서     론

   항균성 펩티드는 조직속에 내재하면서 면역체계의 한 부분을 구성하고 있으며 여러 미생물의 조직침투를 방어하는 기능을 하고있다. Defensin은 이러한 항균성 펩티드 중의 하나로 그람 양성균, 그람 음성균, 곰팡이, 바이러스에 까지 광범위한 항균성이 있으며 α-defensin과 β-defensin 두 종류로 분류되고 있다.¹⁾²⁾ 인체에서는 여섯가지의 α-defensin과 두종류의 β-defensin이 보고되었는데, α-defensin 중 4개(HD-1,-2,-3,-4)는 호중구에서, 2개(HD-5,-6)는 소장의 paneth 세포에서 발견되었다.³⁾⁴⁾ β-defensin은 α-defensin에 비하여 인체의 여러장기에 광범위하게 분포하며 β-defensin 1은 비뇨생식기, 폐 등에서 관찰되었고⁵⁾⁶⁾ 최근 β-defensin 2가 피부와 기관지 점막에서 발견되었다.⁷⁾
   비점막은 호흡시에 비강내로 유입되는 대기중에 분산되어 있는 여러가지 생물학적, 물리적, 그리고 화학적 인자들에 노출되어 있으며 이러한 자극물질에 대하여 비점막 및 하기도를 보호하는 방어기능을 한다. 방어 작용이 원활히 이루어지기 위하여 비점막에는 여러가지 방어 체계가 있으며, 특히 상피세포층, 점막하 분비선, 혈관, 점막 분비세포에서 분비되는 비즙과 단백질 성분이 중요한 역할을 담당하고 있다.⁸⁾ 그러나 비점막에서는 점막방어작용에 중요한 역할을 한다고 알려진 defensin 계통에 관한 연구가 거의 되어있지 않다.
   따라서, 본 연구에서는 인체 비점막에서 defensin 아형의 발현여부를 관찰하고자 하였다.

재료 및 방법

조직채취
   외비성형술을 받은 10명의 환자(남자 5명, 여자 5명, 연령 24~40세)에서 수술시 하비갑개 점막을 채취하였다. 채취 당시 이환자들은 특이한 비과적 증상은 없었고 전비경 검사상 해부학적 이상이나 점막 손상은 없었다.
   비용을 동반한 만성 비부비동염으로 비내시경 수술을 받는 열명의 환자(남자 8명, 여자 2명, 연령 20~50세)에서도 수술 중 하비갑개 점막 및 비용을 얻었다. 이들은 모두 3년 이상의 병력을 가진 환자들로 알레르기나 천식, 아스피린과민증의 병력은 없었다.
   β-defensin 1, 2의 역전사중합효소연쇄반응에 대한 양성 대조군으로 삼기위해 이개 후부의 정상 피부조직 3례와 정상 기관지 점막 2례를 각각의 귀수술 및 폐수술시 채취하였다. α-defensin 1, 2, 3의 면역조직화학에 대한 양성 대조군으로는 Polymorphrep(Nycomed Pharma AS)으로 정제한 호중구 표본을 이용하였다.
   채취한 조직은 역전사중합효소연쇄반응과 면역조직화학적분석을 위해 처리되었다. β-defensin 1, 2와 α-defensin 5, 6에 대해서는 현재 항체를 구할 수 없어 역전사중합효소연쇄반응 후 dot blot hybridization을 이용하여 발현량을 확인 하였고, α-defensin 1, 2, 3는 항체를 구할 수 있어 면역조직화학적 방법으로 관찰하였다.
   모든 하비갑개점막과 비용조직은 두부분으로 나누어 한쪽은 RNA 추출을 위해 액화 질소에 냉동하여 ­70°C에 보관하였고 다른 한쪽은 면역조직화학을 위해, 0.1M phosphate buffered saline(PBS, pH 7.2)에 용해시킨 4% 파라포름알데히드에 24시간동안 4°C에서 고정 한 다음, PBS에 용해한 20% 자당으로 수세하고 액체 질소로 급속냉동시켜 동결절편기(Leica CM 1900, USA)를 이용하여 12 μm 두께의 조직절편을 만들었다.

RNA 분리, 역전사중합효소연쇄반응과 소식자 제작

   냉동된 조직 50~100 mg을 1 ml의 TRIzol 시약(GIB-COBRL, Grand Island, NY, USA)에 균질화시킨후, guanidium thiocyante-phenol-chloroform 추출 방법으로 총 RNA를 추출하였다.⁹⁾ 하비갑개와 비용에서 추출된 총 RNA 4 μg을 각각 2.5 U의 M-MLV 역전사효소(GIBCOBRL, Grand Island, NY, USA)와 50 pm의 random hexanucleotide를 포함한 반응 혼합물 20 μl에 넣고 42°C에서 60분간 역전사시켰다. 중합효소연쇄반응은 DNA thermal cycler(Takara Co., Japan)에서 실시하였다. 1 μl의 cDNA를 Taq DNA polymerase 0.125 U와 각각의 시발체 12.5 pmol을 함유한 25 μl의 중합효소연쇄반응 혼합물에서 증폭시켰다. RNA 통합성과 역전사반응의 적합성 여부를 확인하기위해 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) 전사물의 중합효소연쇄반응 발현을 보았다. 음성대조군으로는 각 표본에서 cDNA 합성시 역전사효소를 뺀 것을 이용하였다. 이 실험에서 사용된 각 defensin 시발체와 GAPDH 시발체의 염기배열 순서는 Table 1과 같다. 증폭된 중합효소연쇄반응 산물을 2% argarose gel에 용해시킨후 ethidium bromide로 염색하고 자외선하에서 관찰하였다. 각 중합효소연쇄반응 산물의 특이성은 예견된 크기와 DNA염기서열에 따라 확인하였다.
   소식자 제작을 위하여 얻어진 cDNA 조각을, 선형화한 숙주인 PCR 2.1(Invitrogen Cor., Carlsbad, USA)에 접종한 후, EcoRI로 절단하여 random priming technique을 이용하여 digoxigenin-dUTP를 포함한 deoxyribonucleoside 혼합물(Boehringer Mannheim, Germany)로 표식하였다.

β-defensin 1, 2 mRNA에 대한 반정량적 dot blot hybridization

   중합효소연쇄반응에서 양성으로 나온 표본은 반정량적 dot blot hybridization 분석으로 조사하였다. 위에서 기술 한 것처럼 총 RNA 추출과 역전사 실시후 각 표본에서 얻어진 cDNA들을 각각의 시발체로 중합효소연쇄반응을 진행하면서 20, 25, 30, 35, 40 사이클에서 채취하였다. 적절한 증폭 횟수를 보기위해 time kinetic study를 실시하였다. 이러한 분석을 근거로 GAPDH는 30회, β-defensin 1, 2는 35회가 적절하다고 결정되었다. 각 중합효소연쇄반응의 산물은 Bio-Rad dot blotting 기구를 이용하여 Hybond-N 나일론 막(Amersham, UK)에 부착시켰다. 각 blot들은 25ml의 hybridization solution(6 SSC, 1% SDS, 5 Denhardt's solution, denatured salmon sperm DNA 10 μg)으로 68°C에서 16시간동안 sealable bag에서 전처리 후 소식자를 넣어 68°C에서 24시간 동안 hybridization 하였다. 그후 hybridization된 blot들을 항digoxigenin-AP로 면역 염색후 NTB/X phosphate(Boehringer Manheim, Germany)로 발색반응을 일으켜 발현시켰다.
   각각의 dot blot 결과는 wet filter를 image scanner로 scanning 한 다음, blot의 강도는 NIH image 1.57 soft ware(Division of Computor Research and Technology, National Institute of Health, Bethesda, USA)를 이용하여 정량하였다. GAPDH는 각 PCR에서 사용된 cDNA의 실질적 양에 대한 지시자로 사용하여 목표로하는 cDNA의 양을 GAPDH 발현정도와 비교하여 정량하였다. 모든 자료는 각기 다른 3가지 실험에서 평균의 표준편차(standard error of mean)로 도출하였고 통계학적 의미는 stndent t-test로 결정하였다. p 값이 0.05 이하일 때 의미있는 것으로 하였다.

면역조직화학

   현재 사용 가능한 항defensin 단크론성 항체인 DEF 1-3(Bachem, Torrence,CA)을 이용하였다. Avidine-biotin peroxidase complex 방법으로 면역조직화학적 염색을 하였다. Biotinylated horse anti-mouse IgG(Vector Lab., Burlingame, CA)는 이차항체로 사용하였다. Avidin-biotin-peroxidase complex(Vector lab.)에 반응시킨 후 슬라이드를 diaminobenzidine(Sigma, USA)으로 발색시켰다.

결     과

   인체 비점막과 비용조직에서 defensin 유전자의 발현양상을 관찰하기 위하여 본 연구에서는 민감도가 높은 방법인 역전사중합효소연쇄반응을 실시하였다. 이때 각각의 조직에서 분리한 총 RNA에서 GAPDH 발현을 확인함으로써 RNA 통합성과 RT-PCR의 적합성 여부를 확인하였고, 모든 표본에서 예견했던 502 bp 크기의 산물을 관찰할 수 있었다.
   적절한 cDNA가 얻어진 조직에서 β-defensin 1은 하비갑개 점막과 비용 모두에서 158 bp의 역전사중합효소연쇄반응 산물이 관찰되었다(Fig. 1A). 이 산물의 배열은 기존에 발표된 β-defensin 1 mRNA의 배열과 일치하였다. 역전사중합효소연쇄반응결과 β-defensin 2 mRNA는 모든 비용 조직과 비부비동염 환자의 하비갑개 조직에서 발현되었으나 정상군에서는 나타나지 않았다(Fig. 1B). 더나가서 α-defensin 5, 6 mRNA는 모든 조직표본에서 나타나지 않았다.
   Dot blot hybridization 방법을 이용한 반정량적 분석에서, β-defensin 1 mRNA의 경우 비용이나 염증성 또는 비염증성 점막에서는 서로 의미있는 차이는 없었다. 반면 비부비동염 환자의 하비갑개 점막보다 비용조직에서 β-defensin 2 mRNA가 통계학적으로 의미있게 높았다(Figs. 2A, B and 3).
   비용과 하비갑개 조직에서 실시한 α-defensin 1,2,3 항체를 이용한 면역조직화학검색결과 비부비동염군에서는 염증성 점막의 상피와 부종성 실질에 분포한 호중구에서 양성면역반응을 관찰할 수 있었다(Fig. 4B and C). 반면 8명의 외비성형술 환자군 중 8명에서는 나타나지 않았고(Fig. 4A), 나머지 2명에서는 하비갑개 점막에 산재한 양성 반응세포가 관찰되었다.

고     찰

   비점막에는 정상상태에서는 그다지 많은 염증세포가 존재하지 않으며,¹⁰⁾¹¹⁾ 미생물의 비점막 침입시 상피세포와 그 분비물이 방어 작용을 하고있다. 즉, 인체의 비즙에는 점막 상피와 점막하 분비선에서 나온 lysozyme, lactoferrin, secretory leukoprotease inhibitor, 분비형 IgA와 같은 잘 알려진 항균 물질이 있다. 이런 분비물들이 미생물 감염시 숙주에 대한 일차적 방어 작용을 한다.⁸⁾ 이러한 기존에 알려진 항생물질 외에 본 연구 결과 인체 비점막에서는 항균성 defensin 펩티드들이 만들어 진다는 것을 알 수 있었다. β-defensin 1과 2은 비점막에서 실질적으로 만들어 지는 것으로 관찰되며, α-defensin 1, 2, 3는 호중구에서 비즙으로 유리되는 것으로 생각된다. 역시 α-defensin 5, 6은 인체 비점막에서도 발현되지 않았고, 현재로는 소장의 paneth 세포에서 유일하게 만들어 지는 것으로 보인다.³⁾⁴⁾
   현재까지 점막에 존재하는 defensin은 외부 미생물의 침입에 대한 방어에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되고 있다. 따라서 비점막에서의 defensin의 생성과 조절의 기전을 이해하는 것은 급성 및 만성 비부비동염 발생기전을 이해하는데 도움을 줄 것이다. 한편, 비부비동염 환자의 비강 세척액에서는 총단백질과 연관된 선분비 단백질과 lactoferrin이 비정상적으로 증가된 것을 볼 수 있었다고 하며 이런 것은 만성염증시 항균성 물질이 증가한다는 것을 시사해준다.¹²⁾ 그리고 재발성 또는 만성 부비동염 환자의 점막에서는 증가된 lysozyme과 lactoferrin의 활동이 배세포와 상피세포 및 새로 형성된 비정상적 분비선에서 관찰되었다.¹³⁾ Kurono등이 보고한 바에 따르면 만성 부비동염 환자에서는 비점막에 대한 S. pyogenase의 접착성이 유의하게 증가된 것을 볼 수 있었고 특히 M 단백에 대한 분비형 IgA의 활동도가 결핍된 경우 S. pyogenase의 접착성이 증가되었다고 한다.¹⁴⁾ 이러한 연구결과에 따르면 항균성 물질의 분포나 활동도의 변화가, 직접적인지 간접적인지 명확하지는 않지만, 비점막의 상피 세포에 대한 병원균의 친화도와 어떤 연관이 있는 것으로 생각된다. 그러므로 급성이나 만성 부비동염의 경우 human β-defensin 1, 2의 발현이나 활동도에도 변화가 있는지 밝히는 것이 중요하다.
   이번 연구에서 β-defensin 1은 정상 하비갑개점막, 염증성 하비갑개점막 그리고 비용조직 모두에서 발현되었다. 반정량적 dot blot hybridization에서 β-defensin 1 mRNA는 정상과 염증성 점막 사이에 의미있는 차이가 없었다. 이와는 대조적으로 β-defensin 2 mRNA는 정상 하비갑개 조직에서는 발현되지 않았으나 염증성 하비갑개 점막과 비용조직에서 강하게 발현되었다. 이런 결과들은 다른 부위에서 보고되었던 것과 일치하였다.^7)15-17) 치은조직에서의 β-defensin 1 mRNA에 대한 역전사중합효소연쇄반응에서도 염증성 조직과 비염증성 조직사이에 큰 차이가 없었다고 보고되었다. 또한 배양된 치은 조직의 β-defensin 1 mRNA 발현은 사이토카인이나 병원균에 의한 자극에 대해 의미있는 변화가 없었다고 한다.¹⁶⁾ 반면에 β-defensin 2의 발현은 IL-1β에 의해 급격히 증가되며 lipopolysaccharide에 의해서도 증가되는 것으로 알려졌다.¹⁵⁾ Harder 등은 피부 각질세포에서 tumor necrosis factor -α, 그람 양성균, 그람 음성균, Candida albicans 등에 의해 β-defensin 2의 발현이 유도된다고 보고하였다.⁷⁾ 이러한 결과들을 종합해 볼 때 β-defensin 1은 비점막에 내재하면서 비점막의 일차적인 방어역할을 하며, β-defensin 2는 국소적 염증이나 감염에 의해 그 생성이 유발되는 것으로 생각된다.
   면역조직화학적 검사 결과 α-defensin(1,2,3)이 정상 점막보다 만성 부비동염 환자의 점막에 분포한 호중구에서 더 많이 발현되었다. 낭포성 섬유증이나 만성 폐쇄성 폐질환 환자의 농성 객담의 경우 호중구 수의 증가와 더불어 α-defensin(1,2,3)이 상승되는 것이 보고되었다.¹⁷⁾ 이와는 대조적으로 정상인의 각막 실질에서도 α-defensin(1,2,3) mRNA와 그 단백질은 발현되지 않았고, 소량의 염증 세포에서 나타났다고 보고되었다.¹⁸⁾ 이러한 것으로 보아 α-defensin(1,2,3)은 감염이나 염증부위에 모인 호중구에서 발현이 증가되어 미생물의 확산을 저지하는 것으로 생각된다. 또한 α-defensin(1,2,3)은 기관지 점막에 대한 세포독성 효과와 IL-8의 생성을 촉진하며, 호흡기로의 호중구의 이동을 촉진하는 것으로 보고되었다.¹⁹⁾ 따라서 α-defensin(1,2,3)은 비점막 방어기능 외에 만성 부비동염의 병태 생리에도 관여할 것으로 생각된다.

결     론

   저자들은 인체 비점막에서 defensin 아형의 발현 양상을 보기 위하여 염증의 징후가 없는 점막과 염증성 점막과 비용을 얻어 defensin의 발현 양상을 보았다. 이번 연구의 결과 human β-defensin 1은 정상이나 염증성 인체 비점막 모두 일정하게 발현되었고, β-defensin 2와 α-defensin(1,2,3)의 경우에는 정상 점막에서는 없었으나 염증성 점막에서는 발현 되었다. 이상과 같은 결과로 보아 defensin은 비점막에서도 존재하며 비점막 방어기능의 일부를 담당할 것으로 생각된다. 이러한 항균성 펩티드들은 비점막에 대한 병원균의 침입과정에서 인체의 방어 작용과 병원균의 활성화 정도에 중요한 역할을 하며, 향후 항생제 치료에 있어서도 이용을 할 수 있을 것으로 생각된다.

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