| Effect and Catabolism of All-trans Retinoic Acid in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. |
| Seung Joo Yoo, Hyun Ja Kwon, Soon Yuhl Nam, Sang Yoon Kim |
| Department of Otolaryngology, Asan Medical Center, University of Ulsan College of Medicine, Seoul, Korea. sykim2@www.amc.seoul.kr |
| 두경부 편평상피세포암에서 All-<i>trans</i> Retinoic Acid의 세포내 작용 및 대사에 관한 연구 |
| 유승주 · 권현자 · 남순열 · 김상윤 |
| 울산대학교 의과대학 이비인후과학교실 |
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| 주제어:
Retinoic acidㆍCYP26ㆍCRABPㆍCRBP. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
All-trans retinoic acid (RA) is a form of vitamin A analogue that has shown chemopreventive activities in many types of malignancy with the properties that regulate cellular differentiations and suppress malignant proliferations. It is thought that the catabolism of RA is mediated by cytochrome P450RAI (CYP26) and its absorption, effects and catabolism are related to cellular retinol binding proteins (CRBP-I and II) and cellular retinoic acid binding proteins (CRABP-I and II). With eight different squamous cell carcinoma cell lines (AMC-HN-1~-8), we investigated the effects of RA and roles of these proteins in the metabolism and regulatory activity of RA.
MATERIALS AND METHODS:
Survival fractions of eight AMC-HN cells were analyzed six days after the treating them with 1 nM of RA. Reverse transcription-polymerase chain reactions (RT-PCR) were performed before and 24 hours after the load of 1 nM of RA to detect the expressions of CRBP-I, CRABP-I, CRABP-II, and CYP26.
RESULTS:
Resistances to RA were detected in AMC-HN-1, -2, -5, and -6 cell lines after RA treatment, and AMC-HN-3, -4, -7, and -8 cell lines showed sensitive responses to RA.
Before the addition of RA, expressions of CYP26 were detected in AMC-HN-1, -2, -4, -5, -6, and -7 cell lines and CRBP-I was expressed in AMC-HN-3, 4, 5, 7, and -8. After RA addition, the expressions of CYP26 were enhanced in AMC-HN-2, -5, -6, and -7. In six of eight cell lines, CRABP-I was suppressed and CRABP-II was enhanced after RA treatment.
CONCLUSION:
These results suggest that CYP26 has a direct correlation with the cellular metabolism of RA in the head and neck squamous cell carcinomas and that CRABP-I and CRABP-II have distinct roles in the regulatory effects of RA. CRBP-I might be an indicator that implies the responsiveness to RA. |
| Keywords:
All-trans retinoic acidㆍCYP26ㆍCellular retinoic acid binding protein |
서론
Retinoid는 비타민 A의 활성 대사물로서 여러 종류의 악성종양의 증식을 억제하는 효과가 있는 물질이다. 임상적으로, 13-cis-retinoic acid가 두경부 백반증의 악성화를 억제하고 두경부 악성종양 환자에서 이차암의 발병율을 낮추어 주는 효과가 있음이 보고되었으며,1)2) 이후 all-trans retinoic acid도 두경부 편평상피세포암의 세포주들에서 종양의 증식을 억제하는 것으로 알려졌고,3) 이식된 두경부 편평상피세포암에서의 암세포의 증식이 억제되는 것으로 나타났다.4)
이러한 RA의 효과는 기본적으로 세포내 전사(transcription)의 조절에 의해 나타나는 것인데, 여기에는 여러 종류의 핵감수체(RARα, RARβ, RARγ, RXRs)들의 중재가 있어야 한다. 현재까지 알려진 바로는 RA와 감수체가 결합한 후 감수체의 이합체(heterodimer)가 형성되어 전사 조절작용을 수행하며,5) RA가 감수체와 결합에 이르기까지에는 특이한 결합단백질을 필요로 한다.6)7) Cellular retinol binding proteins(CRBP-I, CRBP-II)와 cellular retinoic acid binding proteins(CRABP-I, CRABP-II) 들이 그 역할을 하는데, 이들은 세포질 내에 RA를 저장함으로써 핵감수체들과 결합될 기회를 제공하는 기능이 있는 반면, RA를 세포질 내에 정체시키고 대사경로로 빠져들게 함으로써 RA에 대한 내성에 관여하는 기능도 있어 그 정확한 역할들이 명확하게 밝혀지지 못한 상태이다. 다만, 최근 들어 RA-CRABP-I 결합체가 cytochrome P450의 substrate인 것으로 밝혀지면서 CRABP-I이 세포내 RA를 정체시키는 역할을 하는 것으로 이해되고 있으며, 8) 그와 반대로 RA 투여 후 발현이 현격하게 증가되는 CRABP-II는 RA의 세포내 작용을 매개하는 물질로 받아들여지고 있는 추세이다.9)
RA를 인체내에 투여한 경우 항상성을 유지하려는 체내 대사 기전이 존재하여 cytochrome P450에 의해 급속히 대사되기 때문에 지속적인 농도를 유지할 수 없고, RA의 암억제 효과를 기대할 수 없는 내성이 존재하게 된다.10) RA의 체내 투여에 의해 활성화되는 cytochrome P450 계열의 효소 중 CYP26은 RA에 특이적으로 작용하는 것으로서 RA를 극성 대사물인 4-oxo-RA 또는 4-OH-RA로 변환시키는 작용을 한다.11) 저자들은 본 교실에서 배양 중인 8종류의 두경부 편평상피세포암 세포주들(AMC-HN-1∼8)을12) 이용하여 RA 투여 후 대사과정을 연구한 결과, AMC-HN-1, 2, 5, 6 세포주들에서 cytochrome P450에 의해 투여된 RA가 급격히 대사되어 대사산물이 증가하는 반면 AMC-HN-3, 4, 7, 8 세포주들에서 RA의 대사가 적음을 보고한 바 있다.13)
본 연구에서는 상기의 여덟 종류의 두경부 편평상피세포암 세포주들에서 RA 처치 후 대사의 많고 적음에 따라 RA의 효과에 차이가 있는가를 알아보고, 결합단백질들과 CYP26 등이 RA 투여 전후 어떻게 발현되는가를 비교 분석하여 두경부 편평상피세포암에서 RA의 작용 및 대사과정을 이해하고자 하였다.
대상 및 방법
세포의 배양
두경부 편평상피세포의 악성종양 환자로부터 유래한 8개 세포주의 배양은 56℃에서 30분간 불활성화시킨 10% fetal bovine serum(FBS)(GIBCO BRL, Grand Island, USA), 100units/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 0.25 μg/ml fungizone을 포함하는 minimum essential media(MEM)(GIBCO BRL)를 기본 배양액으로 하여 5% CO2, 95% air를 공급하는 37℃의 항온-항습 배양기에서 수행하였으며, 배양액은 2 일에 한번씩 교환하였다.
MTT assay
RA의 암세포 억제 효과를 측정하기 위하여 96 well plate의 1 well 당 8 종류의 세포들을 1×10 4개씩 분주하였으며 24시간동안 배양한 후 배양액을 제거하고 1 μM의 RA(Sigma, St Louis, USA)를 함유한 배양액으로 교체하였다. 이후 6일간 암실에서 배양하고 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)(Promega Corp., Madison, WI)와 phenazine methosulfate(PMS)(Promega Corp., Madison, WI)의 20：1 혼합액을 20 μl씩 첨가하였으며, 37℃ 배양기에서 90분간 배양한 후 490 nm에서의 optical density(O.D.)를 각각 측정하였다. 각 8세포주에서 8 well씩 5회 실험하였으며, 각 실험당 최소값과 최대값을 제외한 6 well의 평균치를 구하고 5 회 실험의 평균치를 산출하였다. RA를 처치하지 않은 well의 측정치를 100%의 대조군으로 삼아 RA 처치 후 well의 O.D. 값을 세포의 survival fraction(%)으로 환산하였다.
RT-PCR(역전사 중합효소연쇄반응)
각각의 세포주에서 RA 투여 전후의 결합단백질 및 CYP26의 발현 양상을 분석하기 위하여 역전사 중합효소연쇄반응을 시행하였다.
Total RNA 분리
100×15 mm culture dish에 세포를 분주하여 80% confluent 상태에 도달하면 1 μM의 RA를 처리한 세포주와 RA 처리 직전의 세포주를 1일간 배양하여 각각의 total RNA를 분리하였다. 세포를 4℃의 Dulbecco's phosphate buffered saline 15 ml로 세척한 후 1 ml의 Trizol reagent(GIBCO BRL)를 넣고 rubber-policeman scraper로 세포를 모았으며, 0.2 ml chloroform을 첨가하여 혼합시킨 후 4℃, 14,000 rpm으로 원심분리하여 상층액(aqueous phase)을 얻었다. 동정된 상층액에 동량의 isopropanol을 추가하여 얼음에 15분동안 방치하였으며 동일 조건으로 다시 원심분리하여 RNA의 침전물을 얻은 후 75% ethanol로 세척하여 DEPC-treated water에 용해시켰다. 용해된 RNA는 spectrophotometer(Parmacia, Uppsala, Sweden)로 260 nm 및 280 nm의 O.D.값을 측정하여 순도와 용량을 평가하였다.
역전사 반응
총 5 μg의 RNA와 1 μl의 oligo-dT 18 primer(0.5 μg/μl)(MBI, Graiciuno, Lithuania)를 혼합하고 반응액 총량이 11 μl로 되도록 deionized water를 첨가한 후 70℃에서 가열하여 denaturation시켰다. 반응액에 5x reation buffer(MBI) 4 μl, Ribonuclease(20U/μl)(MBI) 1 μl, 10 mM dNTP mix(MBI) 2 μl 등을 혼합하여 상온에서 5분간 방치하고 M-MuLV reverse transcriptase(20 U/μl)(MBI) 2 μl를 첨가하여 37℃에서 1시간동안 역전사 반응을 시켰다. 반응물을 70℃에서 10분간 가열한 후 얼음에서 급속히 냉각하여 반응을 중지시킨 다음 역전사 중합효소연쇄반응의 template로 사용하였다.
역전사-중합효소연쇄반응
반응액 총량을 20 μl로, 1 μl cDNA에 10x buffer 2 μl, 2mM dNTP(GIBCO BRL) 1 μl, 각각의 primer 20pmole(Bioneer 제작)(Table 1), AmpliTaq DNA polymerase(MBI) 2units를 혼합하여 thermal cycler(BIO-RAD)에서 역전사-중합효소연쇄반응을 시행하였다. 사용한 primer들의 염기서열과 반응물의 size는 Table 1에, 반응 조건들은 Table 2에 제시하였다. 제작된 cDNA들의 정량적 동일성을 확인하기 위하여 내부대조군으로 human β-actin에 대한 역전사-중합효소연쇄반응을 시행하였으며 각각의 반응에 음성대조군으로는 증류수를 사용하였다. 반응물은 size marker(100 bp ladder)와 함께 1.8% agarose gel에서 100 V, 70 mA로 전기영동한 후 자외선 상에서 판독하고 Polaroid 사진 촬영으로 결과를 남겼다.
결과
MTT assay(Fig. 1)
RA 처치 후 세포주 AMC-HN-1, -2, -5, -6에서는 세포수의 감소가 적었으며, AMC-HN-3, -4, -7, -8에서는 세포수가 큰 폭으로 감소되었다.
RT-PCR(Fig. 2)
β-actin의 발현
총 8종류의 세포주들로부터 제작된 cDNA들에서 중합효소연쇄반응 결과, 내부대조군으로 사용된 β-actin에 균일하게 양성을 나타냄으로써 기타 primer 들에 대한 중합효소연쇄반응의 template로 사용하여 정량적 비교 분석을 하기에 적합한 것으로 판명되었다.
CRBP-I의 발현
RA 처치 전 AMC-HN-3, -4, -5, -7, -8에서 발현되었고 AMC-HN-1, -2, -6에서는 음성 반응을 보였다. RA 처치 후에 AMC-HN-4, -5, -7, -8에서는 발현 강도가 증가됨을 보였다.
CRABP-I의 발현
RA 처치 전 AMC-HN-1, -2, -3, -4, -6에서 발현되었고 AMC-HN-5, -7, -8에서는 음성 반응을 보였다. RA 처치 후에 AMC-HN-1, -2, -3, -4, -6 모두에서 발현이 소실되었으며, 발현이 없었던 AMC-HN-7, -8에서는 새로운 발현이 나타났다.
CRABP-II의 발현
RA 처치 전 8개의 모든 세포주들에서 발현되고 있었으며, RA 처치 후 AMC-HN-1, -2, -3, 4, -5, -6에서 발현 강도가 증가되었고 AMC-HN-7, -8에서는 발현 강도의 차이가 없었다.
CYP26의 발현
RA 처치 전 및 처치 후에 AMC-HN-1, -2, -4, -5, -6, -7에서 발현되었고 AMC-HN-3, -8에서는 음성 반응을 보였다. RA 처치 후에 AMC-HN-2, -5, -6, -7에서 발현 강도가 증가됨을 보였다.
고찰
RA의 암억제 효과가 알려진 후 임상적 적용을 위하여 in-vivo와 in-vitro로 많은 연구들이 진행되었으나 대상 암세포마다 반응의 정도가 일정하지 않다는 제한점이 나타났다. 환자들에게 투여한 경우에는 RA의 혈중농도의 유지가 어렵다는 점, 약효와 부작용이 발생하는 농도의 수준이 개개인마다 다양하다는 점, 그리고 투여를 중단한 경우 다양한 정도의 암 재발이 나타난다는 점 등이 문제로 제기되었다.14) 보고된 바와 같이 RA의 대사는 전사 조절에 의해 새로이 동원된 cytochrome P450에 의해 이루어지는데,15) 암세포마다 RA에 의한 cytochrome P450의 발현정도에 차이가 있음으로 인해 이러한 다양한 반응 차이가 존재하는 것이다.
저자들이 시행했던 연구 결과에서도 AMC-HN-1, 2, 5, 6 세포주는 RA를 쉽게 대사시키는 반면, AMC-HN-3, 4, 7, 8 세포주는 RA 투여 후 대사가 지연되는 것을 관찰할 수 있었는데,13) 그 이유로 몇가지를 추론해 볼 수 있다. 첫째, cytochrome P450을 발현하는데 필요한 특정 감수체가 결여되어 있을 수 있겠고 둘째, protein kinase C를 활성화시키는 기능이 저하되어 있을 가능성이 있다.16) 셋째, 이 세포주들에서 RA 대사에 필요한 cytochrome P450의 gene이 손상 또는 결손되어 있거나 cytochrome P450의 mRNA를 안정화하는데 필요한 요소들에 문제가 있을 수도 있다.17) 넷째, 이 세포주들에 대사에 필요한 RA의 결합단백질이 존재하지 않을 가능성도 있으며 다섯째로는, 우리가 아직까지 알지 못하는 미지의 대사경로 중 어느 한 곳에 결손이 있을 수 있다.
Retinoid의 흡수, 이동, 세포내 작용에는 여러 가지 결합단백질들의 역할이 필요한 것으로 알려져 있는데, 이는 hydrophobic 형질의 retinoid가 hydrophilic 환경에서 그 역할을 수행하기 위한 필연적인 과정으로 볼 수 있다. CRBP-II는 장내에서 retinoid를 순환계로 흡수하는 시기에만 작용을 하는 물질인 반면,18) 세포내 retinoid 저장 및 RA 합성에 필수적인 역할을 하는 것이 CRBP-I으로서, CRBP-I이 존재해야만 동원된 retinoid로부터 RA를 합성하고 이용할 수 있다.19) 합성된 RA의 작용과 대사에 직접적인 관여를 하는 CRABP는 RA를 핵막으로 이동시키는 매개체 역할을 하는 것으로 초기에 이해되었으나,20) 이후 연구들에서 CRABP-I은 RA를 세포질내에 정체시켜 CYP26에 의한 대사경로로 이끄는 역할을 주로 수행하는 것으로 판명되었다.8) 반면, 최근의 연구에서 RA의 투여에 의하여 CRABP-II의 발현이 증가되는 것과 더불어 CRABP-II의 억제에 의하여 RA의 효과가 감소됨이 밝혀짐으로써, RA의 대사보다는 세포내 작용에 주된 역할을 하는 물질이 CRABP-II인 것으로 알려져 있다.9)
1992년 Busch 등은 피부각질세포에 RA를 도포하여 CR-ABP-I의 발현이 감소하고 CRABP-II의 발현이 증가함을 보고하였다.21) CRABP-II는 CRABP-I에 비하여 분포 정도가 미약하고 RA와의 Kd(equilibrium dissociated constant) 값이 현저히 높아 보통의 상태에서 RA와 주된 결합을 이루는 유형은 CRABP-I인 것으로 알려져 있다. 19) CR-ABP-II가 RA의 작용을 돕는 기전이 어떻게 이루어질 것인가에 대하여 많은 연구가 있었고 현재까지 논란의 여지가 있는 상태인데, RA의 작용이 필요한 세포에 RA가 투여되면 CRABP-I의 발현이 감소함으로써 RA의 농도를 증가시키는 positive feedback 효과가 나타나고, 증가된 RA의 농도에 의하여 CRABP-II의 발현이 유발되며 RA와 CRABP-II와의 결합이 가능해지는 것으로 추측되고 있다.19)21)
매우 복잡하고 다양한 경로가 있어 지금까지 알려진 물질들만으로는 RA의 세포내 작용 및 대사를 일관성 있게 설명할 수 없지만, 우선 저자들은 본 연구를 통하여 두경부 편평상피세포암에서의 CYP26 및 결합단백질들의 역할을 추정해 보고 여러 가지 종류의 세포들을 이용한 기존의 연구들과 비교 분석해 보고자 하였다.
결과에 제시한 바와 같이, RA의 투여 후 cytochrome P450의 대사산물이 큰 폭으로 증가하였던 AMC-HN-1, 2, 5, 6 세포주들에서 RA 처치의 효과가 적게 나타남으로써, RA의 세포내 작용이 cytochrome P450의 대사정도에 직접적인 영향을 받는 것이 입증되었다. 한편, CYP26은 RA 투여 전 RA의 대사가 활발히 진행되는 4개의 세포주들 모두에 발현되고 있었으며, 그 중 3개에서 RA투여 후 발현이 증가되었는데, 이 결과로 보아 CYP26이 두경부 편평상피세포암에서 RA의 대사에 직접적으로 관여하는 cytochrome P450의 유형임을 시사한다고 생각된다.
본 연구 결과, 다른 연구들에서 알려진 바와 같이 RA 처치 후 CRABP-I의 발현은 감소하고 CRABP-II의 발현은 증가하는 것으로 나타났다. 따라서 두경부 편평상피세포암에서도 CRABP-I과 II가 서로 상이한 고유의 역할을 수행하는 것을 알 수 있다. 다만, AMC-HN-7 및 -8 세포주에서는 RA 처치 전에 보이지 않았던 CRABP-I의 발현이 RA 처치 후 나타났고, CRABP-II의 발현이 RA 처치 후 증가하지 않는 양상을 볼 수 있었다. 이에 관하여는 여러 가지 해석이 있을 수 있겠으나, 아직까지 밝혀지지 않은 세포내 기전들이 존재하여 RA의 결합단백질들에 대한 단순하고 일괄적인 해석이 허용될 수 없음을 반영하는 결과라고 생각한다.
CRBP-I은 순환계를 통하여 세포질내로 흡수된 retinol이 retinal을 거쳐 RA로 산화되는 과정에 필수적인 단백질이다.18) 따라서 CRBP-I이 결손된 세포에서는 섭취된 retinoid로부터 RA를 합성할 수 없고 그 작용을 기대할 수도 없다는 사실을 알 수 있다. 본 연구에서는 세포에 직접 RA를 처치하였기 때문에 CRBP-I의 직접적인 역할이 필요하지 않았지만 CRBP-I의 존재 유무가 RA에 대한 반응성을 반영할 것임을 추측할 수 있다. 연구 결과 RA에 민감한 세포주들에서 주로 CRBP-I의 발현이 나타남을 관찰할 수 있었기에 두경부 편평상피세포암에서 CRBP-I의 존재가 RA의 효과를 예측할 수 있는 지표가 될 수 있는 것으로 판단되었다.
결론
두경부 편평상피세포암 세포주들을 이용한 연구 결과, 투여된 RA의 세포내 작용이 RA의 대사 정도에 좌우되는 것으로 나타났으며 RA의 대사에 CYP26이 직접적으로 관여함을 확인할 수 있었다.
CRABP-I은 RA의 투여에 의해 발현이 감소하는 것으로 나타나 RA의 작용 항진을 위한 반응으로 해석되며, RA의 투여에 의해 발현이 증가되는 CRABP-II가 RA의 세포내 작용을 위한 매개 역할을 수행할 것으로 추측된다. CRBP-I은 RA에 민감한 세포주들에서 주로 분포되어 있는 것으로 나타나 두경부 편평상피세포암에서 CRBP-I의 존재 유무가 RA의 감수성을 판별하는 기준이 될 수 있을 것으로 생각된다.
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