서     론

   알레르기성 비염과 비알레르기성 비염을 포함한 만성비염은 흔한 이비인후과 질환 중의 하나로 점액의 과분비는 이러한 비염의 중요한 증상이다. 비즙은 분비선으로부터 분비되거나 비점막의 혈관계로 부터 유출되어 생성된다. 분비선과 혈관 주위의 조밀한 신경분포는 비즙 분비를 포함하여 코 기능을 조절하며, 이러한 신경분포에는 교감신경계, 부교감신경계 및 감각신경의 c-신경섬유가 관여한다. 감각신경은 P-물질, calcitonin gene-related peptide(CGRP), 및 neurokinin A를 분비하여 신경성 염증을 일으킨다.¹⁾ 인간과 동물의 비염 모형에서 여러가지의 화학적 혹은 기계적인 자극은 비즙을 분비한다. 특히 capsaicin같은 자극제를 국소적으로 투여하거나 역방향성으로 전기자극으로 감각신경을 자극시키면 신경 말단에서 P-물질 등과 같은 신경단백을 분비하여 혈관투과성, 혈장의 혈관외유출과 조직 부종 등이 나타나며, 이러한 혈장의 혈관외유출은 atropine에 반응이 없고, 감각신경 c-신경섬유에 의하여 매개된다. 혈류와 혈관투과성은 신체의 여러 부위에서 감각신경 c-신경섬유에 의하여 매개된다.²⁾ 산화질소는 감각신경의 c-신경섬유의 신경단백의 유리에 중요한 매개체로 혈관 평활근과 내피세포에 영향을 준다.³⁾ 또한 산화질소합성효소는 감각신경의 c-신경섬유, 분비선, 혈관 및 상피세포에 분포한다고 알려져 있다. 비록 코에서의 산화질소의 기능은 잘 알려져 있지 않지만, 비점막에서의 산화질소 합성효소의 분포와 다른 기관에서의 산화질소의 혈관분포는 비즙 분비에 산화질소가 중요하다는 것을 암시한다.
   Lane 등⁴⁾은 백서에서 히스타민에 의한 혈관투과성을 관찰한 실험에서 산화질소가 혈관투과성에 관여한다고 보고하였고, Yoshida 등⁵⁾은 전기 자극에 의한 부교감 신경에 의하여 유발된 고양이 비점막에서 신경성 혈장의 혈관외유출은 콜린성 섬유신경보다는 산화질소에 의하여 매개된다고 보고하였다. 한편 capsaicin에 의한 혈관에 대한 효과는 산화질소 합성효소 억제제에 의하여 영향을 받지 않는다는 보고⁶⁾도 있어 이를 확인하고자 혈관투과성을 관찰하는 방법으로 바꾸어 실험하였다. 저자들은 산화질소합성효소를 억제하는 약제를 사용하여 capsaicin에 의해 유발된 신경성 염증에서 내재성 산화질소가 혈장의 혈관외유출에 영향을 미치는지를 알아보고자 Evans blue와 Monastral blue를 이용한 혈관 투과성을 관찰하는 방법으로 본 연구를 시행하였다.

재료 및 방법

실험동물

   감염이 없는 Sprague Dawley계 흰쥐(200-300 g)를 이용하여 실험을 하였다. Capsaicin(Sigma, St. Louis, MO) 50 mM, 50 μl을 비강에 점비하여 신경성 염증을 일으킨 흰쥐(6마리)를 대조군으로 하였다. Evans blue 추출량의 검색을 위하여 실험군은 2군으로 분류하였다. 제 1군은 산화질소합성효소의 생성을 억제하기 위하여 산화질소합성효소의 경쟁적 억제제인 N^w-nitro-L-arginine(Sigma, St. Louis, MO, 이하 L-NNA로 약함)을 각각 1 mg, 5 mg, 10 mg/kg을 정맥 주사하여 전처치한 군으로 하였고(각각 6 마리), 제 2군은 L-NNA 10 mg/kg투여 후 L-NNA의 영향을 극복하기 위하여 산화질소합성효소의 기질(substrate)인 L-arginine(Sigma, St. Louis, MO)을 50 mg/kg을 연속적으로 정맥 주사하여 투여한 군(6마리)으로 나누어 실험을 시행하였다. Monastral blue에 의한 percent 면적밀도의 검색을 위하여 제 1군은 L-NNA(10mg/kg)을 전처치 한 군(6마리), 제 2군은 L-NNA(10mg/kg)투여후 L-arginine(50 mg/kg)을 연속적으로 투여한 군(6마리)으로 하였다.

약제의 투여
   Urethane(Sigma, St. Louis, MO) 25% w/vol으로 희석하여 6~8ml/kg을 복강내 주사로 마취시킨 상태에서 경정맥으로 삽관하여 약제나 수액을 투여하였다.

형광현미경 관찰
   Evans blue가 혈장의 혈관외 유출 형태를 관찰하기 위하여 각 약제를 전처치한 후 도살하여 채취한 비중격 점막을 10% 포르말린과 인산완충용액 (0.1M, pH 7.4)에서 2시간, 인산완충식염수와 5% 자당을 혼합한 용액에서 24시간 냉장보관 후에 20 μl두께로 냉동 절편을 만들어 글리세린과 인산완충식염수를 3:1로 섞은 용액으로 봉입하여 형광현미경(Olympus, Venox, Japan)으로 430nm 파장으로 관찰하여 적색의 형광 물질을 나타내는 범위를 대조군과 비교하여 검색하였다.

Evans blue 추출량 측정

   신경성 염증의 정도를 측정하기 위하여 혈장 단백과 결합하여 혈장의 투과 정도를 간접적으로 나타내는 Evans blue(30 mg/kg, Sigma, St. Louis, MO)를 경정맥을 통하여 주입하고 5 분후에 비강내에 capsaicin을 점비하였다. 5분후 흉부를 절개하여 카테타를 좌심실을 통하여 대정맥에 삽입하고 생리식염수 300cc/kg로 심장을 경유하여 관류하였다. 비중격 점막을 채취하여 무게를 측정하고 formamide(Sigma, St. Louis, MO)2 ml에서 40°C, 24시간 보관하여 Evans blue dye를 조직으로 부터 추출하여 620nm의 분광광도계(Hitachi, U-2000 spectrophotometer)로 측정하였고, 추출된 Evans blue dye양은 농도 0.15~12 μg/ml의 Evans blue dye 분광표준곡선을 이용하여 조직 무게당 추출된 Evans blue dye양(ng/mg)으로 비점막의 혈관투과성의 정도를 비교하였다.

Monastral blue 투과성 측정

   혈관을 표식하는 방법에 사용되는 교질물질인 Monastral blue(copper phthalocyanine, Sigma, St. Louis, MO)를 sonification시켜 3% 수용액을 만들어 흰쥐의 경정맥을 통하여 0.1ml/100g을 주입하였다. Monastral blue투여 후 5 분에 capsaicin을 점적하고 2 분후에 희생시켜 비강 점막을 채취하여 whole mount 하에서 정량적인 혈관 투과도를 Aherne및 Dunhill의 방법⁷⁾에 따라 형태학적으로 측정하였다. Buffon의 "needle problem" 관계에 기초하여 수평 10개와 수직 10개의 직교하는 검사 격자(test grid)에서 교차하는 혈관수를 계산하여 각 검사 영역의 혈관 전장을 계산함으로써 Monastral blue로 염색된 밀도를 구하였다. 비점막 각 부위로 부터의 검경과 밀도검사는 10개 검체로 부터 각각 10개의 다른 영역에서 시행하였다. 100배 광학 현미경하에서는 교차하는 혈관수가 많으며 검사 격자 내에만 존재하는 혈관이 많아 200배 광학 현미경하에서 측정하였다. 각 검체의 측정은 비중격 전방 1/3 부위 총 50개의 영역에서 측정하여 그 평균치를 구하였다.

통계 분석

   모든 자료는 Macintosh용 통계프로그램인 StatView(Abacus Concepts Inc., Berkeley, CA)를 이용하여 mean±SE로 나타내고, 각 군간의 비교는 ANOVA test로 시행하였으며 P<0.05를 통계적 의미로 두었다.

결     과

형광현미경 관찰
   L-NNA(10 mg/kg)로 전처치한 군은 capsaicin만을 점비한 대조군에 비하여 적색의 형광 물질이 적게 관찰되었다(Fig. 1).

Evans blue 추출량
   Evans blue추출량은 대조군에 비하여 L-NNA을 1, 5, 10 mg/kg으로 전처치한 군에서는 용량의존성으로 유의하게 감소하였다(p<0.01, Fig. 2). 또한 L-arginine을 동시에 전처치한 군에서는 L-NNA를 단독 투여한 군에 비하여 Evans blue추출량은 유의하게 증가하였다(p<0.01, Fig. 3).

Monastral blue 투과 관찰

   광학현미경으로 관찰한 사진에서는 L-NNA를 전처치한 군이 대조군에 비하여 침착된 색소가 감소하였다(Fig. 4).

Monastral blue 투과성 측정

   혈관에 주입된 Monastral blue는 혈관벽내의 근육 속에서 관찰되며 형태학적인 측정 결과 비점막 면적 mm2 당 Monastral blue로 염색된 혈관의 길이(mm)로 표시된 혈관의 밀도로 표시하였다. Monastral blue가 침착된 혈관의 밀도는 capsaicin만을 투여한 대조군에서 비하여 L-NNA(10mg/kg)로 전처치한 군에서 유의하게 감소하였으며(p<0.01, Fig. 5), L-arginine (10mg/kg)를 동시에 전처치한 군에서는 L-NNA만을 투여한 군에 비하여 증가하였다(p<0.01).

고     찰

   본 실험은 capsaicin에 의해 유발된 백서 비점막의 신경성 염증에서 산화질소합성효소 억제제인 L-NNA로 내재성 산화질소 생산을 억제시키면 혈장의 혈관외 유출량이 용량의존적으로 감소하였고, L-NNA 의 영향을 극복하기 위하여 L-arginine을 동시에 투여하여 산화질소의 생산을 증가시키면 혈장의 혈관외 유출량이 증가하여 혈장의 혈관외 유출은 내재성 산화 질소에 따라 영향을 받음을 보여주었다.

   산화질소는 반감기가 짧아 조직에서 산화질소량을 직접 측정하지 못하므로, 산화질소합성 억제효소를 사용하여 산화질소 영향에 대하여 간접적인 방법으로 측정할 수 있다. 산화질소합성억제제인 L-NNA는 L-arginine와 동족체로써 L-arginine로부터 산화질소합성효소에 의해 산화질소가 합성될 때 L-arginine과 경쟁적으로 산화질소합성효소와 결합하여 산화질소의 합성을 억제한다. 본 실험에서는 L-arginine 유도체로서 산화질소의 합성을 선택적으로 억제하는 L-NNA를 사용하였으며, 1~10mg/kg로 용량이 증가함에 따라 혈장의 혈관외유출은 용량의존성으로 유의하게 감소하였다. 또한 L-NNA에 의해 억제된 혈장의 혈관외 유출은 L-arginine을 동시에 투여하여 산화질소 생산을 증가시킨 군에서는 유의하게 증가하였다. 따라서 내재성 산화질소가 흰쥐의 비점막에서 신경성 염증에서 혈장의 혈관외유출에 중요한 역할을 하고 있는 것으로 생각된다. 산화질소가 혈장의 혈관외유출에 미치는 영향에 대하여는 Crone⁸⁾은 배양된 내피세포에서 산화질소는 혈관투과성을 증가시키고, Hughes등⁹⁾은 흰쥐 피부조직에서 산화질소합성효소를 억제시켜 산화질소의 생성을 감소시키면 혈관을 수축시켜 혈장의 혈관투과성이 된다고 하였다. 최근에는 신경성 혈장유출에 대한 L-NNA의 억제 효과는 기도의 미세 혈관 내피세포로 부터 방출되는 P-물질 유발 내재성 산화질소에 의하여 조절되는 것으로 보고되어져 왔다. Lane등⁵⁾은 백서를 이용하여 비점막을 히스타민으로 자극한 실험에서 산화질소가 혈관투과성을 증가시키는 nasonasal 반사 원심경로의 중요한 매개체로 작용하여 산화질소가 신경성 염증에서 혈관투과성을 증가시킨다고 하여 저자들의 결과와 같은 결과를 얻었다. 반면 Forstermann등¹⁰⁾은 산화질소합성효소 억제제를 사용하면 혈관의 투과성이 증가된다고 보고하여, 혈관 투과성에 대한 산화질소의 작용은 아직 논란이 많다.
   고추 가루의 매운성분인 capsaicin을 비점막에 투여하면 P-물질이 감각신경으로부터 소실되면서 혈관확장 및 혈장투과성을 증가시킨다. 본 실험에서는 capsaicin으로 혈장의 혈관외유출을 유발시켜 Evans blue로 측정한 혈장의 투과성은 유의하게 증가하였다. P-물질이 신경성 염증반응에 작용하는 기전은 아직 확실치 않으나 P-물질이 비만세포에 연결되어 있어 지각신경을 capsaicin 혹은 전기적으로 자극하면 비만세포가 탈과립되어 방출된 화학전달물질이 P-물질의 수용체와 모세혈관후소정맥(postcapillary venule)에 작용하여 혈관투과성을 항진시킨다고 알려져 있다.¹¹⁾
   혈관 투과성을 측정하는 방법으로 분자 무게가 60kD의 Evans blue dye를 이용할 수 있는데, 신경성 염증으로 혈관의 혈장투과시 Evans blue dye는 혈장 알부민과 밀접하게 결합하여 혈관으로부터 조직내로 알부민과 함께 유출되므로, 혈액내 존재하는 Evans blue dye를 제거하면 결국 조직이나 기도내 존재하는 양으로 신경성 염증의 정도를 측정할 수 있다. 또한 Evans blue dye가 형광을 띄는 것을 이용하여 형광현미경으로 염증을 관찰할 수 있다. 그러나 이러한 방법은 혈관외유출 위치를 정확하게 국재화할 수 없다는 단점이 있다. 그러나 약 200 μm 크기의 Monastral blue 입자는 염증 자극에 반응하여 venule 내피 사이의 틈(gap)을 통하여 혈관 밖으로 유출되어 기저판에서 걸려 혈관외유출 장소를 표식할 수 있다. 본 실험에서는 침착된 Monastral blue의 혈관 밀도를 측정한 결과 Evans blue와 비교하여 같은 결과를 얻었다.
   본 실험에서는 capsaicin에 의한 신경성 염증에서 내재성 산화질소가 신경성 염증을 조절하는 것으로 관찰하였으나, capsaicin으로 유발된 비점막의 신경성 염증에서 산화질소가 신경말단에서 유리되는지, 또는 혈관내피세포에서 유리되는지에 관해서는 지속적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.

결     론

   흰쥐의 비점막에서 capsaicin의 비강내 점비로 신경성 염증이 유발되었고, 내인성 산화질소는 신경성염증에서 혈장의 혈관외유출을 조절하는 것으로 생각된다. 따라서 산화질소의 작용 기전을 밝힘으로써 비점막 과민증의 새로운 치료제를 유도할 수 있을 것으로 생각한다.

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