교신저자：황의기, 660-702 경남 진주시 칠암동 92  경상대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   부신경은 뇌신경근(cranial nerve root)과 척수신경근을 갖는다. 뇌신경근들은 의핵(nucleus ambiguus)의 신경세포체 중 미주신경을 구성하는 신경세포체의 옆에 있는 세포체들의 축삭들로 이루어진다. 뇌신경근은 미주신경과 같은 핵에서 기원하며 기능도 유사하므로 실제로는 미주신경으로 간주되기도 한다.¹⁾ 그러나, 부신경의 특수 장기 또는 체성분지에 관해서는 여전히 논쟁의 여지가 많다.²⁾ 부신경은 흉쇄유돌근과 능형근 두 근육의 신경지배를 담당한다. 부신경은 수술로 인해 쉽게 손상 받을 수 있어 이비인후과영역에서 특히 최근 경부곽청술과 발달과 함께 많은 관심과 주의를 가지고 있는 구조물로 부각되고 있으며, 상완신경총 손상이 있을 때 늑간신경과 함께 공여 신경으로 널리 사용되고 있다.³⁾ 따라서 부신경의 신경해부학적 구조와 생리를 잘 파악하는 것은 매우 중요하다. 해부학적으로 부신경의 중추신경로에 대해서는 아직도 완전히 밝혀져 있지 않은 상태이며 특히 부신경의 척수핵의 위치에 관한 연구는 지속적으로 많은 연구가 이루어지고 있다.
   중추신경계에서 특정 신경핵을 찾고 신경로(neural tract)를 밝히는 연구는 과거 수십년간 관심이 집중되어 온 연구분야이다. 부신경 연구의 초기엔 병변유발에 의한 역행성 퇴행성변성기법(retrograde degeneration technique)으로 신경연결에 대한 실험을 한 이후로 많은 보완된 방법들이 있었다. 하지만 이런 방법들은 신경을 통과할 때 상위신경세포로 이동하는 과정 중 연접을 건너가지 못 하거나, 건너가더라도 극히 제한적이라는 한계점이 있었다. 따라서 연속성 있는 신경경로를 확인하기 위하여 무엇보다 신경연접을 건너는 신경추적자(transsynaptic tracer)가 필요하게 되었다. 이런 문제에 대하여 1989년 Strack등⁴⁾이 돼지의 신경친화성 바이러스인 pseudorabies 바이러스 중 Bartha strain(PRV-Ba)을 이용하여 교감신경 일부의 중추신경계통 내에서의 지배를 보고한 이후 90년대에 들어 Card 등⁵⁾은 이 바이러스가 신경추적자로 적합하게 이용될 수 있음을 증명하였다.
   본 연구는 부신경의 경추 척수 부분에서의 흉쇄유돌근을 지배하는 척수부신경의 핵의 위치 확인과 중추신경계통 속에서 지금까지 알려졌던 신경핵보다 더 상위에서는 어떤 연결상황을 가지고 있는지를 신뢰성 있는 추적자를 이용하여 형태학적으로 규명함으로써 부신경의 전반적인 신경축을 재구성하는데 목적을 두고 있다.

재료 및 방법

재  료

실험동물
   체중 250 gm 내외의 성숙한 Sprague-Dawley계 흰쥐 12마리를 암수 구별 없이 사용하였다. 실험동물들은 외부와 격리된 사육장에서 사료와 물을 공급하여 사용하였다.

신경추적자：Pseudorabies 바이러스 및 항체
   Pseudorabies 바이러스의 Bartha strain을 Dr. John P. Card(Univ. of Pittsburg PA)로부터 분양 받아 의과대학에서 증식시켜 사용하였다. 이 strain은 porcine kidney fibroblast(PK15-cell)에서 자란 것으로 사용시 plaque forming unit는 평균 1×10⁸ pfu/ml이고 -70°C에서 냉동 보관하며 주사 직전에 녹여 신선한 것을 사용하였다. 1차 항체는 이 바이러스를 아세톤으로 불활성화시켜 토끼에 주사하여 얻은 rabbit anti-PRV-Ba를 사용하였으며 이들 역시 모두 Dr. John Card으로부터 분양 받아 사용하였다.

방  법

바이러스의 주입
   먼저 흰쥐의 복강내에 Ketamine hydrochloride를 체중 100 gm당 0.15 ml, xylazine hydrochloride를 체중 100 gm당 0.05 ml씩 주사하여 마취시켰다. 마취후 흰쥐의 목에서 흉쇄유돌근을 노출시킨 뒤 유리피펫(glass pipette)이 부착된 Hamilton 주사기를 사용하여 10 μl PRV-Ba를 주입하였다. 역류에 의한 바이러스 누출을 방지하기 위해 신경섬유의 길이방향으로 5~6 mm 정도로 주사바늘 삽입한 후 다시 1~2 mm 후퇴시켜 바이러스가 고일 수 있는 공간을 제공하였다. 주사가 끝난 후 상처를 봉합하였고 70% 알코올로 상처부위를 소독하였다.

조직처리
   바이러스 주사후 72, 96시간이 경과한 후 각각의 쥐를 마취한 후 앞가슴 벽을 열고 오름 대동맥을 통하여 관류고정을 하였다. 관류고정은 먼저 0.9% Nacl에 heparin(1000 IU/1000 ml)을 섞은 용액을 10분간 관류시키고 4% paraform-aldehyde-lysine-periodate를 30분간 관류시켰다. 관류고정후 뇌와 척수를 적출하여 4°C의 같은 고정액에 담아 후고정을 하였고, 20% sucrose 용액에 담가 동결보호(cryoprotection)를 시행하였다. 동결보호가 끝난 조직은 동결절편기를 사용하여 약 30 μm의 관상연속절편을 만들어 6-well plate에 순서대로 보관하였다가 free-floating method로 면역조직화학 염색을 시행하였다.

면역조직화학 염색
   30 μm의 연속절편을 0.1 M sodium phosphate buffer(pH 7.4, 이하 PB라 함)로 두차례 세척한 후 1：10,000으로 희석된 1차 항체에 조직 절편을 담가 실온에서 12시간 반응시켰다. 그 후 조직절편은 실온에서 10분간 3회 PB로 세척하고 2차항체인 biotinylated anti-rabbit IgG(Vectastain, PK-6101)를 1：200으로 희석하여 실온에서 1시간 30분 동안 반응시켰다. 다시 10분간 3회 세척을 거쳐 peroxidase가 표시된 ABC 용액에 담가 1시간 가량 반응시켰으며, PB로 세척 후 20 mg 3-3' diaminobenzidine을 100 ml의 PB에 녹여 기질용액으로 하여 hydrogen peroxidase가 0.03%되게 하여 약 5분간 발색 반응시킨 후 PB로 세척하였다. 발색반응이 끝난 조직은 gelatincoated slide위에 순서대로 올려 건조시키고 cresyl violet으로 대조염색을 한 후 polymount로 봉입하여 광학현미경으로 관찰하였다.

결과분석
   광학현미경에서 관찰된 결과는 현미경상으로 보이는 양성반응 세포의 개수와 염색정도에 따라 실험자 주관적으로 양성반응의 정도에 따라 ＋, ＋＋, ＋＋＋의 grading을 하였다.

결     과

양성반응세포의 양성
   PRV-Ba를 이용한 면역조직화학법을 시행한 결과 중추신경계내 척수부터 뇌간에서 대뇌에 이르는 여러 신경핵을 구성하는 신경세포의 세포몸통(soma), 축삭(axon), 그리고 간수상돌기(stem dendrite)에서 암갈색의 양성반응을 관찰할 수 있었는데, 이들은 타원형내지 다각형의 다극신경세포(multipolar neuron)로 관찰되었다(Fig. 1).

중추신경계내 양성세포의 분포
   12마리의 흰쥐 모두에서 암갈색으로 양성반응을 나타내는 소견이 시간에 따라 순차적으로 특정신경핵을 따라 척수에서 뇌간을 거쳐 대뇌피질로 진행되는 양상을 보였고 일부 신경핵들을 제외하고는 대개 양측에서 정도의 차이는 있지만 유사한 양성세포의 출현을 관찰할 수 있었다(Table 1).

경부척수(Cervical spinal cord)에서의 분포
   제 1, 2 경수신경의 전각(ventral horn)의 내측에서 강한 양성 반응을 보였다(Fig. 2).

뇌간(Brainstem)에서의 분포
   수뇌(myelencephalon)：연수(medulla oblongata)에서는 의문핵(Nucleus ambiguus)에서 강한 양성반응을 보였다(Fig. 3).

전뇌(Forebrain)에서의 분포
   간뇌(diencephalon)에서의 분포：뇌실주위 시상하부핵(periventricular hypothalamic nucleus)에서 보였다(Fig. 4).
   종뇌(telencephalon)에서는 전두엽(frontal lobe)의 운동피질(motor cortex)에서 강한 양성 반응을 보였다(Fig. 5).

양성세포의 시간별 출현양상
   바이러스 주사후 생존 시간별로 나타나는 양성세포를 가진 신경핵을 확인한 결과 시간별로 순차적 출현을 한다는 것을 알 수 있었다.
   바이러스 주사후 생존 기간이 각각 72시간과 96시간인 쥐의 척수, 뇌간, 대뇌를 염색하여 양성 세포를 확인하였는데 바이러스 주사후 72시간 생존 쥐에서는 척수에서 시작하여 연수쪽과 중뇌를 거쳐 간뇌의 뇌실옆핵까지의 신경핵에서 양성세포를 관찰할 수 있었다. 96시간 생존 쥐에서는 시상하부근처와 대뇌 전두엽의 운동피질에까지 양성세포를 관찰할 수 있었다.

고     찰

   본 연구는 pseudorabies 바이러스를 이용하여 지금까지 부분적으로만 증명이 되었던 부신경의 말초부위에서부터 대뇌피질까지의 연결을 선택적으로 그리고 연속적으로 보인 최초의 형태학적 연구라 할 수 있다. 부신경과 같은 운동신경의 중추내 특정신경핵을 찾고 신경로를 밝히는 연구는 과거 수십년동안 다양한 동물과 여러 가지 방법으로 연구되어져 왔다. 중추내 특정신경핵을 찾고 신경로를 밝히기 위해서 여러 가지 추적자를 사용해 왔었는데 과거 1940~50년대에는 염색질융해(chromatolysis), 축삭융해(axolysis), 뇌의 전기자극(electrical stimulation) 또는 뇌실 표면이나 연수에 국소병변을 두고 말초신경을 염색하여 축삭의 퇴행변성(degeneration)이나 재생(regeneration)을 관찰하는 병변유발기법이 이용되어왔다.⁶⁾⁷⁾ 그 후 60~70년대에 acetylcholinesterase를 조직화학염색(histochemical stain)으로 확인하거나 CoCl₂ 용액으로 말초축삭에 수동충전(passive filling)하는 방법을 썼으나 해독이 어렵거나 선택적 자극방법의 어려움으로 민감도(sensitivity)가 떨어지는 문제점들이 있었다.⁸⁾ 최근들어 축삭과 세포질 사이의 물질이동(axoplasmic flow)의 원리를 이용하여 신경세포체나 신경섬유에 특정물질을 추적자로 주입하여 신경로를 찾아내는 방법 등이 널리 응용되어 왔다. 이와 같은 물질 중에서 가장 보편적으로 쓰이는 추적자로는 fluorogold, nuclear yellow, true blue와 같은 형광물질이나 방사선동위원소에 표지된 단백질 또는 horseradish peroxidase(HRP) 등의 효소들이 쓰여지고 있다.
   부신경핵의 위치에 관한 연구는 인간배아(human embryo), 고양이, 양, 토끼, 말과 소 등에서 역행성 퇴행성변성기법(retrograde degeneration technique)을 이용하여 연구하였다.⁹⁾ 1978년 Rapoport는 고양이에서 HRP를 이용하여 부신경이 지배하는 흉쇄유돌근과 능형근의 척수신경핵의 위치를 확인하였다. 흉쇄유돌근은 전각(ventral horn)의 내측배와위(medial and dorsal column)에, 능형근 운동뉴런은 외측면 즉 전각의 측면각(lateral edge)에 위치함을 밝혔다.¹⁰⁾ 1980년 J. Gottschall은 쥐에서 HRP를 사용하여 흉쇄유돌근의 운동뉴우런이 뇌간척수 이행부위(transitionzone brainstem spinal cord)에서부터 제 3 경추마디(3rd cervical segment)까지 위치하며, 문측(rostral part(TZ,C1))에서는 전각의 내측배외위(dorsomedially)에서 미측(caudal part(C2,C3))에서는 측면으로 이동함을 밝혔다.¹¹⁾
   또한 1977년 Martin등¹²⁾이 cobalt sulphide precipitation technique을 이용하기도 하였다. 그래서 형광추적자(fluorescent tracer, primulin)를 사용하여 역행적 축삭전달(retrograde axonal transport)의 Cytophoretic quantification방법, 역행적 HRP주입과 전향적 자동방사선사진술(anterograde autoradiographic techniques)의 병합 등과 같은 방법들이 등장하기도 하였다. 이러한 방법을 이용한 연구는 비비에서 흉쇠유돌근을 지배하는 부신경의 핵은 연수하부부터 제 2 경부척수(upper C2 spinal cord level)까지, 능형근을 지배하는 부신경의 핵은 두 번째 경추에서 5번째 경추까지 연장되어 있음을 밝혔다. 전향적으로는 Phaseolus vulgaris leucoagglutinin(PHA-L)나 wheat germ agglutinin-horseradish peroxidase(WGA-HRP) 주입하는 방법 그리고 역행적 cholera toxin B subunit(CTb) 주입하여 특이성(specific)있게 필요한 신경로를 확인하기도 하였다.⁴⁾
   그러나 위와 같은 추적자들은 중추신경이나 말초신경을 통과할 때 상위신경부분으로 이동할수록 그 농도가 희석되며 신경축삭을 통해 상위신경세포로 이동하는 과정 중 연접을 건너가지 못하거나 건너간다 하더라도 극히 제한 적이라는 한계점을 갖고 있다. 따라서 이미 밝혀진 하위신경핵에 위와 같은 종류의 추적자를 재주입하여 상위신경핵을 관찰하고 다시 같은 자리에 추적자를 주입하여야 했다. 그러나, 뇌 속의 극히 작은 신경핵에 선택적으로 추적자를 주사하는 것이 쉽지 않고, 주사시 주입 부위 뇌의 손상을 피할 수 없었다. 또한 주입부위의 신경핵내에 있는 신경세포들은 단일 장기만을 지배하기 위하여 독립적으로 할당된 것이 아니라 신체 여러 부위에 공급하는 다른 신경핵들과도 연결되어 있기 때문에 단일 근육만을 특이하게 지배하는 신경로를 규명하는데 어려움이 있다. 이러한 문제점 때문에 근간에 말초부위에 1회 주사한 후 신경연접을 건너갈 수 있고 신경세포를 따라 증식 이동함으로써 추적자 표식이 약화되지 않는 장점을 가진 신경계 친화성인 Herpes viridae 바이러스에 속하는 Pseudorabies 바이러스가 새로운 추적자로 주목을 받고 있다. 이는 바이러스의 신경종말에서의 흡수와 세포체로의 역방향 이동을 처음 발표한 이후 신경연접부의 통과 및 역방향 정방향으로의 이동성 여부 등이 많은 연구들에 의하여 증명되어졌다. 이 바이러스의 신경말단에서의 흡수와 신경연접을 건너 주입부와 관련된 다음단계의 신경으로 이동하는 기전은 바이러스의 envelope에 있는 특정한 당단백질과 신경세포체의 수용체가 결합한 후 주로 함입(endocytosis)에 의하여 세포체내로 들어가서 DNA를 방출하고 핵내에서 복제, 증식되고 axoplasmic flow와 함께 신경연접으로 방출되어 이에 접하는 다음 단계의 신경으로 건너가는 것(transsynaptic transport)으로 추측되고 있다.⁴⁾⁵⁾ 이들 pseudorabies 바이러스에는 돼지에서 치명적인 간경계 질환을 일으키는 야생형의 Becker strain과 약독화시킨 Bartha strain이 있다. Bartha strain은 병독성을 나타내는데 필요한 몇 종의 당단백질이 소실된 것으로 백신용으로도 쓰여진 바 있고, 사람에게도 감염된 보고가 없어서 비교적 안전하게 실험에 사용할 수 있으며 전자현미경하에서의 그 구조가 독특하여 특정 염색을 하지 않아도 주변 세포소기관과 쉽게 감별이 된다는 장점이 있다.¹³⁾
   앞에서 언급하였던 형광물질이나 HRP 등의 추적자를 이용한 방법들은 추적자의 한계로 인해 상위 신경핵간의 연속적 신경연결을 규명하지는 못하나 지금까지 추적된 부위는 본 실험결과와 부합하고 있다. 일반적으로 부신경핵은 지배하는 근육에 따라 위치가 다르게 나타나고 있는데, 흉쇄유돌근을 지배하는 운동핵은 제 1, 2 경수신경에 분포하며, 전각(ventral horn)의 내측에 위치하며, 능형근을 지배하는 운동핵을 제 2, 3, 4 경수신경에 분포하며 전각의 복외측(ventrolateral lesion)에 위치한다.¹¹⁾ 본 실험에서는 능형근에는 바이러스를 주입하지 않고, 흉쇄유돌근에만 바이러스를 주입하여 72시간, 96시간 경과한 쥐 모두에서 제 1, 2 경수신경의 전각(venral horn)의 내측에서 강한 양성 반응을 보임을 관찰하였다. 부신경의 뇌신경근은 미주신경과 같은 핵에서 기원하며 기능도 유사하여 미주신경으로 간주될 수 있어 부신경의 중추 신경로에 관한 연구된 문헌은 없는 실정이다. 본 실험의 결과에서는 의문핵에서 강한 양성반응을 관찰할 수 있었던 것은 Lesile등¹⁴⁾은 choleratoxin-HRP(CT-HRP)를 위의 벽에 주입한 후 관찰한 결과와 일치하는 소견을 보이고 있으며, Lee 등¹⁵⁾이 CT-HRP 형광물질을 인두, 목부분분의 식도, 가로막아래 식도부분에 주입한 후 관찰한 결과와 일치하는 소견을 보였다. 따라서 PRV-Ba가 이 선택적인 양성반응을 보인 것은 부신경의 척수핵을 경유하여 의문핵으로 이동한 결과로 보여진다. 더욱이 본 실험결과 의문핵(nucleus ambiguus)에서 강한 양성 반응이 관찰되었는데 이는 Rinaman등¹⁶⁾이 CT-HRP를 이용하여 보고한 결과와 같은 결과로 바이러스 이동이 선택적이라는 점과 신경연접을 건너갔다는 것을 입증하고 있다고 사료된다. 그리고, 의문핵에서부터는 양측성으로 양성 반응을 보였다. 이것은 바이러스가 반대쪽으로 이동하는 교차로(cross over) 현상으로 보이며, 아직 보고되지 않은 다수의 신경로(multiple neural pathway)가 존재하는 것으로 사료된다.
   본 연구에서는 부신경의 경부척수 부위에서 흉쇄유돌근을 지배하는 부신경의 핵의 정확한 위치 파악과 동시에 중추신경로에 대한 전반적인 신경축을 재구성할수 있었다. 주입한 바이러스의 농도와 시간을 더욱더 폭넓게 잡았을 때의 변화양상, 그리고 의문핵에서부터 양측성으로 나타나는 교차로 현상, 주위 다른 신경으로의 감염여부에 대해서는 추가연구가 필요하리라 생각되며, 동시에 능흉근 속으로도 바이러스를 주입하여 수십 년간 연구되어온 척수에서 부신경핵의 지배 근육에 따른 위치 이동에 관해 검증하고 그 두핵의 위치 차이에 따른 중추신경로의 차이에 관해 비교 연구 할 필요가 있을 것으로 사료된다. 또한 최근 이들 바이러스의 유전적조합에 대해서도 많은 연구가 되고있어 바이러스감염의 치료적 측면에서도 일조 할 수 있을 것이라 생각된다.

결     론

   Pseudorabies 바이러스를 흰쥐 부신경의 지배하에 있는 흉쇄유돌근에 주입한 결과 양성반응세포는 제 1, 2 경수척수의 전각 내측에서 관찰되었고, 연수의 의문핵, 간뇌의 뇌실주위 시상하부핵, 대뇌피질의 전두엽의 운동엽을 포함한 전뇌에 이르기까지 모두 특정 신경핵에서 관찰되었다. 이러한 바이러스 신경추적자를 통하여 면역조직화학적으로 추적함으로써 부신경의 중추신경로를 구성하는 신경연결을 확인하고, 동시에 부신경의 척수핵의 위치를 확인하여 전반적인 신경축을 재구성 할 수 있었다(Fig. 6).

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