 비염 모델의 제작
실험동물로는 체중 200~250 g의 외견상 건강해 보이는 15마리의 Wistar 계 수컷 백서((주)대한실험동물)를 5마리씩 세 그룹으로 나누어 사용했다. 접착분자 ICAM-1과 LFA-1의 단일클론항체를 투여한 A군, 항체를 투여하지 않은 알레르기 대조군인 B군, 그리고 정상대조군인 C군으로 나누었다.
실험군 A와 B에 대해 실험 1일째, 5일째, 21일째 난알부민(chicken egg albumin, grade V, Sigma Chemical Co, Phillipsberg, NY) 10 μg과 수산화 알루미늄(Al(OH)3) 겔 1 mg을 식염수에 혼합하여 1 ml의 혼합액을 만들어 복강내 주사하여 전신감작(systemic sensitization)을 시켰다. 그리고 나서 실험 28일째부터 1주일간 매일 15분씩 0.1 gm%의 난알부민 용액을 분무하여 비강내 국소감작(intranasal sensitization)을 시켰다. C군에는 혼합액 대신 동량의 식염수를 복강내 주사하였고 난알부민 용액 대신에 식염수를 분무하였다.
마지막 비강 분무 1주일 후 실험군 A에게는 마리당 1 mg의 ICAM-1 항체(purified anti-rat ICAM-1, 1A29, Pharmingen, San Diego, CA, USA)와 1 mg의 LFA-1 항체(purified anti-rat LFA-1, WT1, Pharmingen, San Diego, CA, USA)를 복강내 주사하였고, 실험군 B와 C에게는 동량의 식염수를 복강내 주사하였다(Fig. 1).
접착분자 항체의 복강내 주사 1 시간 후 모든 실험군에 2 gm% 농도의 200 μl의 난알부민 용액을 micropipette을 이용하여 비강내 점적(intranasal instillation)하여 항원주입에 의한 알레르기 반응을 유도하였다. 항원 주입후 15분간 백서의 코를 비비는 동작과 재채기 숫자를 기록하여 각 실험군의 결과를 비교하였다.
항원 주입후 24시간 후에 백서를 희생시켜 비중격 점막을 채취하여 두조각으로 나누어 한 조각을 즉시 4% paraformaldehyde로 10~16시간 동안 4℃ 냉장실에서 조직고정을 한 후에 파라핀 블록으로 만들고 나서 Luna 염색법11)을 시행하여 비 점막에서의 호산구의 침윤양상을 200배 광학 현미경(Laborlux K, Leica, Stgallen. Switzerian) 하에서 관찰 비교하였다. 나머지 한 조각의 비중격 점막은 액체질소에 넣어 냉동절편을 만들고 나서 면역조직염색을 다음과 같이 시행하여 비 점막에서의 접착분자의 발현양상을 관찰 비교하였다.
면역조직염색
표본의 염색은 Avidin-biotin peroxidase complex 법을 이용하였다. 냉동 절편 조직을 아세톤 용액에 10분간 고정한 뒤에 PBS 용액에 10분간 세척하였다. LSABⓡ kit(DAKO, Glostrup, Denmark)에 들어있는 차단제(blocking agent)를 조직절편 위에 떨어뜨린 후 30분간 반응시켰다. Biotin이 붙은 접착분자의 항체를 적절한 농도로 희석하여 실온에서 30분간 반응시킨 후 hoarseradish peroxidase(HRP)를 30분간 반응시키고 완충용액으로 15분간 씻었다. 기질발색제 용액을 슬라이드 조직 위에 떨어뜨려 3분간 반응시킨 후 증류수로 씻고 Meyer's hematoxylin으로 대조염색을 시행하여 광학현미경하에서 관찰하였다. 염색할 때마다 음성 대조군으로 항체 대신 완충용액으로 반응시켰다.
항체로는 biotinylated anti-rat ICAM-1(1A29, Pharmingen, San Diego, CA, USA), biotinylated anti-rat LFA-1(WT1, Pharmingen, San Diego, CA, USA) 단클론성 항체를 사용하였다.
현미경 관찰시 접착분자의 발현정도을 측정하기 위하여 실험군에 대해 내용을 모르는 두 명의 실험자가 염색된 슬라이드를 검사하여 음성(0), 약양성(1), 중등도(2), 강양성(3)으로 구분하여 그 평균 수치를 구하여 각 실험군의 접착분자 발현정도를 비교하였다.
통계처리방법
실험군들의 각 데이터를 비교하기 위하여 Wilcoxon rank sum test 방법으로 p-value를 구하였으며 5% 유의수준에서 통계적 분석을 하였다.
결과
접착분자 항체 투여가 알레르기 실험동물의 비 증상 빈도에 미치는 영향
알레르기 대조군에서는 정상대조군 보다 의미있게 비 증상의 빈도가 증가하였다. 알레르겐 투여후 15분간 측정한 코비빔과 재채기의 합은 알레르기 대조군의 경우 평균 22.1±7.8개로써 정상대조군의 9.2±5.2개 보다 많았다(p<0.05). 접착분자 항체를 투여했던 백서에서는 증상의 평균이 8.3±6.1개로써 알레르기 대조군보다 통계적으로 유의하게 감소하였다(p<0.05). ICAM-1 항체와 LFA-1을 투여한 실험군과 정상대조군 간의 통계적으로 유의한 차이는 없었다(p>0.05)(Fig. 2).
접착분자 항체 투여가 알레르기 실험동물의 비강 점막에서 호산구 침윤에 미치는 영향
알레르기 실험동물의 비강 점막에서는 병리조직학적 소견상 염증세포 특히 호산구의 침윤이 현저한 것을 볼 수 있었다. Luna 염색상 호산구의 세포질에 있는 분말(granule)이 적색으로 염색되므로 쉽게 다른 염증세포와 구분할 수 있었다. 호산구는 상피세포층보다 상피하 고유층에 주로 분포하였으며 상피하 고유층의 부종 소견도 일부에서 관찰되었다.
알레르기 대조군에서는 정상대조군 보다 의미있게 호산구의 수가 증가하였다. 200배 현미경 시야에서 알레르기 대조군의 호산구 수는 한 시야당 평균 5.84±3.84 개로써 정상대조군의 0.95±0.52개 보다 많았다(p<0.05). 접착분자 항체를 투여했던 백서에서는 호산구의 수가 1.10±0.50개로써 알레르기 대조군보다 통계적으로 유의하게 감소하였다(p<0.05). ICAM-1 항체와 LFA-1을 투여한 실험군과 정상대조군 간의 통계적으로 유의한 차이는 없었다(p>0.05)(Fig. 3).
접착분자 항체 투여가 알레르기 실험동물의 비강 점막에서 접착분자 발현에 미치는 영향 알레르기 대조군의 비강점막에서는 대부분의 백서에서 강하게 접착분자의 발현이 나타났다. ICAM-1은 주로 점막하 고유층의 염증세포와 선세포, 혈관내피세포 등에서 발현되었으며, 상피세포층도 약하게 염색되었다(Fig. 4A). 반면 접착분자 항체를 주사한 백서의 점막에서는 알레르기 대조군에 비해 그 발현 정도가 현저히 감소하여 일부 선세포에서만 발현되었다(Fig. 4B). LFA-1도 ICAM-1처럼 주로 점막하 고유층의 선세포 등에서 발현되었으며(Fig. 5A), 접착분자 항체를 주사한 백서의 점막에서는 알레르기 대조군에 비해 LFA-1의 발현 정도가 현저히 감소하였다(Fig. 5B). 정상 대조군의 백서의 비 점막에서는 ICAM-1과 LFA-1 모두 발현이 안되거나 발현 정도가 미미했다.
접착분자의 발현정도를 점수로 계산하여 비교해본 결과 ICAM-1과 LFA-1 모두 알레르기 대조군에 비해 접착분자를 주사한 백서의 비 점막에서 통계적으로 유의하게 접착분자의 발현정도가 감소하였다(p<0.05)(Figs. 6 and 7).
고찰
접착분자는 세포와 세포 그리고 세포와 세포외물질 간의 상호작용에 관계하는 물질이다. 사람의 비강점막세포에서는 주로 혈관내피세포의 고유층의 상층부에 분포한다고 알려져 있다.10)
조직내 호산구 침윤은 알레르기 반응의 중요한 표식자(hallmark)의 하나로 간주되고 있다.12) 호산구의 침윤은 여러 가지 다양한 병리 생태학적인 과정으로 발생하는데, IL-3, IL-4, IL-5 같은 싸이토카인들에 의해 발생하기도 하며 접착분자 반응의 활성화에 의해서도 형성된다. 호산구의 표면에는 혈관내피세포의 ICAM-1과 반응하는 LFA-1이라는 접착분자가 있으며 알레르기 반응이 생기면 활성화된다고 한다.13) 비 점막이 알레르겐에 노출된 후에는 호산구가 혈관 내로부터 혈관 밖으로 이동한 후 상피층을 통과하여 비즙내로 이동하는 양상을 보이는데, 혈관내에 존재하는 염증세포들이 혈관벽을 통하여 조직까지 이동하는 데에 있어서, 백혈구-내피세포 접착분자는 백혈구가 혈관벽에 접착하는 과정에서 중요한 역할을 한다는 것이다. 호산구와 같은 세포들의 이동은 부분적으로 세포의 표면에 있는 접착분자와 국소 혈관 내피세포에 표현되는 접착분자와의 상호작용에 의해서 매개되는 것으로 알려져 있다.
ICAM-1에 대한 항체를 전처치함으로써 알레르기 동물 모델에서 호산구 증다증을 감소시킬 수 있는가에 대해서는 논란이 있다. 천식 동물 모델에서 ICAM-1에 대한 항체를 전처치함으로써 기관지의 호산구 증다증을 감소시킬 수 있다는 보고가 있으나,14) 기관지 세척액에서의 호산구의 수에는 변화가 없었고 단지 기도저항의 감소만을 관찰할 수 있었다는 보고도 있다.15) 본 연구에서는 대조군보다 알레르기 군에서 의미있는 호산구 증가 소견을 볼 수 있었고 접착분자인 ICAM-1과 LFA-1에 대한 단일클론 항체를 전처치 함으로써 호산구의 조직 침윤을 감소시킬 수 있었다. 난알부민에 감작시킨 백서 모델에서 ICAM-1이나 LFA-1에 대한 항체를 동시에 투여하지 않고 각각 한가지만 전처치 했을 때의 호산구 감소 효과에 대해서는 의문이 있다. Balb/c 마우스의 피부를 대상으로 한 Hakugawa 등16)의 실험에 의하면 ICAM-1의 항체만을 투여했을 때는 호산구를 감소시킨 반면 LFA-1의 항체는 호산구를 감소시키지 못했다고 하였다. 본 실험에서는 결과를 제시하지 않았으나 LFA-1 항체 투여만으로도 호산구 침윤의 감소를 시사하는 소견을 나타냈는데 추후 더 많은 데이터가 요구된다.
본 실험에서는 접착분자에 대한 항체의 전처치는 호산구의 침윤을 감소시킨 것처럼 백서의 비 점막에서의 접착분자의 발현을 감소시키는 양상을 나타내었다. 즉, 면역조직염색 과정에서 정상 대조군에 비해서 알레르기 형성군에서 ICAM-1과 LFA-1의 발현양상이 점막하 고유층의 염증세포와 선세포, 내피세포 등에서 증가되어 있었고 접착분자에 대한 항체를 투여한 백서의 비 점막에서는 발현이 감소된 것을 관찰할 수 있었다. 그런데 실험 초기에는 이차항체가 점막조직 전체에 반응하여 염색되는 양상으로 나타나 결과를 제대로 알 수 없었다. 또한 이차 항체가 일차항체 이외에 알레르기 반응 유발 전에 전처치한 접착분자들의 항체에도 붙어 염색될 가능성을 배제할 수 없었다. 그래서 이차항체를 사용하지 않고 일차 항체에 biotin이 붙은 항체를 사용하여 면역염색을 한 결과, 이차 항체에 의한 가양성(false positivity)을 줄일 수 있었다. 본 연구에서는 접착분자의 항체로써 접착분자의 역할을 차단하면 염증반응을 완화시킬 수 있다는 가정 하에 접착분자에 대한 항체를 알레르겐 노출 전에 백서에 복강 주입함으로써 비 점막의 호산구 증다증이 억제될 수 있는가를 보았다. 결과적으로 대조군보다 접착분자에 대한 항체를 복강주입한 백서에서 비 점막내 호산구의 수가 비해 현저하게 적게 나온 것은 접착분자에 대한 항체를 이용한 알레르기 비염의 치료가 가능하다는 것을 나타낸 것으로 사료되고 이후 다른 접착분자인 VCAM-1, VLA-4, E-selectin, P-selectin, L-selectin 등에서도 같은 실험을 하면 의미있는 결과가 나오리라 사료된다. 그러나 원숭이를 이용한 실험에서 반복적 항원 투여로 유발된 기관지 점막의 과민성과 호산구증다증이 항 ICAM-1항체의 정맥주사 혹은 흡입으로 유의하게 감소하였다는 보고17)는 있지만, 생체에서 항 ICAM-1항체를 이용한 유사한 연구결과는 아직 발표된 바 없다. 앞으로는 보다 접착분자에 대한 연구가 진행되면 알레르기성비염을 비롯한 인체의 질환치료에 적용시킬 수 있는 날이 올 것으로 기대된다.
결론
본 연구에서는 백서의 비강내에 난알부민을 주입한 알레르기 모델을 이용하여 접착분자에 대한 항체를 알레르겐 노출 전에 백서에 복강내 주입함으로써 비 증상과 호산구 증다증이 억제 될 수 있음을 알 수 있었고 접착분자 발현 정도의 감소를 알 수 있었다. 결과적으로 접착분자에 대한 항체를 이용한 알레르기 비염의 치료의 가능성을 실험적으로 나타낼 수 있었다.
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