서     론

   비·부비동에 발생하는 반전성 유두종은 양성상피종양으로 비강내 원발성 종양의 0.5~4%에서 나타나는 비교적 드물지만¹⁾²⁾ 임상적으로 국소침윤을 잘하고, 높은 재발율 및 악성종양과의 연관등으로 지속적 관찰을 요하는 질환이다.³⁾ 종양의 발생기전에 대해서는 확실히 규명되지 않고 있지만 알레르기, 만성염증, 흡연, 환경적요인 및 바이러스 등이 원인인자로 알려져 있다.^4-6) 최근 분자생물학의 발전으로 반전성 유두종에서 인유두종 바이러스(이하 HPV)와 Epstein-Barr 바이러스(이하 EBV)를 관찰할 수 있었으며^7-9) 종양의 발생 및 재발과 관련된다고 추측하고 있다. 또한 양성상피종양인 반전성 유두종은 5~15%정도에서 악성변화를 하기 때문에¹⁰⁾ 상기한 두가지 종양바이러스가 양성종양이 악성으로 진행하는 과정에서 어떠한 역할을 하는지 즉 종양유전자와의 관련성에 관심이 모아졌다. 대표적 종양억제유전자인 p53 유전자는 정상에서 세포주기의 조절인자로서 DNA 보수 및 세포고사에 관여하는데 HPV는 이러한 p53 기능을 불활성화하여 종양발달에 기여한다고 한다.¹¹⁾ 예를 들어 폐암이나 식도암등은 악성종양이 발생하는 과정에서 p53 유전자가 변이 혹은 종양 바이러스에 의한 비활성화로 p53 유전자의 기능이 소실되어 종양발생에 관여한다고 알려져 있으며¹²⁾ 최근에는 두경부암종과의 관련성에 대한 연구도 활발히 진행되고 있다.
   Proliferating cell nuclear antigen(이하 PCNA)은 DNA polymerase-δ의 보조단백으로 DNA 복제와 세포증식에 관련되며, 세포주기중 후기 G1부터 S기에 걸쳐 핵내에서 PCNA 발현율이 높다는 것은 DNA 복제가 왕성하고 악성종양으로 진행할 가능성이 높아진다는 것을 의미한다. 그러므로 PCNA는 세포의 증식능력을 나타내는 지표로서 이용될 수 있으며,¹³⁾ 따라서 재발이 많고 빨리 자라는 반전성 유두종의 경우 이를 이용한 증식능력의 측정이 종양바이러스에 의한 암억제력의 저지정도를 나타내는 지표로서 이용될 것으로 생각된다.
   저자들은 반전성 유두종에서 바이러스 검출시 가장 민감도가 높은 중합효소 연쇄반응(PCR, polymerase chain reaction)을 이용하여 HPV DNA 및 EBV DNA를 검색함으로써 비·부비동 반전성 유두종의 원인인자로서 HPV 및 EBV의 역할을 알아보는 한편 종양억제자인 p53 단백과, PCNA가 재발 및 악성변화 등 임상진행과정에서 종양바이러스와 어떤 상호관계를 보이는지 알아보기 위해 본 연구를 시행하였다.

대상 및 방법

대  상

   연구대상은 1993년 9월부터 1996년 3월까지 본원에서 비·부비동의 반전성 유두종으로 진단되어 조직 검사 및 수술을 받은 16례를 대상으로 하였다. 수술시 채취한 반전성 유두종조직은 ­70°C에 신속히 냉동보관한 후 실험에 사용하였으며 대조군으로는 알러지나 비강용종의 과거력이 없는 정상 성인의 하비갑개 점막조직 10례를 대상으로 하였다.
   반전성 유두종 환자의 성별분포는 남자12례, 여자 4례로 남녀비는 3：1로 남자에게 많았으며, 연령분포는 30세에서 75세로 50대가 6명으로 가장 많았고, 평균연령은 51.7세였으며 대조군은 남녀 각각 5례였으며 평균연령은 30.0세였다.

방  법

DNA의 추출
   DNA추출 kit(IntraGene Matrix, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)를 이용하여 ­70°C에 냉동보관한 반전성 유두종 조직 및 정상 비점막 조직에서 핵산을 추출하였다. 반전성 유두종 조직 및 정상 비점막 조직 3 mg을 균질화하여, 1.5 ml소형 원침시험관에 넣고 세포용해액을 첨가하여 원심분리한 후 상층을 깨끗이 제거하고, 1×PBS buffer 1 ml를 넣어 다시 원심분리하였다. 3차 증류수와 세포부유액을 각각 20 μl씩, kit 시약 IntraGene Matrix 200 μl를 넣어 56°C에서 15~30분간 처리하였다. 시험관 바닥에 소량의 굳혀진 조직이 풀어질 만큼 vortex로 섞어준 뒤 남아 있는 단백질의 비활성화를 위해 100°C에서 8분간 처리하고 재부유시킨 후 원심분리하여 상층액 5 μl를 PCR에 이용하였다.

인유두종 바이러스의 중합효소 연쇄반응
   HPV DNA의 증폭은 Manos 등¹⁴⁾이 고안한 L1 open reading frame 중 450 base pairs(이하 bp)를 증폭할 수 있는 L1 consensus primer를 이용하였다(Table 1). HPV DNA가 증폭된 경우에는 HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33의 아형을 알아보기 위하여 263 bp를 증폭할 수 있는 HPV 6 E6 primer, 144 bp를 증폭할 수 있는 HPV 11 E6 pimer, 350 bp를 증폭할 수 있는 HPV 31 E6 primer, 413 bp를 증폭할 수 있는 HPV 33 E6 primer(Maxim Biotech, Inc., Sanfrancisco, CA.)와 206 bp를 증폭할 수 있는 HPV 16 E6 primer, 419 bp를 증폭할 수 있는 HPV 18 E6 primer(한국생명공학 연구소, Korea)를 PCR에 이용하였다(Table 1). PCR은 정상 또는 종양조직에서 추출된 DNA 5 μl, 0.2 mM의 dNTP들, PCR buffer 10x concerntration 10 μl, 0.5 mM의 consensus primer, 2.5 unit의 Taq polymerase(Boehringer Manheim, Germamy)에 증류수를 섞어 총 100 μl의 양이 되도록 하였다. Thermal cycler(Perkin-Elmer, Norwalk,CT.)를 이용하여 94°C에서 30초, 55°C에서 30초, 72°C에서 1분간의 반응과정을 혼합한 것을 각각 사용하였다. PCR 용액중 10 μl를 2% agarose gel(Boehringer Manheim, Germany)에서 전기영동(80 V에서 5분, 120 V에서 45분)한 후 0.5 μl/ml 농도의 ethidium bromide(Boehringer Manheim, Germany)용액으로 30분간 염색하였다. 양성결과로 나온 검체는 HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33 E6 primer를 이용하여 같은 방법으로 증폭한 후 전기영동 하였으며 HPV 31은 350 bp, HPV 33은 413 bp 위치에 전기영동상이 나타나면 양성으로 판정하여 폴라로이드 사진기로 촬영하여 아형을 분류하였다. Size marker(GIBCO, Grand Island, NY.)는 100 bp size marker를 사용하였다.

EBV의 중합효소 연쇄반응

   반전성 유두종조직 및 정상 비점막 조직에서 인유두종과 같은 방법으로 핵산을 분리하여 TC 60：senser primer, TC 61：antisenser primer를 이용하여 EBV에 대한 중합효소 연쇄반응을 하였다.
   양성대조군으로는 EBV-transformed B-cell line(2D5)에서 분리한 purified DNA를 사용하였고, 음성대조군으로는 주형 DNA를 가하지 않고 반응을 일으켰다. 인유두종바이러스에서와 같은 방법으로 증폭한 다음 전기영동 하였으며 125 bp 위치에 전기영동상이 나타나면 양성으로 판정하였고 이를 폴라로이드 사진기로 촬영하여 분류하였다. Size marker(Boehringer Manheim, Germany)는 50 bp size marker를 사용하였다(Table 1).

p53과 PCNA의 조직내 면역조직화학적 검색
   10% 포르말린에 고정 후 파라핀에 포매되어 보관된 반전성 유두종 및 정상 비점막 조직을 4 μm의 절편으로 잘라 poly-L-lysine 등으로 표면처리한 슬라이드에 부착시킨 후 56°C 보온기에서 30분간 항온처리하고 자일렌으로 5분간 2~3회 탈파라핀한 후 100% 에칠알코올로 2~3회 닦아주었다.

탈파라핀
   조직은 APAAP(alkaline phosphatae anti-alkaline phosphatase)를 이용한 avidine-biotin으로 염색하였다. 1차항체는 마우스 단클론성 항체(clone DO-7, Novostra Lab., Ltd. Newcastle, U.K.)로서 정상형과 변이형 p53단백에 모두 반응하는 항체를 사용하여 1：100으로 희석한 후 45°C에서 1시간, PCNA는 마우스 PC10 단클론성 항체(clone PC10, DAKO, Carpinteria, CA.)를 사용하여 21：50으로 희석한 후 45°C에서 30분간 항온처리시켰다. 2차항체는 biotinylated rabbit anti-mouse immunoglobulin(Vectastanin Elite kit, Burlingame, CA.)을 사용하였으며 45°C에서 30분간 항온처리한 후 2~3회 세척하고, 45°C 검출액에서 15분간 처리한 후 3회 세척하였다. 발색제에 45°C, 10분간 처리 후 hematoxylin으로 대조염색하여 광학현미경하에서 관찰하였다. 광학현미경하에서 p53의 양성판정은 세포 핵안에 붉은색의 과립이 있을 때 양성으로 판정하였으며 PCNA의 양성도는 Woods 등¹⁵⁾이 고안한 PC10 index를 산출하여 평가지표로 삼았는데 이때에 양성세포는 핵내에 면역염색된 경우를 양성으로 하였다.

자료분석과 통계처리
   자료의 유의성 검정에서 HPV와 EBV DNA의 검출 유무에는 χ2-검정을 이용하였고, 표본수가 적은 경우에는 Fishers exact test로 하였다. 유의성 검정에서 유의 수준을 p<0.05 범위로 정하였다.

결     과

   수술후 재발은 본원에서 완전 절제술 후 평균 30개월 추적관찰한 16례 중 6례(38%)에서 나타났으며, 이들 환자의 반전성 유두종 조직에서 관찰한 두종류의 종양 바이러스 HPV, EBV 및 두가지 암관련 단백 p53, PCNA의 발현을 관찰한 결과는 다음과 같다(Table 2).

HPV의 발현정도

   반전성 유두종은 16례중 8례(50%)에서 HPV DNA가 검출되었으며, HPV 아형에 따른 검출 빈도는 HPV 18이 2례(18%), HPV 16과 HPV 33이 각각 1례(6%), 1례에서는 HPV 6과 HPV 16이 동시에 검출되었고, HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33이외의 형이 3례(19%)에서 나타났다(Figs. 1 and 2, Table 2). 반면 대조군에서는 10례 모두에서 HPV DNA가 검출되지 않아 반전성 유두종에서 통계학적으로 유의하게 HPV DNA가 검출됨을 알 수 있었으며(p<0.01)(Table 3), 재발한 군이 재발하지 않은 군보다 상대적으로 HPV DNA가 높은 빈도로 검출되었으나 통계적인 유의성은 없었다(Table 4).

EBV의 발현정도

   반전성 유두종 16례중 10례(62%), 대조군 10례중 2례(20%)에서 EBV DNA가 검출되어, HPV DNA의 경우에서와 같이 반전성 유두종에서 통계학적으로 유의하게 EBV DNA가 많이 검출됨을 알 수 있었으나(p<0.05)(Fig. 3, Table 3), 재발하지 않은 군에서 EBV DNA가 재발한 군보다 높은 빈도로 검출되어 재발율과의 연관성은 찾을 수 없었다(Table 4).

p53 단백의 면역조직학적 소견

   반전성 유두종 16례중 4례(25%)에서 양성반응을 나타냈으며, 대조군에서는 10례 모두에서 음성으로 반전성 유두종군에서 높게 나타났으나 통계학적인 의의는 없었다(Table 5). 반전성 유두종 치료 후 재발군과 재발하지 않은 군에서 2례씩 양성반응을 보여 두군간에 p53 단백에 대한 반응률에는 차이가 없었다(Fig. 4, Table 4).

PCNA의 면역조직학적 소견

   반전성 유두종 16례중 4례(25%), 대조군에서는 10례중 1례에서 양성반응을 나타냈으며(Fig. 5), PC10 지표는 반전성 유두종군에서는 평균 16.0%, 대조군에서는 평균 4.1%로 관찰되어 반전성 유두종군에서 높게 관찰되는 양상을 보였으나, 자료수가 적어 통계학적 의의는 밝힐 수 없었고(Table 5), 또한 재발군과 비재발군에서 PCNA의 반응률에는 차이가 없었다(Table 4).

고     찰

   비·부비동 반전성 유두종은 종양의 상피세포가 기질내로 반전하는 양성상피종양으로 Ward¹⁶⁾가 처음 비유두종을 발표하였고, 종양의 상피가 기질내로 반전한다는 조직학적 특성을 기술한 이래 여러 가지 명칭으로 불려져왔으나 근래에는 반전성 유두종으로 주로 불리우고 있다. 반전성 유두종은 비강내 원발성종양의 0.5~4%로 비교적 드물게 발생하나 수술적 치료후에도 재발율이 높고, 주위조직의 파괴를 야기하며, 악성종양과의 연관 등으로 지속적인 추적관찰이 필요한 질환이다.
   반전성 유두종 환자의 연령 및 성별분포는 40~60세에 호발하여 평균연령은 50세, 남성에서 많다고 알려져 있으며, 저자의 연구에서도 50대에 많았고 평균연령는 51.7세였으며, 남녀비는 3：1이었다. 또한 반전성 유두종에서 악성 변화를 동반하는 빈도는 2~50%로 보고되었지만 대부분 5~15% 정도가 악성변화를 동반한다고하며 편평상피암이 대부분이지만 본 연구에서 조사한 16례에서는 이 형성이나 악성 변화를 동반한 예가 없었다.
   인유두종 바이러스는 호흡기와 소화기 점막조직에서 양성 및 악성 종양을 일으키는 원인 인자로 알려져 있으며 80여종의 아형이 있고 약 8000 bp 크기의 이중쇄 DNA 바이러스로, 상기도에 잠복감염상태로 존재하다가 여러 가지 요인에 의해 활성화되어 종양발생에 보조적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 병소의 위치와 병변의 진행과정에 따라 인유두종 바이러스의 다른 아형이 검출되는데, HPV 6, 11은 주로 비현성 감염이나 후두 유두종 같은 양성질환을 유발하며, HPV 16, 18, 31, 35, 51은 자궁경부 및 비뇨기계의 악성종양과 연관이 있는 것으로 알려져 있다. HPV와 비·부비동 반전성 유두종의 연관성은 HPV 16, 11, 16, 18, 57 등 여러 아형에 대하여 연구되어져 왔는데 본 연구에서는 Manos 등¹⁴⁾이 고안한 L1 consensus primer를 이용하는 PCR 방법으로 반전성 유두종 16례중 8례(50%)에서 HPV DNA를 검출하였으며, 이는 Byun 등¹⁷⁾이 보고한 82%와는 차이를 보였다. HPV의 여러 아형중 반전성 유두종과 관계가 있는 것으로 알려진 HPV 6, 16, 18, 33이 나타났으며, HPV 아형에 따른 검출빈도는 HPV 18이 2례(18%), HPV 16과 HPV 33이 각각 1례(6%)였으며, 1례에서 HPV 6과 HPV 16이 동시에 검출되었고, HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33 이외의 형이 3례(19%)에서 나타나, 38%의 검출빈도를 보인 Macdonald 등⁸⁾의 보고와는 비슷한 결과를 보였으나 Gaffey 등⁹⁾이 보고한 5%의 검출과는 상이하였다. 그러나 대조군인 정상 비점막 조직에서는 전례에서 HPV DNA가 검출되지 않았다.
   EBV는 herpes virus에 속하는 DNA 바이러스로서 두경부영역이 종양 특히 비인강미분화암종, 비·부비강 미분화암종 및 이하선 후두의 임파상피종양암종과 연관이 있다. 이 바이러스는 광범위하게 인체감염이 되어 있어 우리나라에서도 혈액 및 조직에서의 감염이 85.7%, 10세 이하 아동에서 EBV에 대한 비특이적 면역글로불린이 비교적 높게 나타난다는 보고가 있다.¹⁸⁾ 대개는 불현성 감염이며 잠복 바이러스가 활성화되는 것이 반전성 유두종의 발생과 관련이 있는 것으로 추정된다. 또한 지역 및 인종적인 차이가 있는데, EBV가 관여한다고 알려져 있는 비인강암은 백인에게는 비교적 드물지만 아시아 특히 중국인에서는 두경부종양의 16%나 되는 흔한 종양이며, 남부 중국인이나 에스키모인에서 발생하는 타액선의 임파상피종양도 EBV와 연관된다. 반전성 유두종과 EBV의 관계를 규명하기 위한 연구는 혈청학적 검사에 의하여 viral capsid 항원을 검출하거나, 전자현미경적으로 viron을 확인하는 방법, 조직배양을 통해 바이러스를 동정하는 방법이 있으나, 최근에는 분자생물학적 방법의 발달로 특정 유전자를 증폭하는 중합효소 연쇄반응이 이용되고 있다.
   저자들은 민감도가 높은 중합효소 연쇄반응을 이용하여 반전성 유두종 16례중 10례(62%)에서 EBV DNA를 검출하였으며 대조군의 정상 비점막 조직 10례중 2례(20%)에서 EBV DNA를 검출하여 통계학적으로 유의하게 EBV DNA가 검출됨을 알 수 있었다(p<0.05). MacDonald⁸⁾는 중합효소 연쇄반응을 이용한 반전성 유두종 조직 20례에서 EBV DNA의 13례(65%)검출, 정상대조군 10례에서 0례(0%)의 검출을 보고하였고 Suh 등¹⁹⁾도 정상 비인강조직에서 PCR을 이용한 EBV DNA가 7례(20%)에서 검출된 것을 보고하여 저자들과 비슷하였으나 이형성이나 악성화와의 동반이 없는 반전성 유두종 조직 12례중 1례(8%)에서만 EBV DNA가 검출된 Gaffey 등⁹⁾의 보고와는 상이하였다.
   PV DNA와 EBV DNA의 검출빈도의 차이는 지역과 인종적인 차이를 비롯하여 조직, 혈액 및 도말검체 등 검사재료의 선택과 PCR 혹은 동소보합결합 등 검사방법에 따라서 차이가 있을 것으로 생각된다.
   그러므로 반전성 유두종에서 중합효소 연쇄반응에 의한 HPV DNA(50%)와 EBV DNA(62%)의 검출로 보아 종양발생의 원인으로 이들 바이러스의 역할이 확실하지는 않지만, 상당한 연관성을 추측하게 한다.
   p53 유전자는 17번 염색체의 단완(17 p13)에 존재하는 종양억제유전자로 p53 단백은 1979년에 발견된 핵인단백으로 53KD의 분자량을 갖고, simian 바이러스 40(SV 40)의 거대 T항체에 결합하는 단백으로 처음 발견되었다. p53 단백의 작용은 세포 손상시 G1-S 이행단계에서 세포주기를 지연시켜 DNA 손상을 교정하거나 세포고사에 관여하며, DNA 손상시에 활성화되어 p53 유전자에 의해 조절되는 유전자인 WAF1/Cipl의 발현을 촉진하고 이것은 CDK, PCNA와 결합하여 활성을 억제함으로써 DNA 합성전에 세포주기를 정지시켜 손상된 DNA를 복구할 시간적 여유를 같게 한다. 변이형(mutant-type) p53 단백은 반감기가 매우 길고, 대사적으로 안정된 단백복합체를 형성하여 정상보다 많은 양이 세포핵에 존재하게 되어 면역조직화학적 염색으로 확인할 수 있다. 또한 p53 유전자의 작용소실은 p53 유전자의 변이 이외에도 HPV DNA E6 종양단백과 같은 바이러스 종양단백이 정상 p53 단백과 결합하여 초래될 수 있다. HPV가 p53 유전자의 기능소실에 관여하는 기전은 정확히 규명되지는 않았지만 HPV가 세포내에 감염되면 바이러스에 의해 표지화된 변형유전자가 E6 및 E7 종양단백을 만들고 이중 E6 단백은 p53 단백과 결합하여 p53을 분해시킴으로써 종양을 유발할 것으로 생각되고 있다. 본 연구에서 p53 단백이 4례(25%)에서 양성으로 나타났으며 정상대조군 10례에서는 나타나지 않았다. 양성소견을 보인 4례중 2례에서 치료후 재발하여 p53 유전자 변이만으로는 반전성 유두종의 재발을 설명하기에는 어려움이 있었다. 그러나 반전성 유두종 16례중 11례(69%)에서 HPV와 p53이 함께 혹은 단독으로 표현되어, p53 단백과 HPV 종양단백 E6와의 결합으로 유전자가 불활성화되어 반전성 유두종에서 p53변이와 HPV 사이의 역상관관계를 추측할 수 있었다.
   PCNA는 36KD의 nonhistone 핵단백, DNA polymerase-δ의 보조단백으로 DNA 합상과 세포증식에 밀접하게 관련되어 있으며, 이 PCNA의 표현율을 측정하기 위해 단클론 항체인 PC10 항체를 사용하여 반전성 유두종 16례중 4례(25%), 대조군 10례중 1례(10%)에서 양성반응을 나타내었으나, 두군간에 통계학적 의의는 없었다. 또한 PCNA 양성률을 나타내는 PC10 지표는 반전성 유두종군에서는 평균 16.0%, 대조군에서는 평균 4.1%로 관찰되어 반전성 유두종군에서 높게 관찰되는 양상을 보였으나, 자료수가 적어 통계학적인 의의는 밝힐 수 없었고, EBV DNA, p53, PCNA 서로간의 연관성은 찾을 수 없었다.

결     론

   이와 같은 결과로 미루어 HPV 및 EBV 바이러스의 검출빈도가 정상 비점막군에 비해 반전성 유두종군에서 높아 반전성 유두종에서의 원인인자로의 임상적 의의를 찾을 수 있었고, 재발군에서 HPV DNA의 검출이 높게 나타나는 것으로 보아 재발과의 연관성을 알 수 있었다. 그러나 HPV 아형에 따른 분류, p53, PCNA에서 재발 및 악성화와의 관계는 검출빈도가 낮아 예후인자로서의 임상적 의의를 정하기 위해서는 앞으로 많은 연구가 필요할 것으로 생각된다.

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