교신저자：김세헌, 135-270 서울 강남구 도곡동 146-92  연세대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   두경부 영역의 암 발생율은 전체 암발생의 6.6%를 차지한다. 이중의 대부분을 차지하는 두경부 편평세포암종의 경우, 환자의 과반수는 발견 당시 이미 진행된 병기를 보이며, 이들의 5년 생존율도 30% 내외로 매우 저조한 편이다.¹⁾ 따라서 현존하는 수술, 방사선 및 항암제 치료법 외에 질병치료 및 생존율을 증가시키는 새로운 치료법의 개발이 시급하게 요구되고 있으며, 아울러 기존 수술적 치료법의 단점인 기능 장애도 줄일 수 있는 방법도 함께 모색되어져야 한다. 유전자 치료는 원하는 유전물질을 치료목적으로 환자의 조직 내에서 발현시키는 치료법으로, 두경부 편평세포암종에서의 종양억제 유전자, 자살 유전자 또는 면역조절 유전자를 이용한 유전자 치료전략들이 실험 단계에 있으며, 기대되는 연구 결과들이 보고되고 있다.^2-4) 이들 유전자 치료전략 중 면역체계자극 전략은 종양세포에 면역조절유전자를 주입시킨 후 방사선 조사로 종양세포의 분열은 억제하면서 종양세포 자체에서 면역조절물질을 분비하도록 하여, 항종양 면역체계를 자극시키는 방법으로, 두경부 종양뿐 아니라 여러 다른 종양에서도 많은 연구가 시도되고 있다.^3-6)
   면역조절물질 중 특히 interleukine-2(IL-2), granulocyte macrophage colony stimulating factor(GM-CSF) 등은 전립선암 및 악성흑색종에서 좋은 실험 결과가 보고되고 있다.^7-9) 원하는 면역조절 물질을 추정되는 종양항원부위에서 발현하게 함으로써 항종양 면역성을 증폭시키는데, 가장 중요한 요소는 유전자 전달 매개체로, 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 여러 가지 물리적 방법이 시도되고 있다. 최근 헤르페스바이러스를 유전자 전달 매개체로 하는 연구가 활발히 진행중이며, 이것은 기존의 다른 유전자 전달 매개체보다 많은 장점을 갖고 있다. 우선 분열하는 세포뿐만 아니라 미분열상태에 있는 세포에도 효율적으로 감염을 일으키며, 숙주세포에 감염되는 시간이 수시간 이내로 매우 짧고, 감염률도 타 방법에 비하여 매우 높다. 또한 유전자의 크기가 크기 때문에(15 Kb) 원하는 유전자의 이입에 제한이 적다는 장점들이 있다.^10-12)
   본 연구는 헤르페스바이러스의 단백질막을 형성하는 부분의 유전자(gH)를 삭제시킨, 유전적으로 변형된 DISC 바이러스(defective infectious single cycle herpes simplex virus)를 유전자 전달 매개체로 사용하였다. 이 바이러스는 원래 헤르페스 감염에 대한 백신으로 만들어진 것으로 그 특성상 숙주 세포에 감염되어 증식되나, 그 후손들(progeny)은 감염능력이 상실되어 다른 세포에 감염될 수 없다.¹³⁾
   본 연구의 목적은 다음과 같다. 첫째, 방사선(10,000 cGy)을 조사하여 분열능력을 없앤 반면, 종양세포의 항원성은 그대로 가지고 있는 종양세포(SCC VII)에 IL-2 또는 GM-CSF와 같은 면역조절 유전자를 DISC 바이러스를 매개체로 하여 이입시킨 후 종양세포에서의 면역조절 유전자 및 면역조절 단백질의 발현을 증명한다. 둘째, 이렇게 만든 종양백신을 종양세포에 특이적이며, 면역능력을 지닌 순종 쥐에 주사후, 투여된 신선한 동종 종양세포에 대한 항암효과를 알아봄과 동시에 효과적인 면역조절유전자를 선정하여, 궁극적으로는 두경부 편평상피암종에 있어서 유전자 치료로서 종양백신의 종양 억제 가능성을 살펴보고자 하였다.

재료 및 방법

실험 동물
   6 내지 8주된 암컷 C3H/HeJ종의 쥐(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA)를, 병원균이 없는 적당한 조건에서 사육하여, 8~10주 정도의 연령에서 실험에 사용하였다. 종양 모델은 SCC VII 세포주를 이용하여 측배면에 만들었는데, 두경부편평세포암과 매우 흡사한 생물학적 특성과 함께 면역성을 지닌 동물 모델이다.¹⁴⁾

세포주 배양
   SCCVII 세포주는 C3H/HeJ 쥐에 자연 발생한 표피의 편평세포암이다. 세포주의 종양발생능력을 극대화시키기 위해 세포주를 실험동물에 주사해 종양을 유발시킨 후 멸균상태에서 종양을 적출하여, 콜라겐아제(collagenase)로 처리한 후 세포를 채취하여 사용하였다. 배지는 10% 소의 태아 혈청(fetal calf serum(FCS))이 포함된 MEM(minimal essential media) 배지를 사용하였으며, 37°C, 5% CO² 환경 하에, 주당 2회 계대배양하였고, 3회에서 12회 계대배양(P12) 사이의 세포를 사용하였다.

DISC 바이러스 벡터의 생성
   HSV-2 strain HG52중 glycoprotein H(gH)-deleted HSV-2 바이러스(DISC)를 분리하여, gH를 생성하는 원숭이 신장세포의 일종인 Vero 세포주(CR1)에서 증식시킨 다음 IL-2 및 mGM-CSF유전자를 PIMR3 벡터를 이용하여 HSV-2 strain HG52의 gH 유전자 부분에 삽입하였다.¹⁵⁾ 삽입된 IL-2 또는 GM-CSF 유전자는 CMV early promotors의 조절하에 발현되도록 하였다(DISC-IL2, DISC-GMCSF). 바이러스의 정량화는 CR1 세포주에서의 플라크형성단위(plaque forming unit(pfu))에 근거하여 시행하였으며, 사용할 때까지 -80°C에 보관하였다.

시험관 실험

RT-PCR(reverse transcriptase-polymerase chain reaction) 방법에 의한 IL-2 및 GM-CSF 유전자의 발현 확인
   DISC-GMCSF 및 DISC-IL2에 감염된 SCCVII 세포(SCCVII/GMCSF, SCCVII/IL²⁾에서 GM-CSF 및 IL-2 유전자가 발현되는지를 확인하기 위하여, GM-CSF와 IL-2 유전자에 대한 RT-PCR을 시행하였다. 5×10⁶개의 SCC-VII/GMCSF 및 SCCVII/IL2 세포에서 Rneasy(QIAGEN, USA) kit를 이용하여 RNA를 분리하였다. Oligo-dT primers와 Superscript II RT enzyme(GIBCO/BRL, USA)을 이용하여, first-strand cDNA를 만들었다. cDNA에 남아있을지 모르는 RNA를 제거하기 위하여, RNase 처리를 하였다. RT-PCR 반응의 양성 대조군으로 β-actin을 사용하였다. β-actin의 유전자 발현을 확인하기 위해 사용된 sense와 antisense primers는 다음과 같다.
   Sense：5' CTACAATGAGCTGCGTGTGG 3', anti-sense：5' AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC 3'. PCR 반응은 Perkin-Elmer Gene Amp PCR System 960035를 사용하여, 94°C에서 45초, 55°C에서 45초 , 그리고 72°C에서 45초를 1 cycle로 35 cycle을 시행하였다. RT-PCR 반응에 의해 생성된 DNA 산물의 크기는 528 bp이다. IL-2 유전자의 sense와 antisense primers 염기배열 순서는 다음과 같다.
   Sense：5' AACTGGAGCATTTACTGCTG 3', anti-sense：5' GTGTTGAGATGATGCTTTGAC 3' 동일한 c-DNA를 이용하여 β-actin과 같은 조건에서 PCR반응을 시행하였고, 생성된 DNA산물의 크기는 357 bp이다. GM-CSF의 sense와 antisense primers의 염기배열 순서는 다음과 같다.
   Sense：5' CCCATCACTGTCACCCGGCCTTGG 3', antisense：5' GTCCGTTTCCGGAGTTGGGGGGC 3'. PCR 반응은 72°C에서 90초, 94°C에서 45초, 그리고 60°C에서 45초를 1 cycle로 35회 반복 시행하였다. 생성된 GM-CSF DNA산물의 크기는 279 bp이다. 각각의 PCR 생성물들은 1.5% agarse gel에서 전기 영동하였다.

DISC-LacZ, DISC-IL2 및 DISC-GMCSF 벡터를 이용한 SCCVII 세포주로의 유전자 이입 및 이로 인한 IL-2와 GM-CSF의 생성 측정
   SCC VII murine 편평세포암 세포를 바닥이 편평한 6-well plate(Costar Corporation, USA)에 한 well당 1×10⁶개의 세포 밀도로 평판하였다. 12시간 후 평판된 세포를 방사선(¹³⁷Cs source) 조사량에 따라 다음과 같이 3군으로 나누었다. 제 1 군：방사선을 조사하지 않은 군, 제 2 군：5,000 cGy 조사군, 제 3 군은 10,000 cGy를 조사한 군으로 나누었다. 방사성 조사후 각 용기에서 배지를 제거하고, 인산완충생리식염수(PBS)로 세척하였으며, 이후 DISC-LacZ, DISC-IL2, or DISC-GMCSF vectors를 감염중복도(multiplicity of infection(MOI)) 0, 1, 5, 10, 20으로 1 ml의 배지용액에 준비하여 각 well에 넣었다.
   표식 유전자인 LacZ 유전자를 이입시킨 DISC-lacZ로 2시간동안 감염시킨 세포들은 세척 후, 24시간 후에 1% glutaraldehyde로 고정시킨 후 X-gal(5-bromo-4-chloro-3indolyl-β-D-galactopyranoside；Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA) 용액에 2시간 배양, 염색하였다. 감염의 효율성을 측정하기 위하여, 양성 염색된 세포의 비율을 고배율(200배율)로 3회 측정하였다. DISC-IL2 또는 DISC-GMCSF로 감염시킨 세포들은 2시간 후 각각의 well에서 배지를 제거 후, PBS로 3회 세척하고, 2 ml의 배지용액을 넣었다. 24시간 배양 후 배지용액을 채취하여 원심분리(300 g×6 min) 후 GM-CSF 및 IL-2 생성량을 enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)(R & D Systems, USA)를 이용하여 정량화하였다. 모든 실험은 각각의 조건에 따라 2회 중복 시행하였다.

동물 실험

DISC-IL2와 DISC-GMCSF를 이용한 종양백신(SCCVII/IL2, SCCVII/GMCSF) 투여후 동종의 신선 종양세포(SCCVII) 투여시 항암효과
   8~10주 연령의 C3H/HeJ mice를 무작위로 20마리씩 5개 군으로 나누었다(N＝20/group). 각각의 실험군은 다음과 같다. 제 1 군(제 1 대조군)：인산완충생리식염수(PBS)로 백신 치료한 군, 제 2 군(제 2 대조군)：방사선 조사된 SCC-VII 세포로 백신 치료한 군(SCCVII), 제 3 군：방사선 조사후 DISC-IL2로 감염시킨 SCCVII 세포로 백신 치료한 군(SCCVII/IL-2), 제 4 군：방사선 조사후 DISC-GMCSF로 감염시킨 SCCVII 세포로 백신 치료한 군(SCCVII/GM-CSF), 제 5 군：방사선 조사후 DISC-IL2로 감염시킨 SC-CVII 세포와 방사선 조사후 DISC-GMCSF로 감염시킨 SCCVII 세포를 병합하여 백신 치료한 군(SCCVII/GMC-SF＋IL2). 치료군은 종양세포에 방사선을 조사하여(10,000 cGy) 분열능력을 없앤 후 DISC-IL2 또는 DISC-GMCSF 바이러스를 이용하여 IL-2 또는 GM-CSF유전자를 종양세포(SCCVII)에 이입시킨 다음(SCCVII/IL2, SC-CVII/GMCSF), 1×10⁶개의 세포를 50 μl의 부유액으로 종양백신을 만들어, 2일 간격으로 3회 실험동물의 측배면 피하에 백신 주사하였다.
   반면 대조군은 2군으로 나누어 한 군은 백신 대신 생리식염수를 투여하고, 다른 한 군은 방사선만을 조사한 종양세포 부유액(1×10⁶개의 세포를 50 μl)을 투여하였다. 세포의 방사선조사는 ¹³⁷Cs를 이용하여 10,000 cGy 조사하였으며, 이후 DISC-IL2 또는 DISC-GMCSF에 감염중복도(MOI) 10으로 2시간 노출시켜, 4°C, 300×g로 6분 원심분리후 상층액을 제거하는 과정을 3회 반복하여, 바이러스를 제거한 후 백신으로 사용하였다. 백신 치료는 펜토바비탈(pentobarbital, 50 mg/kg intraperitoneal)을 복강내 마취한 후 시행하였으며, 마지막 백신 처치후 1주일 되는 때 동일 배양한 1×10⁵개의 신선한 SCCVII세포를 종양 유발을 위해 피하로 투여하였다. 1주일에 3회 간격으로 실험동물의 종양 생성 및 생성된 종양의 크기를 자로 측정하였으며, 종양의 부피는 타원구의 최대 장축 반지름 길이를 측정하여 ‘a’라하고 여기에 직각이 되는 축의 반지름을 ‘b’라고 하였을 때 4/3 π ab2으로 계산하여 측정하였다. 상기 치료군 중 기존의 형성된 종양에서 종양내로 DISC바이러스를 직접 투여시, 항암효과를 알아보기 위하여 가장 항종양 효과가 뛰어난 군을 설정하였다.

⁵¹Chromium 유리를 이용한 T-임파구의 항종양 세포독성시험
   상기 기술한 종양백신군에서 마지막 백신부터 2주 후에, 멸균하 상태에서 비장을 적출하였다. PBS로 세척후 세그물망을 이용하여 비장세포를 분리하였다. 적혈구 용해 완충용액으로 적혈구를 용해시킨 뒤, RPMI-1640 배지를 이용하여 3회 세척하였다. 2×10⁷개의 비장세포(T-임파구)를 3×10⁶개의 10,000 cGy를 조사한 SCCVII 종양세포와 혼합하여 T-25 배양용기에 넣어 배양하였다. 24시간 후 합성 IL-2(10 Units/ml)를 첨가하여 5일간 배양하였다. 동종의 신선한 5×10⁶개의 종양세포를 100 μci ⁵¹Cr에 1시간동안 노출시켜 배양후, 96-well(U-bottom)을 이용하여, 배양된 비장세포와 1：12.5, 1：25, 1：50, 1：100으로 섞어 분주 후 10시간 배양하였다. 배양판(96-well plates)를 원심분리(200 g×30 sec) 후 Skatron 장치로 상층액을 채취후 γ-counter로 ⁵¹Cr 유리를 정량하였다.

통계학적 분석
   모든 자료는 평균값과 standard error로 표시하였다. 각 군들간의 비교는 대상에 따라 two-tailed students t-test, reapted measured ANOVA test, logrank test를 이용하여 통계학적 검증을 하였다.

결     과

DISC-LacZ, DISC-IL2 및 DISC-GMCSF 벡터를 이용한 SCCVII 세포주로의 유전자 이입 및 이로 인한 IL-2와 GM-CSF의 mRNA 발현과 단백질의 생성 측정
   DISC-IL2 및 DISC-GMCSF를 SCCVII 세포주에 배양기 안에서 2시간 동안 노출시켜 감염을 유발한 후, 24시간 후에 mRNA 및 단백질의 발현을 측정하였다. SCCVII/IL2와 SCCVII/GMCSF에서는 양성 대조군인 β-actin과 함께, IL-2 또는 GM-CSF mRNA를 확인할 수 있으나, 대조군에서는 IL-2 또는 GM-CSF의 mRNA는 발현되지 않았다(Fig. 1). 얼마나 많은 숙주세포에서 DISC바이러스의 감염과 함께 유전자 전달이 이루어졌는가를 알아보기 위해 표식자 유전자인 LacZ 유전자를 이입한 DISC-LacZ를 SC-CVII 세포에 2시간 노출시킨 후 24시간 배양하여 X-gal 염색을 시행한 결과, 감염중복도 10(MOI＝10)에서 90±7.9%의 세포가 양성반응을 보였다(Fig. 2). 이는 방사선을 5,000 cGy 및 10,000 cGy 조사한 세포에서도 각각 85±6.8%, 83±10.2%의 세포가 양성 반응을 보여, 방사선조사 여부에 관계없이 효율적인 세포감염 및 유전자 전달이 이루어짐을 관찰할 수 있었다. DISC-GMCSF 또는 DISC-IL2 바이러스를 감염중복도 1, 5, 10, 20으로 감염을 시켜 각각의 싸이토카인의 생성양을 ELISA 분석 방법(R & D System)으로 측정한 결과, IL-2는 2,000 pg에서 8,500 pg까지, GM-CSF는 1,800 pg에서 6,500 pg까지 생성되었다. DISC 바이러스에 의해 유전자의 이입이 일어나지 않은 대조군 SCCVII 세포주에서는 IL-2나 GM-CSF의 mRNA와 단백질의 발현이 관찰되지 않았다. 특기할 만한 사실은 DISC-mGMCSF 또는 DISC-IL-2 바이러스를 감염중복도 1, 5, 10, 20으로 5,000 cGy와 10,000 cGy로 방사선을 조사한 SCCVII 세포주에 감염시킨 결과, 방사선을 조사하지 않은 세포와 비교해 거의 비슷한 정도의 GM-CSF 또는 IL-2가 생성됨을 관찰할 수 있었다(Fig. 3).

DISC-IL2와 DISC-GMCSF를 이용한 종양백신(SCCVII/IL2, SCCVII/GMCSF) 투여 후 동종의 신선 종양세포(SCCVII) 투여시 항암 효과
   DISC-IL2와 DISC-GMCSF 바이러스를 이용하여 IL-2와 GM-CSF유전자를 종양세포(SCCVII)에 이입시킨 다음, 이 종양세포에 방사선을 조사하여(10,000 cGy) 분열능력을 없앤 후 1×10⁶개의 세포를 50 μl의 부유액으로 종양백신을 만들어, 2일 간격으로 3회 실험동물의 옆구리 피하에 백신 주사하였다. 마지막 백신 투여후, 1주일 후에 1×10⁵개의 신선한 동종의 종양세포를 50 μl의 부유액으로 만들어 종양을 유발시키기 위해 실험동물의 측배면 피하에 주사하였다. DISC-IL2와 DISC-GMCSF 바이러스를 이용한 종양 백신을 투여한 군에서 의미 있는 항종양 효과 및 무병생존율을 관찰할 수 있었다(p<0.01)(Fig. 4). 또한 이들 치료 군에서 의미 있는 종양 성장 억제 효과도 관찰할 수 있었다(p<0.01)(Fig. 5). 대조군인 방사선만을 조사한(10,000 cGy) 종양세포를 투여한 군은 생리식염수만을 투여 후 종양 유발을 한 군과 무병생존율이나 종양의 성장 억제 효과에 있어 차이가 없었다. SCCVII/IL2, SCCVII/GMCSF, SCCVII/IL2＋SCCVII/GMCSF의 세 가지 종양백신 치료군 중 SCCVII/GMCSF와 SCCVII/IL2＋SCCVII/GMCSF으로 백신 치료한 치료군이 SCCVII/IL2으로 백신 치료한 군보다 의미 있는 발병억제와 무병생존율 및 성장 억제 효과를 보였다(p<0.05). 종양세포 투여후 21일째 무병생존 동물 수는 SCCVII/IL2으로 백신 치료한 군은 20마리중 0마리였으나, SCCVII/GMCSF 또는 SCCVII/IL2＋SCCVII/GMC-SF으로 백신 치료한 치료군은 각각 20마리 중 8마리로 우수한 항종양 효과를 보였다. 그러나 SCCVII/GMCSF와 SCCVII/L₂＋SCCVII/GMCSF로 백신 치료한 치료군 사이는 발병억제와 무병생존율 및 성장 억제 효과에 있어 차이가 없었다(Table 1). 따라서 세 종류의 종양백신 중에서 SCCVII/GMCSF가 가장 효율적이었다.

⁵¹Chromium 유리를 이용한 T-임파구의 특이적 항종양 세포독성시험
   DISC-GMCSF를 이용하여 만든 종양백신(SCCVII/GM-CSF)을 치료한 군의 비장세포에서 대조군 및 SCCVII/IL2 치료군에 비해 의미 있는 특이적 종양세포 살상 능력을 관찰할 수 있었다(p<0.01). 그러나 SCCVII/GMCSF와 SCCVII/IL2＋SCCVII/GMCSF 치료군 사이는 비장세포의 특이적 종양세포 살상 능력에 차이가 없었다(Fig. 6).

고     찰

   지난 30년간 수술 및 방사선 치료법의 발달에도 불구하고 두경부 편평세포암종 환자의 생존율은 답보상태에 있으며, 따라서 새로운 치료법의 개발이 요구되고 있다. 이제까지 많은 항종양 면역치료법이 시도되었으나 만족할 만한 결과를 보이지 못하였다. 그러나 그 원인은 종양항원이 없어서라기보다는 효과적인 항종양 반응을 유발하지 못함에 기인된다고 생각하며,¹⁶⁾¹⁷⁾ 따라서 항종양효과를 더욱 높이기 위해, 유전자 치료전략 중 종양에 대한 면역반응을 강화시키는 연구가 활발히 행하여지고 있다.
   대표적인 유전자 치료전략의 하나는 유전적으로 변형된 종양백신을 이용하는 것이다. 종양 백신의 개념은 Prehn과 Main이 처음 보고하였는데 단순히 종양의 절제후 동질의 종양세포를 투여하면, 종양의 형성이나 성장이 억제된다는 면역예방(immunoprophylaxis)을 입증한 것이었다.¹⁸⁾ 종양 백신을 만들기 위해서는 종양의 항원이 필요하기 때문에 종양세포 추출물, 종양세포내 펩타이드, 열쇼크단백(heat-shock proteins) 등을 항원으로 이용하려는 연구가 진행되고 있으나, 특이적 종양 항원의 정체는 아직 규명되지 않은 상태이다. 아울러 동종의 종양항원을 사용했을 경우 주요조직적합항원의 상이함으로 백신으로서의 유용성이 떨어진다는 단점이 있다. 따라서 최상의 방법은 추정되는 종양 항원을 모두 가지고 있는 자가 종양조직으로 백신을 만드는 것이라 생각한다. 본 연구에서는 자가 종양조직으로부터 세포를 분리하고, 방사선을 조사하여 종양의 항원성은 유지한 채, 세포의 분열능력을 없앤 종양 백신을 만들었다. 이후 종양 백신의 면역계 자극을 강화하기 위해 IL-2 및 GM-CSF 유전자를 갖는 DISC 바이러스를 종양 백신에 감염시켜 종양백신 자체에서 면역조절 물질을 분비하게 한 후 항암 효과를 관찰하였다.
   이렇게 유전적으로 변형된 종양백신의 논리적 근거는 다음과 같다. 첫째, 이입된 유전자에 의하여, 사이토카인과 같은 면역조절 물질이 종양세포에서 분비되므로, 추정되는 종양 항원과 밀접한 위치에서 효과적인 농도를 유지시킬 수 있으며, 둘째, 지속적 국소적 분비로 인하여, 사이토카인의 전신적 또는 국소적 직접 투여시 문제되는 짧은 반감기 및 부작용을 피할 수 있고, 셋째, 면역조절물질을 면역반응이 일어나는 곳에 공급함으로써, CD4 T임파구의 주작용을 대신할 수 있다.¹⁹⁾ 유전자치료를 이용한 종양백신의 궁극적 목적은 항 종양면역반응을 향상시키고, 종양에 대한 지속적인 면역능력을 갖게 하는데 있다. 본 실험에 이용된 사이토카인인 IL-2, GM-CSF는 여러 연구에서 항종양 효과가 입증된 면역조절물질이다. IL-2는 CD4 임파구에서 분비되는 주된 사이토카인으로, 주 기능은 CD4, CD8 임파구를 자극하고 활성화시키며, 세포독성 T-임파구의 반응을 효과적으로 유도하는 것이다. GM-CSF는 항원전달 세포의 성장과 기능을 항진시키며, 거식세포나 돌기세포(dendritic cell) 등 항원전달 세포의 주요조직적합항원의 표현을 강화시킨다.²⁰⁾²¹⁾
   두 가지 사이토카인 모두 항종양 면역의 도입단계 즉, 종양항원이 유리되면 항원전달 세포가 종양항원을 섭취 후 공정을 거쳐 주변 림프절로 이동 종양세포의 항원성을 자연 T 임파구에 전달하여 자극하는 과정에 서로 다른 경로로 작용하므로 본 연구에서는 각 사이토카인의 치료효과를 비교하고 또한 병합하여 사용할 때 상승효과가 있는지를 관찰하고자 하였다.
   실험결과 DISC 바이러스는 이들 사이토카인 유전자를 효율적으로 종양세포에 전달하였으며, 이로 인한 항종양효과를 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 DISC 바이러스가 임상적으로 응용될 수 있는 유전자전달 매개체(벡터)로서의 가능성을 제시함과 동시에 종양치료에 적용될 수 있다는 가능성을 제시하였다. 최근까지 연구된 유전자 치료에 있어 원하는 유전자를 전달하는 벡터로는 대부분이 바이러스를 이용하였다. 이중 아데노바이러스와 레트로바이러스가 유용한 벡터로 많이 이용되어 왔으나, 아데노바이러스는 대부분의 숙주가 이 바이러스에 대하여 면역성을 지니고 있으며 반복적 바이러스의 투여시 면역성으로 인하여 벡터로서의 효율성이 떨어진다는 단점이 있으며, 레트로바이러스는 분열이 일어나는 세포에만 감염이 효율적으로 일어나므로, 종양백신과 같이 방사선을 조사해 분열능력이 상실된 세포에서는 부적합한 벡터라고 생각된다.¹⁹⁾ 최근 헤르페스 바이러스가 두경부편평세포암의 유전자 전달 벡터로서 많은 장점을 가지고 있음이 증명되었다.²⁶⁾ 헤르페스 바이러스는 천성적으로 신경조직에 친화성이 있어, 처음에는 신경계 질환의 유전자 치료에 사용되도록 고안되었다.¹⁰⁾
   그러나 바이러스의 감염과정을 살펴보면 처음 피부나 점막표면의 감염을 시작으로, 분열 및 증식과정을 거치므로 이것을 고려해 볼 때, 헤르페스 바이러스 벡터가 상피세포에서 유래한 편평세포암의 유용한 유전자전달 매개체라는 사실을 납득할 수 있다. 최근의 연구에 의하면, 헤르페스 바이러스는 거식세포, 섬유아세포, 간세포, 대장암 및 편평상피암세포에서도 유용한 벡터인 것이 증명되었다.²²⁾²³⁾ 벡터로서 헤르페스 바이러스의 장점은 다음과 같다. 다른 바이러스에 비하여 지놈(genome)의 크기가 크기 때문에(150 Kb), 원하는 유전자를 이입하는데 제한이 적으며, 여러 종류의 세포에 단시간에 효율적인 감염이 가능하며, 무엇보다 가장 큰 장점은 분열하지 않거나 매우 천천히 분열하는 세포에도 효과적으로 원하는 유전 물질을 발현시킬 수 있다는 점이다.¹⁰⁾¹¹⁾ 방사선 조사후 분열이 정지된 세포에서의 감염능력은 유전자 조작에 의한 종양백신 생성에 가장 중요한 요소이다.
   본 실험에서 사용한 DISC 바이러스는 헤르페스 바이러스의 막을 형성하는 gH 부분의 유전자를 제거하고 여기에 원하는 유전자를 이입시킨 것으로, 숙주세포에 감염후 완전한 복제 과정을 거치나, 그 자손들은 유전자 조작으로 인해 감염 능력이 상실된다. 따라서 헤르페스바이러스의 세포독성을 극소화시킨 안전한 바이러스 벡터이다.¹⁰⁾¹⁵⁾ SCC VII 세포주로, IL-2와 GM-CSF 유전자를 이입한 DISC 바이러스를 감염시킨 결과, 감염된 종양세포에서 이입된 IL-2 및 GM-CSF 유전자의 전령 RNA(m-RNA)가 표현됨을 관찰할 수 있었으며, 방사선을 조사하여 분열능력을 없앤 종양세포에서도 IL-2와 GM-CSF의 단백 생성이 효과적으로 일어나고 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 DISC 바이러스가 임상적으로 적용될 수 있는 종양백신의 생성시 유용한 벡터임을 증명하였다.
   앞서 언급한 바와 같이 유전자 치료에 있어, 헤르페스 바이러스 벡터의 주된 장점은 미분열 세포와 느린 속도로 분열하는 세포에도 빠르고 효과적으로 유전물질을 전달한다는 점이다. 이러한 특성은 중요한 임상적 의미가 있다. 종양의 적출로 얻어진 신선한 종양조직에서 종양세포를 분리하여 별도의 배양 과정 없이 부유액 상태로 방사선 조사후 원하는 유전자를 지닌 DISC 바이러스에 감염시킴으로써 단시간 내에 유전적으로 조작된 종양백신을 만들 수 있다는 점이다. Tung 등은 헤르페스 바이러스 벡터의 일종인 앰플리콘 바이러스를 이용하여, 20분내에 유전물질의 전달이 일어나며, 세포 부유액 상태에서도 효과적 감염이 일어남을 보고하였다.¹¹⁾ 레트로바이러스나 아데노바이러스 등은 위와 같은 과정시, 별도의 배양과정과 시간이 필요함을 비교하여 보면, DISC 바이러스가 수술 과정 중, 종양 백신을 생성할 수 있는 보다 최적의 바이러스 벡터라고 생각된다.
   본 실험에서 DISC 바이러스를 이용해 IL-2 또는 GM-CSF를 분비하도록 한 종양 백신(SCCVII/IL2, SCCVII/GMCSF)의 투여는, 동종의 신선한 종양세포 주입시 종양의 생성 및 성장이 억제되었다. 반면, 대조군에서는 신선한 종양세포 주입후 7일 이내에 모든 실험동물에서 종양이 발생하였으며, 급속도로 성장하였다.
   SCCVII/IL2, SCCVII/GMCSF 또는 SCCVII/IL2과 SCCVII/GMCSF를 병합한 종양 백신 치료군 중, SCCVII/GMCSF 및 SCCVII/IL2과 SCCVII/GMCSF를 병합한 종양백신 치료군이 SCCVII/IL2 백신 치료군보다 의미 있는 항종양 발생 및 성장 억제 효과를 보였다. 이러한 항종양 효과가 종양백신의 특이적 반응으로 인한 것인지를 확인하기 위하여 시행한 ⁵¹Chromium 유리를 이용한 T-림프구의 특이적 항종양 세포독성시험에서 세포독성 T-림프구의 종양세포 살상능력이 SCCVII/GMCSF를 포함한 종양백신 치료군이 SCCVII/IL2 치료군보다 의미 있게 증가된 양상을 보였다. 본 실험 모델에서는 IL-2에 의한 직접적인 세포독성 T-림프구의 자극보다는 GM-CSF에 의한 항원전달 세포의 분화 및 기능 강화가 보다 효과적으로 항 종양 면역효과를 가져오는 것으로 추정할 수 있으며, 이것은 종양백신에 의해 특이적으로 유발된 항종양 면역반응이며, 일단 면역체계가 자극되어 반응이 효과적으로 일어나면, 별도의 IL-2 투여는 큰 도움을 주지 못하는 것으로 생각한다. 그러나 이것은 백신투여의 시간 간격 및 백신에 의해 분비되는 면역조절 물질의 농도에 변화될 가능성이 있으므로, 더 많은 연구가 필요할 것으로 사료된다.
   종양 백신의 항암효과는 표적이 되는 종양의 부피가 적을수록 증대된다. 대체적으로 이상적인 종양 표적의 크기는 10⁹개 미만의 종양 세포, 크기로는 1.5 cm 미만의 종양이다. 두경부 편평세포암의 주된 치료 실패 원인이 수술 또는 방사선 치료 후 미세 잔존암이나, 미세 전이에 의한 원발부위 또는 국소 재발임을 고려할 때, 종양 백신은 주 치료법보다는 수술이나 방사선치료 후 재발의 원인이 되는 미세 잔존암이나, 미세 전이의 치료전략으로 유용하게 이용될 수 있으리라 생각한다. 위 실험의 결과는 종양백신을 이용한 항암치료시, DISC 바이러스가 유용한 벡터임을 입증하였다. 앞으로 인간의 종양조직에 적용이 가능하리라 생각되며, 종양조직을 이용하여 단일세포 부유액을 만들면, 별도의 배양 과정 없이 수시간 내에 효율적으로 원하는 유전자의 종양세포로 이입이 가능하므로, 종양 백신을 보다 쉽게 생성할 수 있으며, 수술 시야에서 안전하게 투여할 수 있다는 기능성을 제시하였다. 항암치료 요법으로서의 종양 백신은 아직 연구 단계에 있으므로 임상 적용이 이른 감이 있으나, 저자들은 시험관 및 동물 모델에서 매우 우수한 항암 효과를 관찰할 수 있었다.

결     론

   1) DISC-HSV 백터는 in vivo 및 in vitro에서 SCCVII 세포에 효과적인 유전자 이입과 이로 인한 단백질의 발현을 나타내었다.
   2) DISC-GMCSF를 이용한 종양백신(SCCVII/GMCSF) 치료군이 종양유발억제 효과와 성장억제 효과 그리고 T-림프구의 종양 살상능력면에 있어서, DISC-IL2를 이용한 종양백신(SCCVII/IL2) 치료군보다 의미 있게 우수하였고, SCCVII/GMCSF와 SCCVII/IL2 종양 백신의 병합은 SCCVII/GMCSF 단독 백신 효과와 차이가 없었다.
   이상의 결과로 미루어, 본 연구는 발현되지 않은 종양세포의 항원성을 유전자변형을 통해 극대화시켜 면역체계에 노출시킴으로써, 미세전이나 미세잔존암이 주된 치료 실패 원인인 두경부 편평세포암종의 새로운 치료방법으로 응용될 수 있으리라 생각된다.

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