교신저자：김상현, 100-196 서울 중구 을지로 6가 18-79  국립의료원 이비인후과
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서     론

   악성 종양의 침윤과 전이기전에 관해 많은 연구가 있었으나, 아직까지는 정확하게 밝혀지지 않은 실정이다. 종양세포간의 부착기능을 소실하거나, 종양세포와 숙주세포사이에 새로운 부착기능을 획득하여, 혈관 기저막과 세포외 기질의 파괴가 일어나게 되면 종양세포의 이동력이 증가하게 되어 종양의 침윤과 전이가 발생하게 될 것으로 추측된다.¹⁾²⁾ 따라서, 세포표면 부착수용체들과 세포외 기질의 변화가 종양의 침윤과 전이와 관련되어 일어날 것이라고 생각 할 수 있다.³⁾
   CD44는 hyaluronate에 대한 세포표면 부착수용체로서 세포의 유착에 관여하는 당단백이다.^1)2)3)5) 이들의 역할은 림프구와 내피세포의 상호작용, 세포와 세포외 기질 단백질의 접합, T 세포의 활성과 접합, 전이등에 관여하는 것으로 보고되고 있다.^1)2)3)4)5) 최소 20개의 exon이 존재하는 막통과 당단백으로써 RNA접합 과정중 exon6에서 exon15 사이에서 교대성 접합(alternative splicing)이 이루어져 여러 아형(CD44 variants)들이 만들어진다(Fig. 1).^1)2)3)4)5) 현재 대장암, 비호치킨성 림프종, 유방암 등에서 암의 진행과 전이에 여러 CD44아형들이 관련되어 있다고 알려져 있다.^1)2)3)4)5) 이에 저자들은 암의 전이, 예후와 관련이 있다고 의심되고 있는 CD44s, CD44v3, CD44v6를 사용하여 두경부 편평세포암종으로 진단된 두경부암 환자의 파라핀 포매조직을 이용하여, 면역조직화학적 방법을 통하여 이들의 두경부 편평세포암종에서의 발현정도와 원발병소의 병기, 경부 림프절전이, 병리조직학적 분화도, 생존율 등과의 관련성에 대한 통계적 분석을 통하여 세포표면 부착 수용체의 발현양상이 갖는 예후인자로써의 의의를 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

대상 및 재료
   1991년 1월부터 1999년 12월까지 본원에서 두경부 편평세포암종의 진단 하에 수술 치료를 시행한 환자 중 파라핀 포매조직의 이용이 가능한 41명의 환자를 대상으로 하였다. 환자의 평균나이는 59.1세로 32세부터 87세까지 다양했으며 남녀의 성비는 6：1(35：6)이었으며, 발생부위별로는 후두암이 24예(58.5%), 인두암 9예(22%), 구강암 8예(19.5%)였다. 추적관찰기간은 1개월부터 113개월까지이며 평균 33개월이었다. 원발병소의 병기는 T1은 15예(36.5%), T2는 7예(17%), T3는 8예(19.5%), T4는 11예(27%)였으며, 경부 림프절로의 전이가 있는 경우는 14예(34%)였고 경부전이를 관찰할 수 없었던 경우는 27예(66%)였다. 조직병리학적 분화도는 고분화도는 13예(32%), 중분화도는 18예(44%), 저분화도는 10예(24%)였다.

면역조직화학적 염색방법
   수술시 적출 되어 파라핀 포매되어 보관중인 조직 중 종양세포가 가장 광범위하게 포함된 것을 골라 5 μm 두께의 연속 절편으로 만들어 silanized slide(DAKO corp.)에 부착시켰고, Xylene에 각각 10분간씩 3회 담가 탈파라핀화 과정을 거친 후 100%, 90%, 80%, 70% 에탄올에 3분간씩 처리하여 함수과정을 거쳤으며 흐르는 물로 5분간 세척하였다. 그후 pH 6.0 citrate buffer 용액에 충분히 잠기게 하여 microwave oven에서 15분간 가열한 후 상온에서 PBS 용액에 20분간 방치하여 냉각하였다. 내인성과산화효소의 활성을 억제시키기 위하여 메탄올-과산화수소용액(100% methanol 59 ml＋30% H₂O₂ 1 cc)에 30분간 처치하였다. pH 7.6의 Tris 완충액으로 3분간 세척한 후 Blocking antibody(Dako LSAB＋ kit, Denmark)를 가하고 37°C에서 30분간 반응시킨 후 각 단백에 대한 일차항체를 반응시켰는데, CD44s에 대한 일차항체는 mouse monoclonal antibody(Ig G1)(BMS 113, Bender medsystems, Austria)를 1：50으로 희석하여 사용하였고, CD44 v3에 대한 일차항체는 mouse monoclonal antibody(Ig G1)(BMS 144, Bender medsystems, Austria)를 1：25으로, CD44 v6에 대한 일차항체로는 mouse monoclonal antibody(Ig G1)(BMS 125, Bender medsystems, Austria)를 1：100으로 희석하여 각각 4°C에서 16시간동안 반응시켰다. 그 후 avidinebiotin peroxidase complex(Dako LSAB＋ kit, Denmark)와 결합된 이차항체를 가하고 37°C에서 30분간 반응시킨 후 Tris 완충액으로 세척하였고 streptavidin과 반응시킨 후 발색제로는 3,3-diaminobenzidine-tetra-hydrochloride(DAB；Dako LSAB＋ kit, Denmark)를 반응시켜 세척하였으며 Meyer's hematoxylin으로 대조염색을 실시하여 광학현미경 하에서 관찰하였다.

면역조직화학적 염색의 결과 판정
   현미경관찰은 종양의 중심부를 선택하여 시행하였으며, 100배와 400배 광학현미경 하에서 판독하였고 백분율은 400배 현미경소견 하에서 시행하였다. 수술중 적출된 조직중 병리학적으로 종양의 침범이 없는 편평상피세포의 세포막이 갈색으로 염색된 것을 양성 대조군으로 놓고, 편평세포암종조직의 세포막에 갈색으로 염색된 부분이 전체 종양세포의 0%에서 10%를 차지할 때를 1등급, 11%에서 90%를 차지할 때를 2등급, 91% 이상을 차지할 때를 3등급으로 정하고 이중 2등급과 3등급을 양성 염색발현으로 판정하였다.¹⁾⁴⁾ 각 환자의 병리조직학적 분화도에 따라 고분화도, 중분화도, 저분화도의 세군으로 나누었으며, 1997년 AJCC(American Joint Committee on Cancer)의 분류에 따라 원발병소의 병기, 경부림프절 전이의 병기를 구분하였다. 통계학적 분석은 SPSS program을 이용하여 각 CD44단백들의 원발병소에 따른 염색 발현의 차이와 원발병소의 병기, 경부림프절 전이, 조직학적 분화도에 따른 염색 발현의 차이를 Fisher's exact test를 사용하였으며 유의수준은 p<0.05로 정하였다. 생존율은 Kaplan-Meier 방법을 사용하였고, Log-Rank test로 평가하였으며, 유의수준은 p<0.05로 정하였다.

결     과

   CD44s의 염색발현이 2등급과 3등급으로 분류되어 양성으로 판정된 경우는 총 41예 중 24예로 59%의 양성 발현율을 보였다(Fig. 2). 후두에서는 총 24예 중 16예(67%), 인두는 9예 중 4예(44%), 구강은 8예 중 4예(50%)에서 발생하였으며 발생부위에 다른 차이는 없었다(p＝0.463)(Table 1). 원발병소의 병기에 따라 T1은 15예 중 10예(67%), T2는 7예 중 3예(43%), T3는 8예 중 6예(75%), T4는 11 예 중 5예(45%)에서 양성 발현을 보였으나 통계적 유의성은 없었다(p＝0.451). 조직학적 분화도에 따라 고분화도는 13예 중 8예(62%), 중분화도는 18예 중 10예(56%), 저분화도는 10예 중 6예(60%)에서 양성발현을 보였으나, 통계적 유의성은 없었다(p＝0.945). 경부 림프절 전이가 있는 군에서는 14예 중 5예(36%), 전이가 없는 군에서는 27예 중 19예(70%)에서 염색발현이 관찰되었으며, 전이가 있는 군에서 염색발현이 감소하는 통계적 유의성이 관찰되었다(p＝0.035)(Table 2). 하지만, 염색발현 유무에 따른 생존율에는 차이가 없었으나 Kaplan-Meier 생존곡선에서 염색발현이 관찰되는 군에서 생존률이 높은 경향은 관찰할 수 있었다(p＝0.63)(Fig. 5). CD44v3는 총 41예 중 27예로 66%의 양성 발현율을 보였고(Fig. 3), 발생부위에 다른 차이는 없었다(p＝0.338)(Table 1). 원발병소의 병기와 경부 림프절 전이, 조직학적 분화도에 따른 통계적 유의성은 관찰되지 않았다(p＝0.814, p＝0.410, p＝0.910)(Table 2).
   또한 염색발현 유무에 따른 생존율에는 차이가 없었으나 Kaplan-Meier 생존곡선에서 염색발현이 관찰되는 군에서 생존률이 높은 경향은 관찰할 수 있었다(p＝0.41)(Fig. 5). CD44v6는 총 41예 중 29예로 71%의 양성 발현율을 보였고(Fig. 4), 후두에서는 18예(75%), 인두는 6예(67%), 구강은 5예(63%)에서 발생하였으며 발생부위에 다른 차이는 없었다(p＝0.776)(Table 1). 원발병소의 병기에 따라 T1 은 13예(87%), T2는 5예(71%), T3는 6예(75%), T4는 5 예(45%)에서 양성 발현을 보였으나 통계적 유의성은 없었다(p＝0.158). 조직학적 분화도에 따라 고분화도는 9예(69%), 중분화도는 12예(67%), 저분화도는 8예(80%)에서 양성발현을 보였으나, 통계적 유의성은 없었다(p＝0.765). 경부 림프절 전이가 있는 군에서는 7예(50%), 전이가 없는 군에서는 22예(81%)에서 염색발현이 관찰 되었으며, 전이가 있는 군에서 염색발현이 감소하는 통계적 유의성이 관찰되었다(p＝0.036)(Table 2). 염색발현 유무에 따른 생존율에는 차이가 없었으나 Kaplan-Meier 생존곡선에서 염색발현이 관찰되는 군에서 생존률이 높은 경향은 관찰할 수 있었다(p＝0.46)(Fig. 5).
   또한, CD44s, v3, v6에서 환자의 성과 나이에 따른 통계적 차이는 없었다.

고     찰

   현재 종양의 진행과 전이에 있어 세포표면 부착 수용체의 역할에 대해서 많은 연구들이 진행되고 있다. 세포표면 부착수용체는 Integrins, Cadherins, Immunoglobulin supergene family, Selectins, CD44의 다섯 군이 알려져 있다.³⁾ 이중 CD44는 막통과 당단백으로써 hyaluronate에 대한 세포표면수용체이며, 11번 염색체 단완에 위치하고 20개의 exon으로 구성되어 있다.^{2)3)5)6)7)8)9)} 20개의 exon 중 exon 6부터 exon 15사이의 10개 exon(v1~v10)이 교대성 접합(alternative splicing)에 의해 수와 조합이 다양하게 재접합하고, 이들의 mRNA가 추가로 세포외 영역에 삽입되면 구조와 기능이 다양한 여러 종류의 아형(CD44 variants)이 만들어진다(Fig. 5).^{3)4)8)9)10)11)12)13)14)} 각 세포의 종류에 따라 한가지 혹은 그 이상의 CD44 아형이 발현된다.^1)3)4)6)12) 두경부 영역에 많이 분포되어 있는 각질세포(keratinocyte)에는 exon v3에서 exon v10가 함유되어 있다.^1)12)14)
   이들의 역할은 세포와 세포의 부착, 세포와 기질의 부착, 림프구 활성 등의 폭넓은 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 종양의 단백분해와 세포표면에서의 파괴로부터 조직을 보호한다.^{1)2)3)6)8)11)13)15)} 또한, 최근의 연구에서는 세포와 기질사이의 상호작용에 신호전달을 역활을 함으로써 세포외 기질의 파괴에 작용하는 MMP(matrix metatalloproteinase)의 분비를 제한하는 작용을 하는 것으로 밝혀졌다.⁸⁾¹⁵⁾ CD44의 유전자는 Gunther등¹⁶⁾이 쥐의 취장암의 림프전이에서 CD44v6가 관여한다고 알려진 이후 여러 연구에서 CD44아형의 발현의 증가가 대장항문암, 비호치킨성 림프종, 유방암과 폐암에서 관찰되었고, 특정 CD44아형의 발현이 증가되었을 때 종양의 진행과 전이력이 높아짐이 관찰되었다.^{1)4)6)8)10)11)12)13)17)} Brich등¹⁸⁾은 사람의 흑색종양 세포계에서 CD44s 발현이 낮은 군과 높은 군을 분리하여, 이 두군에서 세포의 이동력, 집합, hyaluronate와의 부착력, 그리고 전이병소의 형성능력에 차이가 있음을 발견하고, CD44s가 종양의 진행과 전이에 직접적인 원인일 것으로 추정하였다. Wielenga등¹⁹⁾은 대장암의 진행에 따라 CD44v6의 발현이 증가되므로 암의 진행과 전이에 CD44v6가 중요한 역할을 할 것으로 생각하였고, 전이가 동반되지 않은 대장암에서 예후인자로서의 유용성을 제시하였다. Koopman등²⁰⁾은 비호치킨 림프종에서 CD44v6 단백의 과발현은 광범위한 전이 및 불량한 예후와 관련이 있다고 보고하였다. 이들의 연구는 CD44의 발현이 높을수록 암의 진행과 전이가 많아 예후가 좋지 않다는 주장이었다. 이에 반해 두경부 영역의 편평세포암종에서의 연구는 다른 결과를 보였다. Michael등¹¹⁾은 정상 후두상피에서 CD44s가 발현되었으며, 후두 편평세포암종에서는 CD44s와 CD44v6의 발현이 증가되었을 때 생존율이 증가되었고, 발현이 감소된 경우는 전이력의 증가되었다고 보고하였다. Kanke등⁸⁾은 CD44v6의 발현이 감소될수록 세포의 분화도가 낮았으며, 경부림프전이가 많았다고 보고하였다. David등⁶⁾은 구강의 정상 각질상피에서도 많은 CD44아형들이 발현되었고, 특히, 구강 편평세포암종의 조직학적 분화도가 낮은 군에서 염색발현이 감소된다고 보고하였다. 이중 CD44v3는 구강 편평세포암종의 분화도가 감소함에 따라 염색발현이 감소되었으나, CD44v6에서는 구강 편평세포암종의 분화도와 염색발현과는 유의한 상관관계가 없다고 보고하였다. Oliveira등⁷⁾은 대부분의 원발 구강 편평세포암종에서 CD44s와 CD44v3, CD44v6가 발현되었으며, 전이암에서는 CD44s와 CD44v3의 발현이 감소되었음을 보고하였으나, 원발암에서의 염색발현의 감소가 전이에 있어 예측지표가 되지 못하였다. 이와 같이 종양의 종류에 따라 특이적으로 CD44의 발현의 양상이 다르며 종양학적으로 의미가 있는 아형의 종류에 차이가 있었다. 저자들의 연구에서는 Michael등¹¹⁾의 연구에서와 같이 경부림프전이가 있는 군에서 CD44s와 CD44v6의 발현이 감소가 통계적으로 의미 있게 관찰되었으나, 이들과는 달리 저자들의 결과에서는 생존율과는 통계적으로 유의한 상관관계는 없었다. 하지만 염색발현이 증가된 군에서 생존율이 증가된 경향이 관찰되었고 이러한 차이는 본 실험의 환자군 숫자가 상대적으로 적고 추적관찰기간이 다소 짧기 때문으로 사료된다.
   또한, Kanke등⁸⁾처럼 CD44v6에서 염색발현이 저하된 경우 경부림프전이가 의미 있게 증가하였으나, 조직학적 분화도에 따라 통계적으로 의미 있는 염색발현의 저하는 관찰되지 않았다. 이는 저자들의 실험에서는 환자군의 숫자가 적고 고른 분화도의 분포를 이루지 않았기 때문으로 생각된다. 저자들의 연구에서는 CD44s와 CD44v6에서 경부 림프절로의 전이가 있는 경우에서 양성 발현률이 낮아지는 통계적 유의성을 보였으며(p＝0.035, p＝0.036), 원발병소의 병기, 조직학적 분화도, 생존율과는 통계적 유의성은 없었다. 또한, CD44v3에서는 어떠한 지표와도 유의한 상관관계를 발견할 수 없었다.
   CD44발현의 감소는 경부 전이된 두경부암에서 나타났으며, 이는 암세포와 주위조직, 주변세포와의 hyaluronate에 의한 결합력이 감소함으로써 일어난다고 생각되며,⁷⁾¹⁷⁾ 또한 CD44가 감소함으로 인해 세포외 기질을 파괴시키는 MMP(matrix metatalloproteinase)가 증가하여 주위로의 침윤이 증가하며, 이러한 기전들에 의해 세포를 고정시키는 CD44기능의 감소는 종양 세포의 전이를 용이하게 하는 하나의 기전이라 생각된다.^8)11)15)

결     론

   CD44단백은 두경부 편평세포암종의 진행에 관여하는 인자로 생각되며 특히, CD44s와 CD44v6는 경부림프절 전이가 있는 군에서 유의하게 염색발현이 감소되는 소견을 보여, 두경부 편평세포암종의 경부림프절 전이에 관여하는 생물학적 예측인자로 사용이 가능할 수 있을 것으로 사료된다.

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