교신저자：박용수, 403-720 인천광역시 부평구 부평 6동 665 가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   Epstein-Barr virus(EBV)는 전 세계적으로 확산된 gammaherpes DNA 바이러스로서 선택적으로 B 림프구를 침범하여 불현성, 지속성 감염을 유발한다. 다른 herpes 바이러스와는 달리 어린 영아부터 감염되며 5세 이후에는 90% 이상 노출된다. EBV는 형질전환 능력에도 불구하고 대부분은 임상증상 없이 일생동안 숙주인 B 림프구에 잠복 감염상태로 상존하며 간헐적으로 잠복상태에서 lytic cycle로 전환되는 바이러스의 활성화로 구강 상피세포에서 바이러스 복제가 일어나 타액으로 배출된다.¹⁾ 잠재감염(delayed primary infection, latent infection)에 의해 전염성 단핵구증과 Burkitt’s lymphoma, 비인강암, Hodgkin’s disease 등 여러 종양과 erythrophagocytosis, 만성피로증후군 등을 일으킨다. 지역적으로는 서구에 전염성 단핵구증이 많은데 비해 동양인에선 인후두암과 소아 림프절비대증이 흔하다. 이러한 EBV에 의한 질병발생의 차이는 감염시기, 인종간의 주조직적합 항원의 차이, EBV 변이주 형성 등을 들 수 있으며 또한 EBV와 관련된 질환은 증가 추세에 있다.²⁾
   EBV는 시험관 내에서 B 림프구를 불멸화시키는데 EBV nuclear antigen 2(EBNA 2)가 중요한 역할을 하게 된다. EBV는 EBNA 2 등의 핵산구조에 따라 1형(또는 A형)과 2형(또는 B형)으로 분류된다. 2형은 1형에 비해 지역적으로 제한되어 Burkitt's lymphoma가 많이 발생하는 중앙 아프리카와 뉴기니아에서 높게 검출된다고 알려져 왔으나 최근에는 Burkitt’s lymphoma가 다발하는 지역뿐만 아니라 미국에서도 거의 비슷하게 발현된다.³⁾⁴⁾ 2형은 1형에 비해 B 림프구를 불멸화시키는 효율이 떨어지며 많은 연구가 되어있지 않다.
   국내에도 인구의 약 95%가 EBV에 감염되어 있을 것으로 추정되고 있지만 아직 EBV에 대한 연구는 이비인후과 영역에선 비인강암, 반전성유두종 등의 종양과 구인두 세척액 및 비인두 조직에서 EBV 검출의 시도가 있었으나 그 유전자형에 대한 연구는 없다. 또 소아의 구인두 세척액을 이용하여 유전자형을 검출하였으나 EBV가 가장 많이 서식하는 조직인 구개편도에서의 EBV 검출 및 유전자형 분류는 없다.
   따라서 본 연구는 성인 및 소아 구개편도에서 EBV 감염의 정도를 파악하고 적절한 조기진단과 유용한 치료법을 개발하는데 토대가 되기 위해 EBV의 DNA 검출률과 그 유전자형 분류를 시도하고자 하였다.

재료 및 방법

재  료
   70명의 성인과 100명의 소아를 대상으로 하였으며 성인은 20명의 편도염 경험이 없는 정상 성인과 만성 편도염으로 수술을 시행한 50명으로 나누었고 소아는 3세에서 15세 미만으로 일년에 3회 이상 만성 편도염을 앓은 환아 50명과 X-ray 검사 및 Egeli와 Inalkac⁵⁾에 의한 방법으로 grade 2 이상인 편도비대(Idiopathic tonsillar hypertrophy) 소아 50명을 대상으로 하였다.

방  법

DNA의 추출
   수술 후 -70°C 냉동고에 보관한 구개편도에서 0.05~0.10 g을 채취하여 500 μl의 proteinase K를 Eppendorf tube에 섞어 하루동안 배양하고 약 10분간 100°C로 끓인 후 실온에 방치하였다. 동량의 phenol-chloroform-isoamylalcohol(25：24：1)을 섞어 10,000 rpm으로 10분간 원심 분리를 시행한 후 상층을 취하여 동량의 chloroform과 isoamylalcohol을 24：1로 섞어 10분간 다시 원심 분리를 시행하였다. 상층액에 2배의 cold alcohol과 0.1배의 3M sodium acetate를 섞어 -70°C 냉동고에 2시간 방치한 후 inverter centrifuge with refrigerator(HMR-150IV, Hanil CO., Seoul, Korea)에서 4°C, 12,000rpm으로 10분간 원심 분리한 뒤 실온에서 건조시키고 50 μl TE buffer(pH 7.2)를 가하여 DNA를 분리하였다.

EBV 검출을 위한 중합효소 연쇄반응(PCR)
   50 μl의 반응 혼합물(template DNA 0.5 μl, upstream primer 1 μl, down stream primer 1 μl, ExTaq Buffer (Takara Shuzo Co. LTD, Shiga, Japan) 5 μl, dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 4 μl 및 증류수)을 만든 후 증발을 방지하기 위해 1~2 방울의 미네랄 오일을 중첩하였다.
   Nested PCR을 시행하기 위해 첫 번째 PCR 후에는 297 bp의 산물이 생기도록 그리고 두 번째 PCR 후에는 208 bp의 산물이 생성되도록 primer들을 고안하여 사용하였다(Table 1).
   Thermal cycler(Perkin-Elmer Cetus Instrument., Norwalk, Connecticut, USA)를 사용하여 1st PCR과 2nd PCR(nested PCR)의 조건은 동일하게 94°C에서 5분간 predenaturation을 시키고 94°C 1분, 50°C 1분, 72°C 1분의 denaturation, annealing, polymerization cycle을 30회 시행하고 72°C 5분간 extension시켰다. β-globin primer로 확인하고 멸균된 증류수를 음성대조로 사용하였다. 중합효소 연쇄반응 산물의 검출을 위해 2% agarose gel electrophoresis를 사용하였다.

중합효소 연쇄반응(PCR)을 통한 EBV의 감염형의 분류
   EBV의 감염형 검출을 위해 EBNA 3C region에서 primer(sense 5’-AGAAGGGGAGCGTGTGTTGT-3’, antisense 5’-GGCTCGTTTTTG ACGTCGGC-3’)를 제작하였다. 10 μl의 반응 혼합물(template DNA 3 μg, Taq polymerase 0.2 μl, 1 μl upstream과 down stream primer, 10 mM dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 1 μl, 10×Buffer 1 μl 및 증류수)을 만든 후 증발을 방지하기 위해 미네랄 오일 한 방울을 중첩하였다.
   Thermal cycler를 사용하여 94°C 5분간 predenaturation하고 94°C 30초, 55°C 90초, 72°C 90초의 denaturation, annealing, polymerization cycle을 40회 시행하고 72°C에서 10분간 extension 하였다. 이때 양성대조로는 1형은 Namalwa 세포를, 2형은 SNU-99 세포를 사용하였고 음성대조로는 멸균된 증류수를 사용하였다. PCR 산물을 검출하기 위하여 5 μl 증폭된 검체를 2% agarose gel로 running하여 확인하였다.

Southern hybridization
   Oligonucleotide 1 μl, Fluorescein-11-dUTP 2.5 μl, cacodylate 완충액 4 μl, 증류수 28.5 μl와 terminal transferase 4 μl를 섞어 37°C에서 70분간 방치한 후 교잡 완충액 25 ml과 탐식자를 섞어 oligonucleotide probe labelling을 하였다. Hybridization하기 전 42°C에서 30분간 반응시키고 labelling된 oligonucleotide 탐식자를 막이 들어있는 용액에 가한 후 다시 42°C에서 반응시켰다. 실온에서 5분간 5배의 SSC와 0.1% SDS로 membrane을 2회 세척한 후 42°C에서 1배의 SSC와 0.1% SDS로 구성된 교잡 완충액으로 10분간 2회 세척하였다. 실온에서 30분간 membrane blocking 후 완충액 1로 세척하고 다시 실온에서 30분간 항체를 반응시킨 후 완충액 2로 5분간 3회 세척하였다. 암시야에서 ECL 3'-oligolabelling detection reagents(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)를 사용, 결과를 확인하였다.

In situ hybridization
   EBV 양성인 20개의 검체를 대상으로 파라핀 포매 조직 절편을 4 μm 두께로 절단하여 Probe on Microscope Slide(Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA) 1/3 하단에 붙인 다음 xylene과 hemode 용액으로 탈파라핀시키고 100% alcohol로 탈수시키고 110°C에서 pepsin으로 permeabilization하고 고농도 염기와 저농도 formamide, 9-sequenced random primer(Maxim Biotech Inc., San Francisco, CA, USA)로 구성된 낮은 stringency 교잡 완충액(hybridization solution)내에 Not I, Pst I EBV oligonucleotide 탐식자(Maxim Biotech Inc. San Francisco, CA, USA)를 혼합하여 EBV의 활동성 감염 검출을 시도하였고 EBV-encoded RNAs(EBERs) 탐식자(c-DNA Probe)(Maxim Biotech Inc., San Francisco, CA, USA)를 혼합하여 EBV의 잠복성 감염 검출을 시도하였다. 즉 이들 탐식자가 혼합된 교잡 완충액을 92.5°C로 가열하여 조직내 EBV 표적 핵산을 변형시키고 40°C에서 교잡이 일어나도록 하고 사용된 탐식자들은 모두 biotin으로 처리된 탐식자이므로 avidin alkaline phosphatase로 확인 결합케 한 후 red chromogen으로 발색시켜 양성 교잡 반응을 얻었다. 이들 모든 과정은 Iezzoni 등에 의해 개발된 모세관 방법으로 Micro probe(Takara Shuzo Co. LTD, Shiga, Japan) 기구 위에서 시행하였다.

통계처리
   각 군간의 EBV 검출과 감염형 분포의 비교는 χ² 검정법, 다중비교를 사용하였다. 통계 프로그램으로는 SPSS를 사용하였으며, p<0.05인 경우 통계적으로 유의한 차이가 있다고 판정하였다.

결     과

구개편도에서의 Epstein-Barr virus의 검출
   편도비대 소아 50명 중 25명, 소아 편도염 환아 50명 중 31명, 성인 편도염 환자 50명 중 36명, 대조군인 정상 성인 20명 중 9명에서 EBV가 검출되었다(Fig. 1, Table 2). 성인 편도염에서 정상 대조군에 비해 통계학적으로 유의하게 높게 검출되었으며(p<0.05), 편도비대 소아에 비해서도 유의하게 높게 검출되었다(p<0.05). 그러나, 소아 편도염 환아 및 편도비대 환아의 경우 정상 대조군에 비해 높은 검출률을 보였으나 통계학적으론 유의한 차이가 없었다.

검출된 Epstein-Barr virus의 감염형 분류
   25명의 EBV 양성인 편도비대 소아 중 25명 모두에서 감염형을 분류할 수 있었으며 1형이 12명, 2형이 4명, 1과 2형이 혼재된 경우가 9명이었다. 소아 편도염 환아는 EBV 양성인 31명 중 29명에서 감염형을 분류하여 1형이 11명, 2형이 4명, 1과 2형이 혼재된 경우가 14명이었다. 성인 편도염의 EBV 양성인 36명 중 33명에서 감염형이 분류되었고 이 중 1형이 15명, 2형이 3명, 1과 2형의 혼재가 15명이었다. 정상 대조군은 9명의 EBV 양성에서 모두 감염형을 분류할 수 있었으며 1형이 7명, 1과 2형의 혼재가 2명이었고 2형만 검출된 경우는 없었다(Table 3, Fig. 2). 4개군 사이에서 1형의 검출률은 통계학적으로 유의한 차이가 없었다. 편도비대, 소아 편도염, 성인 편도염 환자군 모두 정상 대조군보다 2형의 검출이 통계학적으로 유의하게 높았으나(p<0.05) 3군간 유의한 차이는 없었다. 1과 2형의 혼재는 편아비대 18%, 소아 편도염 28%, 성인 편도염 30%로 모두 정상 대조군보다 높은 검출률을 보였으나 통계학적으론 유의한 차이가 없었다.

In situ hybridization
   PCR 양성으로 나온 20예 중 12예에서 EBV in situ hybridization 결과 양성을 확인하였다. 구개편도의 EBV in situ hybridization의 양성 신호는 paracortical area의 림프 증식 세포들 중 hyperemic, hypernucleic 대림프구(blast form)에서 확인되었고 이들 양성 교잡 반응 림프구는 림프구의 특이표면 항원 면역조직화학 검사상 B 림프구로 확인되었다(Fig. 3).

고     찰

  편도염은 이비인후과 영역에서 가장 흔히 발생하는 질환으로 심한 발열, 연하통, 경부림프절 비대 등을 일으킨다. 급성 편도염의 경우 15~30%가 세균에 의해 발생하는데 이중에서 Streptococcus pyogens가 가장 많으며 그 외 Adeno virus와 EBV 등의 virus가 중요 원인이 되는 반면 만성에선 virus에 의한 일차 감염 후 세균의 이차 감염으로 발생하며 이중 EBV가 중요한 역할을 한다. 또한 EBV는 편도비대에 관여하는 것으로 알려져 있다.⁶⁾
   EBV는 Epstein등⁷⁾에 의해 Burkitt’s lymphoma에서 처음 밝혀졌으며 DNA 바이러스로 150~180 nm 크기이며 EBV의 DNA는 172,000 bp로 구성되어 있으며 다른 herpes 바이러스 군처럼 상피세포에서 증식할 수 있다.⁸⁾ B 림프구에서 잠복감염 형태로 영구히 상존하는데, 이러한 EBV의 잠복감염 형태는 매우 특이한 것으로서 이 EBV 잠복감염에 관여하는 유전인자들로는 6개의 핵항원(nuclear antigen) 유전인자인 EBNAs 1, 2, 3A, 3B, 3C 및 LP와 3개의 잠복성 세포막 단백질(latent membrane protein)인 LMPs 1과 2A, 2B, 그리고 EBV encoded small RNAs(EBERs 1, 2)들이 있는데 이 유전인자들은 잠복감염을 유지하고 잠복감염 상태로 생존을 지속하기 위하여 B 림프구의 transformation 증식에 관여한다. 또한 이 유전인자들은 다른 herpes 바이러스의 잠복감염 유전인자와 동종(homology)은 없는 것으로 알려져 있다.²⁾ EBV의 자연숙주는 인간으로 한정되어 있고 감염자의 타액을 통해 다른 사람에게 감염되고, 구인두에서 처음 감염을 일으키고 타액선, 인두의 상피세포 그리고 림프 조직에서 바이러스의 증식이 일어난다.⁹⁾ 다른 herpes 바이러스와는 달리 어린 영아 연령부터 초감염되어 임상 증상 없이 조혈 조직 내에서 잠복감염 상태로 평생을 보낼 수 있는데, 건강한 보균자의 경우 EBV에 감염된 세포의 EBV-specific 세포 면역에 의해 유지되며 EBV-specific cytotoxic T lymphocyte(CTL)가 중요한 역할을 한다.¹⁰⁾ 하지만 반복 감염 등으로 감염성 단핵구증, 자가 림프구 증식증, 만성 피로 증후군의 주요 원인이 되며 종양 발생과도 밀접한 관계가 있어 Burkitt’s lymphoma, 미분화 비인강암, Hodgkin’s disease의 원인이 된다. 이러한 종양으로의 전환 기전은 EBV 감염시 숙주 내에서 EBV를 사멸시킬 수 있는 cytotoxic-T 림프구가 제대로 생성되지 않을 경우 EBV 감염활동에 의한 림프구의 전환성 자극이 극대화되어짐에 따라 point mutation이 결국에 일어나 발생되는 것으로 설명되고 있다.¹¹⁾
   EBV의 역학적 특성과 EBV 관련 질환들의 병인을 규명하는데 있어 EBV 유전자형에 관한 연구가 중요하다.¹⁾²⁾ 그러므로 질병에 따라 다른 양상을 알기 위해 유전자형을 DNA 수준에서 분류하는 것이 중요하다 할 수 있다. 이러한 관점에서 본 연구는 만성 편도염과 EBV 유전자형과의 연관성을 확인하고자 하였다. EBV의 검출방법으로는 대표적으로 중합효소 연쇄반응(PCR)법이나 Southern blot hybridization과 in situ hybridization 등이 있는데 본 연구에선 이들 3가지 방법을 사용하였으며 또한 감염된 세포의 조직내 위치 및 세포내 감염 부위를 알아보기 위해 민감도가 높은 중합효소 연쇄반응에 양성인 검체 20예를 in situ hybridization한 결과 12예에서 양성을 확인하였다. 이러한 질환들에 있어 EBV의 검출은 다양하게 시도되었는데 비인강암의 경우 약 60%에서 100%까지의 높은 검출률을 보였으며¹²⁾¹³⁾ 직접적인 조직의 채취가 아닌 구인두나 비인두의 세척액을 이용한 실험 결과 Hording 등¹⁴⁾은 덴마크인에서 35%, 그린랜드인에서는 81%의 EBV 양성으로 인종간의 차이를 밝혔다. 국내에서도 두경부악성종양과 정상 비인강조직에서 높은 검출율을 보고한 바 있다. Kunimoto 등¹⁵⁾은 일본인에 있어서 혈청학적으로 양성인 정상인에서 23%만이 구인두 세척액에서 중합효소 연쇄반응 양성을 보였는데 급성 편도염은 53%, 만성 편도염은 32%의 검출을 보고했다. 본 연구에선 구개편도 조직을 이용, 소아 및 성인 만성 편도염에서 정상인에 비해 높은 검출률을 보였으며(62~72%), 구인두 세척액을 사용한 검사보다 더 높은 검출률을 보여(45~72%) EBV가 편도염 발생에 중요한 역할을 할 것으로 생각된다.
   EBV의 유전자형 분류에 대한 연구는 EBV가 체내에서 잠복감염 형태로 존재하기 위해 세포의 불멸화에 주도적 역할을 하는 유전인자들 중에 1차 아미노산의 배열 차이가 있음을 확인한 후부터 활발히 진행되었다. EBV는 EBNA 2, 3A, 3B 및 3C 유전인자들의 유전적 다형성(polymorphism)에 의해 1과 2형(A, B형)으로 나뉜다.²⁾ 이러한 두 형은 유전체의 다른 부분에서도 수적 차이를 보인다. 또한 EBNA 2, 3A, 3C는 HLA(Human lymphocyte antigen)에 의한 CTL 면역을 유발하여 EBV 관련 질환의 발생과 정도에 직접적인 역할이 있는 것으로 알려져 있어 EBV 유전자형 연구는 EBV 관련 질환의 병인적 특성을 규명하는 첫 단계로 인식된다.¹⁵⁾ 전체적인 EBV 주(strain)의 특성을 파악하기 위해서는 Eb-notyping, RFLP, C/D polymorphism 등의 EBV 주 분류방법이 있으나 중합효소 연쇄반응법을 통한 감염형 분류가 제일 유용한 방법으로 알려져 있다.¹⁶⁾ 본 연구도 이러한 내용을 토대로 EBNA 3C에서 시발체(primer)를 선택하여 중합효소 연쇄반응을 이용, EBV 감염형 분류를 실시하였다.
   1964년 Epstein 등이 EBV를 발견한 후 1형에 대한 연구는 오랫동안 진행되었으나 2형은 비교적 최근에 중앙 아프리카와 파푸아 뉴기니아의 Burkitt’s lymphoma에서 발견되었고 지역적으로도 다른 분포 양상을 띄는데 EBV 1형은 유럽, 아메리카, 중국을 포함한 동아시아에, 2형은 중앙 아프리카와 파푸아 뉴기니아 지역에 주로 분포하는 것으로 알려져 있다.¹⁷⁾ 그러나, 최근 Burkitt’s lymphoma가 많이 발생하는 아프리카 지역뿐만 아니라 미국에서 정상인에서도 2형이 1형과 거의 비슷하게 검출되었다는 보고가 있다.³⁾⁴⁾ 또한 면역 결핍 환자에서 2형과 1, 2의 혼재형이 높이 검출되었다.⁴⁾¹⁸⁾ 1형과 2형은 생물학적으로 차이를 보이는데 2형은 1형에 비해서 형질변환 효율(transformation efficiency), 성장률 및 포화밀도가 낮고 제한된 농도에서 퍼질 때는 1형에 비해 감수성이 높다. 이러한 점 때문에 2형의 발견이 1형보다 늦게 발견되었고 낮은 검출률을 보인다는 보고도 있다.¹⁵⁾¹⁹⁾ Sixbey 등⁴⁾은 미국에서 구인두 세척액에서 22%의 EBV가 검출되어 이중 EBV 1형은 50%, 2형은 41%, 1형과 2형의 혼재는 9%로 보고하였고, Kunimoto 등¹⁵⁾의 보고에서는 혈청 검사상 90%가 EBV에 양성을 보였고 구인두 세척액에서 1형의 검출은 22%, 2형은 1% 그리고 1, 2형 혼재는 없었다. 반면 급성과 만성 편도염에서 각각 48%와 31%의 EBV 검출률을 보였고 이 중 1형은 각각 47% 및 31%를 보였고 2형은 급성에서만 6%(1예)의 검출률을 보여 지역적으로, 특히 2형의 검출률에 차이를 보였다. 또한 Kang 등²⁰⁾은 국내에서 정상 성인 및 소아의 구인두 세척액을 사용하여 EBV의 검출률이 각각 35%와 14.8%이었고 유전자형은 성인에서 1형과 2형이 각각 33%, 2%, 소아에선 각각 9%, 6%의 결과를 보인 반면 본 연구에선 구개편도 조직에서 EBV 검출을 시도하여 만성 편도염의 성인과 소아에서 각각 72% 및 62%의 높은 검출률을 보였고 정상 성인과 편도비대 소아에서 각각 45% 및 50%의 검출률을 보여 구인두 세척액보다 높은 검출률을 보였다. 또한 유전자형의 검출은 정상 성인에서 1형은 35%, 2형만 검출된 경우는 없었고 1, 2형의 혼재는 10%를 보였고, 편도비대 소아의 경우 1형은 24%, 2형은 8%, 1, 2형의 혼재는 18%를 보였고 성인 및 소아의 만성 편도염의 경우 1형은 30% 및 22%이고 2형은 6% 및 8%로 정상 대조군 및 편도비대 소아와 큰 차이가 없었으나 1, 2형의 혼재는 정상 성인에 비해 높은 검출률을 보여 다른 저자들의 연구 결과와는 큰 차이를 보였다. 이는 구개 편도에서 구인두 세척액에 비해 EBV의 검출이 높음을 의미하며 최근 여러 연구 결과에서 EBV에 의한 다양한 질환들이 EBV 감염형 차이에 따른 것으로 추정함에 따라 편도염에 있어 EBV가 깊이 관여하며 2형이 주요한 역할을 하는 것으로 사료된다.

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