서     론

   Epstein-Barr virus(EBV)는 Epstein에 의해 Burkitt씨 림프종 세포에서 처음으로 발견된 이중 나선형의 DNA virus로서 150~180 nm의 크기이며, 175 KD의 염기쌍으로 구성되어 있고, Herpes virus에 속한다. EBV의 자연숙주는 인간에 국한되어 있으며 감염자의 타액에 의하여 다른 사람에게 감염되고, 구인두에서 시발감염을 일으켜서 타액선 그리고 인두의 상피세포와 림프계 조직에서 바이러스 증식이 일어난다. EBV의 공격세포는 주로 림프계 세포 특히, B림프구를 공격하며 또한 인두의 상피세포를 공격한다. EBV는 전염성 단핵구증, Burkitt씨 림프종, 비호지킨스(Non-Hodgkin's) 림프종 및 호지킨스(Hodgkin's) 림프종의 유발에 관여하며, 두경부 종양중 비인두의 미분화 암종에서는 거의 100% 검출되고, 비인두의 편평세포암종에서 25~72%, 비인두외의 두경부암에서도 0~68.2%에서 검출되었다.¹⁾ 두경부는 해부학적 특성상 암 유발원인에 동시에 노출되므로 두경부 각 부위는 같은 원인에 의해 암이 유발될 수 있다는 점에서 두경부에 발생하는 악성종양에서 EBV와의 관계를 밝히려는 노력이 분자생물학 및 의용전자공학을 이용하여 시도되었으나, 비인강암을 제외한 두경부 영역의 암과 EBV와의 관계에 대한 연구는 미흡한 실정이다.
   이에 저자는 후두에 발생한 편평세포암종으로 진단된 65례를 대상으로 면역조직화학적 방법을 이용하여, EBV의 존재 유무를 관찰하여 후두 편평세포암종과 EBV와의 관련성을 규명하고자 본 연구를 시행하였다.

대상 및 방법

대  상
  1991년 1월부터 1999년 1월까지 조선대학교 부속병원 이비인후과에 내원하여 병리 조직학적으로 후두 편평세포암종으로 진단된 조직표본 중에서 보관상태가 양호하고 파라핀에 포매되어 보관중인 65례를 대상으로 하였다. 남녀 비는 59：6 이였으며, 연령별 분포는 37세부터 89세로 평균연령은 61.4세였다. 원발부위는 종양의 중심부를 기준으로 구분하였을 때 성문상부 28례, 성문부 37례 이었다. 원발병소, 경부 림프절 전이, 원격전이 등을 이용한 임상적 병기는(미국 암협회 분류：AJCC TNM classification, 1997) 제 1 기 9례, 제 2 기 4례, 제 3 기 18례, 제 4 기 34례이었다.
  대조군으로는 후두용종으로 진단되어 후두 미세현미경 수술을 시행 받았던 환자의 조직표본 중 크고, 보관상태가 양호한 20례를 대상으로 하였다.

방  법

광학 현미경적 검색
   광학현미경 검색상 후두 편평세포암종으로 확진된 증례를 선택하여 해당 파라핀 블록을 찾아 염색을 시행하였는데, 검체는 10% 중성 포르말린에 고정후, 파라핀에 포매되어 보관중인 조직을 4~5 μm 두께의 연속절편을 만들어 이중 한 절편을 Hematoxyline-Eosin(H-E) 염색을 하여, 이미 제작되어 있는 H-E 염색 표본과 같이 검토하였고, 2개의 표본에서 종양세포를 확인하여, 병리학적 분화도를 판정한 후 고분화형, 중등도 분화형, 그리고 저분화형으로 분류하였다.

면역조직화학적 염색
   EBV에 대한 면역조직화학적 염색은 silanized slide(DAKO corp. U.S.A.)에 부착시킨 연속절편을 탈파라핀과 함수과정을 거친 후 HISTOSTAIN SP kit(ZYMED Laboratories Inc. U.S.A.)을 사용하여 통상적인 peroxidase labeled avidin-biotin(LAB-SA)법으로 염색하였다. 내인성 과산화 효소의 활성화를 억제시키기 위하여 무수알콜과 3% 과산화수소를 9：1로 혼합한 용액에 10분간 반응시킨 후 phosphate-buffered saline(PBS, pH 7.4)에 3회 세척하였다. EBV염색을 위한 슬라이드는 10 mM, pH 6.0 citrate buffer에 담근 상태로 750 watt micro-wave oven에 5분간 3회 가열하여 PBS로 세척하였다. 1차 및 2차 항체에 대한 비특이적 결합을 억제하기 위해 10% 염소혈청에 10분간 처리한 후 1차 항체로 90분간 반응시켜 PBS로 3회 충분히 씻었다. 사용된 EBV에 대한 1차 항체는 EBV의 latent membrane protein에 결합하는 monoclonal mouse anti-human EBV protein(DAKO Corp. U.S.A.)을 PBS와 1：50으로 혼합하여 사용하였다. Biotin과 결합된 2차 항체를 가하고 10분간 반응시켜 PBS로 씻은 후 streptavidin-peroxidase와 반응시켜 PBS로 세척한 뒤 과산화효소의 기질액인 과산화수소와 발색제인 AEC(3-amino-9-ethylcarbazole)에 10분간 반응시켜 정색반응을 확인한 후 Mayer's hematoxylin으로 대조염색하여 GVA-mount로 봉입하였고, 음성 대조용으로는 염색시 1차 항체 대신 PBS만을 도포시켜 염색한 표본을 사용하였다.

면역조직화학적 염색의 검토
   염색의 평가는 주관성을 어느정도 배제하기 위해 해부병리 전문의의 도움으로 시행하였다. EBV에 대한 염색의 판정은 1000개의 종양세포를 기준으로 관찰하여 세포핵안에 적색으로 염색된 과립이 집단으로 있는 경우를 양성으로, 수개의 종양핵만 염색되거나 염색이 안된 경우를 음성으로 판정하였다.

통계학적 검증
   후두 편평세포암종과 정상조직의 EBV 발현정도를 비교하고, 원발 병소의 병기, 부위, 분화도 및 경부림프절전이 여부에 따른 발현율을 비교 하였다. 이들의 연관성 여부에 대한 통계학적 검증은 Chi-square test를 시행하였으며, 유의수준은 p<0.05로 정하였다.

결     과

   면역조직화학적 염색을 이용한 EBV의 검출 결과는 후두 편평세포암종 65례 중 26례(40%)에서 양성 반응을 관찰할 수 있었고(Fig. 1), 대조군 20례중 2례(10%)에서 EBV가 검출되어 통계학적으로 의의가 있었다(Fig. 2)(p<0.05). 임상적 병기에 따른 EBV의 검출율은 제 1 기와 제 2 기의 조기암 군에서는 13례중 4례(30.8%), 제 3 기와 제 4 기의 진행암 군에서는 52례중 22례(42.3%)가 검출되었다. 종양의 발생부위에 따른 검출율은 성문상부암은 28례중 13례(46.4%), 성문암은 37례중 13례(35.1%)에서 검출되어, 성문상부암 및 진행암군에서 EBV의 검출율이 높았으나 통계학적인 의의는 없었다. 병리조직학적 분화도와 검출율의 관계는 고분화암이 38.6%, 중등도 분화암이 47.4%이었으며 미분화암에서는 검출되지 않았다. 연령과의 관계에서는 60세 이상 군에서 40.5%, 60세 미만 군에서는 39.3%의 검출율을 보였다. 경부림프절전이 유무에 따라 비교하여 보면 경부림프절 전이가 있었던 군이 38.7%, 경부림프절 전이가 없었던 군이 41.2%의 EBV 양성율을 보여 나이 및 경부림프절전이 유무에 따른 검출율의 차이는 통계학적인 의의를 보이지 않았다(Table 1).

고     찰

   후두암은 우리 몸에 발생하는 암의 약 1.2%를 차지하며, 이비인후과 영역에서 발생하는 암의 25%를 차지하고, 주로 60대에 발생한다. 발병률은 5~10배 정도 남자에 많아 과거에는 남녀비가 15：1 이였으나, 최근에는 남녀비가 4：1로서 여성의 발생율이 증가하는 추세이다.²⁾ 후두암의 원인으로는 인종이나 가족력등의 유전적인 요인, 흡연, 음주, 인유두종 바이러스, 방사선치료의 과거력 등³⁾이 알려져 왔으나, 최근 10년간 젊은 세대 및 여성에서 발병율이 증가하고 있는데, 그 이유로 여성의 흡연인구와 간접흡연의 증가 그리고 발암의 위험이 있는 작업환경과 사회 활동에 대한 노출이 증가되었기 때문인 것으로 생각된다.
   Epstein-Barr 바이러스는 인형 헤르페스 바이러스, 제 4 형 바이러스 또는 lymphocryptovirus 라고도 불리우는 DNA 바이러스로서 지금까지의 연구결과에 의하면, 단핵세포증가증, Hodgkin 림프종, 말초 T세포 림프종, 장기이식환자에서 발생한 림프종 등의 림프증식성 질환⁴⁾외에 비인두암종, 구강의 모반백반과도 관련이 있는 것으로 알려져 있고, 대부분의 전염성 단핵구증 환자, 면역억제제를 투여받고 있는 환자의 50%이상 그리고 EBV 항체 양성인 건강인의 20% 이상에서 타액에 존재한다고 보고되고 있다.⁵⁾ 최근 흉선, 타액선, 폐, 자궁 경부, 피부, 위, 이하선 등에서 발생한 림프상피종양 암종(lymphoepithelioma-like carcinoma)에서도 EBV의 유전자 발현이 확인되었다.⁶⁾
   EBV의 공격대상 세포는 주로 림프계 세포 특히, B림프구를 공격하며, 또한 인두의 상피세포를 공격하는 것으로 알려져 있는데, 실험실 조건하에서는 특정 세포에만 감염시킬 수 있다. EBV의 자연숙주는 인간에 국한되어 있으며, 감염자의 침샘에 잠복하여 있어 보균자는 침으로 감염성 바이러스를 계속 배출하게 되고, 감염 받을 경우 구인두에서 시발감염을 일으켜서, 타액선 그리고 인두의 상피세포와 림프계 조직에서 바이러스 증식이 일어난다.⁷⁾ EBV의 감염기전에 대하여는 확실하게 증명된 사실은 없지만 B림프구의 표면에 존재하는 CD21 수용체를 통하여 이루어진다고 알려져 있으며, 이 수용체는 B림프구에 국한되어 존재하지 않고 상피세포의 6%에서 존재한다고 보고되고 있는데, 이러한 CD21 수용체의 제한적인 분포때문에 EBV는 숙주세포에 대하여 제한적으로 감염을 유발한다.⁷⁾ EBV 감염후 감염세포의 불멸화과정(immortalization process)은 여러종류의 EBV 유전자 산물에 의해 이루어 지는데, 6개의 핵항원(EBNA 1, 2a, 3a, 3b, 3c, 5)과 2개의 latent membrane protein(LMP 1, 2,)이 EBV와 관련된 악성종양의 병인 기전에 관여한다.⁸⁾ EBV 잠복성 유전자 산물인 LMP 1은 B림프구와 상피세포에서 발현되며, 세포표면의 표현형과 상피세포의 분화반응에 변화를 초래하여 악성 형질전환의 기전에 관여하고 원종양유전자인 bcl2 발현을 유발함으로써 세포고사(apoptosis)를 억제하여 EBV와 연관된 악성 종양의 병인기전에 관여하는 것으로 알려져 있다.⁸⁾ 이러한 LMP 1의 발현은 비인강 미분화암종에서 25~50%, 급성단핵구증은 20~30%, 호지킨씨병에서는 40~50% 발현된다.⁹⁾ EBV의 검출방법으로 현재 많이 이용되는 것으로 virus의 DNA 서열을 밝혀내고 이를 이용한 DNA hybridization에 의해 EBV를 검출하는 Southern blot hybridization이나 in situ hybiridization(ISH)법과 중합효소연쇄반응(PCR)법 등이 있다. 그외 EBV의 존재를 확인하는 방법으로는 항체를 이용한 면역조직화학적 염색법, 혈청내의 EBV 항원에 대한 항체의 검출, 광학현미경이나 전자현미경을 이용한 세포내 봉입체나 viron을 확인하는 방법 등이 있는데,¹⁰⁾ 본 연구에서는 면역조직화학적 염색법을 이용하여 EBV 단백의 발현을 관찰하였다. 면역조직화학법을 이용한 검색은 악성병변 그리고 양성병변 및 전암병변을 동일 조건하에서 암소주위의 정상적인 조직상의 변화와 함께 검색할 수 있다는 장점이 있다.
   본 연구에서 면역조직화학적 염색을 이용하여 후두편평세포암종에서 EBV의 감염여부를 확인한 결과 65례중 26례(40%)에서 EBV를 검출할수 있었다. Kiaris 등¹¹⁾은 민감도가 높은 PCR 방법에 RFLP(restriction fragment length polymorphism)를 추가시켜 특이성을 보강한 실험에서 후두 편평세포암종 27례중 9례(33%)에서 EBV genome이 존재함을 밝혀냈고, Nam 등¹⁰⁾은 in situ hybridization 방법을 이용하여 EBV가 후두의 편평세포암종에서 37%, 비인두의 편평세포암종에서 63.6%, 비인두의 미분화비인두암종에서 84.8%로 의미있게 높게 나타났다고 보고하였는데, 이 결과는 저자들의 후두 편평세포암종에서의 EBV 검출율인 40%와 유사한 소견을 보여 주고 있다. 그외 Brichacek 등¹²⁾은 성문상부암 5례중 3례(60%)에서 EBV DNA 양성을 보고한 바 있으며, Hwang 등¹³⁾은 후두암종에서 EBV의 검출이 한 례에서도 없었다고 보고하였으며, Min 등¹⁴⁾은 in situ hybridization법을 이용한 연구에서 성문상부암에서 23%, 성문암에서 7.7%로 총 39례의 후두암중 7례(18%)에서 EBV가 검출되었다고 하여, 본 연구에서의 EBV 검출율인 성문상부암 28례중 13례(46.4%), 성문암 37례중 13례(35.1%)의 결과와 차이를 보였다. Sessions 등¹⁵⁾은 후두암 39례와 대조군 59례에서 sampled serum을 얻어 EBV에 대한 보체 고정 검사를 통해서 정량 분석한 결과 후두암 39례중 27례(69%), 대조군 59례중 38례(65%)에서 양성반응 소견을 보여 EBV titier에 있어 대조군과 현저한 차이를 발견할수 없었다고 하였다. Pou 등¹⁶⁾은 후두유두종 환자의 파라핀 포매조직을 이용해서 viral DNA에 대한 polymerase chain reaction을 통해 EBV의 발현율을 검사한 결과 24례중 3례(12.5%)에서 양성소견을 보고하여 여러연구에서 나타난 후두편평세포암에서의 EBV 검출율보다 다소 낮은 검출율을 보였다. Gan 등17)은 구강암 조직의 PCR검색으로 66%의 검출율을 보고하였고, Tyan 등¹⁸⁾은 두경부암 조직에서 PCR을 이용한 검색 결과 하인두암 12례중 8례(66.6%), 후두암 10례중 6례(60%), 타액선암은 전 례에서 그리고 구강암은 9례중 4례(44.4%)에서 검출되어 EBV와의 접촉이 많은 구강암이나 타액선암에서 EBV 검출율이 높다는 것을 보여 주었다. 정상인에서도 EBV에 양성반응을 보일 수 있으나, 이들이 전암병소(premalignant)의 경우인지, 건강보균자(healthy carrier)인지는 사실상 확인하기 어렵다.¹⁹⁾ Park 등²⁰⁾의 보고에 의하면 10세이하의 아동군에서 EBV에 대한 비특이 IgG치가 81.8%의 양성율을 나타내고, EBV의 전염이 타액등의 분비물에 의한 감염임을 고려해 보면 후두내의 림프조직 혹은 상피조직에 EBV가 잠복해 있을 가능성을 추측할 수 있다.
   본 연구결과 대조군의 경우 후두용종 조직 20례중 2례(10%)에서 양성 반응을 보였으며 양성으로 판정된 2례는 이러한 건강 보균자 일 수 있으며, 또 하나의 가능성은 장차 후두암으로 발전할 가능성이 있는 사람 일 수 있으므로 이들에 대해서는 주기적인 관찰이 필요할 것으로 생각된다. 본 연구에서는 EBV가 후두암과 밀접한 관계가 있음을 확인할수 있었으나 EBV의 확실한 발암기전에 대해서는 후두암의 면역치료나 유전자치료의 개발과 더불어 향후 보다 더 많은 례를 이용한 객관적인 연구가 필요할것으로 사료된다.

결     론

   본 연구의 결과 후두 편평세포암종에서 EBV 감염률이 정상조직에 비하여 높아, 종양의 유발인자로서 EBV가 관여하리라 생각 되어 진다. 그러나 후두암의 병기, 부위, 분화도및 경부림프절전이에 따른 EBV 감염률의 상관관계는 밝힐수 없었다.

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