교신저자：이병돈, 140-743 서울 용산구 한남동 657번지 순천향대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   현대 사회가 산업의 발전으로 인하여 대기오염이 심해지고, 산업독성 물질에 폭로될 위험이 증가하고 있을 뿐만 아니라 빈부의 격차가 심해지고, 소비, 향락문화의 만연으로 인해 본드나 연료용 가스 등의 환각물질을 흡입하는 사례가 늘고 있다. 특히 공업용본드는 일상 생활에서 많이 사용하기 때문에 저렴한 가격으로 손쉽게 구할 수 있어 최근에 일부 청소년들이 공업용 본드를 흡입하고 환각상태에서 각종 범죄를 저지르는 경우가 많아 심각한 사회 문제로 대두되고 있다.
   후각상피는 특수하면서도 기능이 복잡하여 냄새를 맡거나 재생되는 기전에 관해서는 아직 충분히 알려져 있지 못하다.¹⁾ 후각상피세포가 교체된다는 사실이 1940년²⁾에 알려졌으나, 1970년대에 들어서야 자기방사법연구(autoradiography)로 기저세포(basal cell)가 분화되어 후각세포(olfactory cell)를 재생한다³⁾는 것이 확인되었으며, 1990년대에는 후각세포는 아폽토시스(apoptosis)에 의해 교체된다⁴⁾는 것이 밝혀졌다.
   후각상피는 위중층원주상피(pseudostratified columnar epithelium)로 후각세포, 지지세포(sustentacular cell or supporting cell) 및 기저세포가 기저판(basal lamina) 위에 있고, 결합조직층의 고유판에 있는 후각선(olfactory gland or Bowman's gland)은 후각상피의 자유면으로 점액을 분비한다. 이와 같이 잘 짜여진 세포체계를 갖고 있는 후각점막은 일반적인 조직과는 달리 재생되는 신경상피라는 특성을 갖고 있다.⁵⁾
   후각상피는 후각세포를 보호하기 위해 후각상피를 덮어주고 유동성을 유지하는 점액을 분비한다.⁶⁾ 또한 지지세포는 긴 미세융모를 내어 후각소포나 섬모를 보호하며 지지세포에는 많은 대사효소들에 의해 후각세포를 보호하고 새로운 냄새를 맡을 수 있도록 한다. 또한 후각세포는 신경세포이지만 정상적으로는 약 한 달 정도의 세포주기를 갖고 다시 재생되기 때문에 손상을 받더라도 후각기능을 계속 유지할 수 있는 재생 능력을 가지고 있다.³⁾
   본드를 반복적으로 흡입하면 중추신경계의 장애뿐만 아니라 호흡기계통에도 이상이 예상되지만, 공업용 본드의 흡입으로 인한 후각점막의 손상이나 피해 양상에 대한 연구는 매우 찾아보기 힘들다. 따라서 본 실험은 공업용 본드가스가 후각상피에 미치는 영향에 관하여 연구할 목적으로 생쥐에게 인위적으로 흡입시켜 후각점막의 손상과 이에 적응해가며 나타나는 변화를 형태학적으로 관찰하고 재생과정을 규명하기 위하여 투과 및 주사전자현미경과 세포조직화학적 방법으로 연구하였다.

재료 및 방법

가스 노출 장치
   가스 노출 장치로 가로, 세로, 높이가 각각 30, 40, 20 cm 크기의 투명 아크릴 상자를 제작하였다. 상자에는 가스를 주입하는 구멍과 가스가 배출되는 구멍 및 가스의 농도를 측정할 수 있는 구멍을 뚫었다(Fig. 1).
   동물 실험에 사용한 본드는 시중에서 가장 많이 사용되는 공업용 D본드(D화학, 경기도, 대한민국)를 사용하였다.

실험 동물
   체중 25~30 g의 건강한 ICR(Institute of Cancer Research) 생쥐 30마리를 대조군 6마리와 실험군 24마리로 구분하였으며, 실험군은 본드가스를 흡입시킨 기간에 따라 3일군, 5일군, 7일군 및 14일군으로 구분하고 각 군마다 6마리씩 사용하였다. 실험 동물을 투명 아크릴 상자에 넣고, 플라스크에 공업용 본드 30 g을 짜 넣은 후, 40°C로 가온한 상태에서 증발되어 나오는 가스를 하루에 한차례씩, 분당 5 L의 속도로 20분간 3일군은 3일, 5일군은 5일, 7일군은 7일, 14일군은 14일 동안 상자 안에 주입시켜 전신에 노출시켰다. 예비실험 결과 본드가스에 노출 20분 경과 후부터 행동이 둔해지고 비틀거리면서 주저앉는 행동을 보였다. 하지만 호흡곤란의 증세는 보이지 않았다. 대조군은 40°C의 공기만을 14일간 주입하였다. 노출되는 본드가스를 차콜검지관(226-09, SKC, PA, USA)에 흡착시켜 가스크로마토그래피로 각 노출 시마다 매회 측정한 결과, 평균농도는 acetone 5212±1268 ppm, c-hexane 3757±711 ppm, methylcyclopentane 1820±375 ppm, n-hexane 139±30 ppm, toluene 0.9±1.4 ppm이었다. 본드가스에 노출 후 24시간이 지난 다음, 마취상태에서 동물을 희생시킨 후 후각점막부위를 실험목적에 따라 표본을 제작하였다.

광학현미경의 표본 제작
   4% paraformaldehyde에 3시간 이상 고정한 다음, 0.5% EDTA(tris buffer, pH 7.4) 용액에서 일주일간 탈회시켰다. 탈회된 조직을 50%, 70%, 90%, 95%, 100% 알콜로 탈수과정을 거친 후에 파라핀에 포매하여 7 μm 두께의 조직표본을 제작하였다. 일반조직의 구조를 관찰하기 위하여 hematoxylin-eosin(HE)염색을, 점액의 변화를 관찰하기 위하여 alcain blue(AB)염색 및 alcian blue-periodic acid shiff(AB-PAS)염색을 시행하였다. HE염색은 파라핀을 제거한 후 hematoxylin에 3분, eosin에 1분 염색한 후 봉입하여 관찰하였다. AB염색은 AB(pH2.5)액에 20분간 염색한 다음 수세하고, nuclear fast read에 대조염색한 후 봉입하여 관찰하였다. AB-PAS염색은 AB액에 5분간 염색하고 수세한 후 PAS액에 반응시켜 관찰하였다.
   세포 증식을 관찰하기 위하여 PCNA항체(anti-prolife-rating cell nuclear antigen, P8825, Sigma, St. Louis, MO, USA)에 대한 면역조직화학염색을 하였다. 면역조직화학염색은 조직표본을 citrate buffer에 넣고 microwave oven에서 10분간 처리하여 조직의 내막으로 항체가 잘 침투되도록 0.3% triton-X 100에서 1시간 동안 처리하였다. 0.3% H2O2-methanol로 내인성 peroxidase를 파괴한 후 20배 희석된 normal swine serum으로 비특이성 반응을 억제시켰다. PCNA항체를 4°C에서 24시간 반응시킨 뒤 PBS(phosphate buffered saline)로 수세한 다음 biotinated anti mouse IgG와 streptoavidine peroxidase를 처리한 후에 diaminobenxidine(DAB)으로 발색시켜 단위길이(1 mm)에서 양성을 보이는 기저세포의 수를 비교하였다.

전자현미경의 표본 제작

주사전자현미경
   마취된 생쥐의 머리를 반쪽으로 절개한 후 코 안을 PBS로 조심스럽게 씻어 점액을 제거한 다음, 2.5% glutaraldehyde에 고정하였다. 3시간 고정한 조직을 다시 0.1 M phosphate buffer, pH 7.4로 씻어낸 후에, 2% osmium tetroxide로 다시 1시간 고정하였다. 고정된 조직은 알콜의 농도를 높여가면서 조직을 탈수한 다음 hexamethyldisilazane(HMDS)으로 건조시킨 후 15~20 nm 두께로 금코팅하여 후각세포 표면의 변화를 JSM 5410 LV 주사전자현미경(JEOL, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.

투과전자현미경
   절취한 조직을 2.5% glutaraldehyde-1.5% paraformaldehyde액에 고정한 뒤, 7일간 탈회한 조직을 1% osmium tetroxide액에서 다시 3시간 동안 2차 고정하고, 알콜로 탈수한 다음에 araldite mixture에 포매하였다. 포매된 조직을 1 μm 두께의 절편으로 만들어 toluidine blue로 염색하여 후각점막부위를 선택한 후에 LKB-V ultratome으로 60~70 nm 두께의 투과전자현미경용 절편을 작성하였고, uranyl acetate와 lead citrate로 대조염색하여 후각세포의 미세구조적 변화를 JEM 100CXII 투과전자현미경(JEOL, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.

결     과

공업용 본드가스에 의한 후각상피의 광학현미경적 소견

HE염색 결과
   대조군의 후각상피는 기저판 위에 후각세포, 지지세포 및 기저세포로 구성된 위중층원주상피로 대체로 5~10개의 세포핵층을 이루고 있었다. 후각상피를 이루는 세포핵 중 가장 위층은 대부분 지지세포의 핵으로서 길죽한 타원형이며, 후각세포의 핵은 원형으로 지지세포핵의 아래에 여러 층을 이루고 있었다. 기저세포의 핵은 기저판 위에 한 층으로 배열되어 있으며 원형이었다(Fig. 2A).
   3일군의 후각상피는 상피가 탈락되고 세포핵이 2~3층으로만 구성된 모습도 자주 관찰되었고, 맨 위층의 상피세포는 납작한 세포로 변화하였다. 상피에서 탈락된 많은 세포들이 내강으로 배출되었으며, 고유판의 혈관이 확장되었다. 후각선의 내강이 확장되고 후각선은 위축되었다(Fig. 2B).
   5일군에서는 상피층이 다시 두터워졌으며, 정상보다 더 많은 세포층을 이루는 부분도 있었다. 상피는 대부분 원주형으로 회복되었으나 부위에 따라서는 가장 위층인 지지세포의 형성이 완전하지 못한 배열상태를 이루는 부분도 있었다. 내강에는 탈락된 세포의 무리가 현저히 감소되었다(Fig. 2C).
   실험 7일군 및 14일군에서는 대조군과 비슷한 모습으로 손상으로부터 회복된 조직상을 보였다.

AB와 AB-PAS염색 결과
   AB염색 결과 대조군에서 후각선은 푸르게 염색되었다. AB-PAS 염색 결과 대조군에서 점액은 세포자유면의 미세융모를 따라서 약하게 염색되었으나 기저세포 및 후각세포는 염색되지 않았으며, 후각선에서는 보라색으로 염색되어 산성과 중성 점액질을 모두 갖고 있었다(Fig. 3A).
   실험 3일군에서는 후각선의 분비관들은 심하게 확장되었으나 전체적으로 점액은 감소되었으며, 점액이 전혀 염색되지 않는 부위도 있었다(Fig. 3B).
   실험 5일군에서는 점액 염색성이 3일군에 비하여 증가되었고(Fig. 3C), 7일과 14일군에서는 대조군의 모습과 같은 정도로 회복되었다.

PCNA에 대한 면역조직화학염색 결과
   기저세포의 핵에서 염색되어 양성을 보이는 세포를 단위길이(1 mm)당 헤아려본 결과 대조군(Fig. 4A)에서는 21.2±6.6개였으며, 3일군의 경우에는 조직의 손상상태가 너무 심하여 판독이 불가능하였다. 5일군(Fig. 4B)에서는 78.3±12.2개, 7일군에서는 59.8±10.3개, 14일군에서는 25 ±8.3개의 세포가 염색되었다.

공업용 본드가스에 의한 후각상피의 미세구조 변화에 대한 전자현미경적 소견

주사전자현미경 관찰
   대조군의 조직 소견은 세포자유면에는 매우 긴 미세융모가 돋아있었다. 미세융모는 길이가 다양하였고 나누어지는 모습도 관찰되었으며, 내부의 구조가 보이지 않을 정도로 조밀한 구성을 하고 있었다(Fig. 5A).
   3일군에서는 세포자유면의 대부분을 차지하는 지지세포의 미세융모는 성글고 불규칙해졌으며, 세포질 위로 돌출되는 모습도 많았다. 지지세포의 미세융모가 감소되고 후각섬모가 짧아지면서 후각소포가 내강에 직접 노출된 모습도 자주 관찰되었다(Fig. 5B).
   5일군에서는 미세융모의 소실로 인해 후각세포의 몸통(olfactory cell body)과 먼쪽돌기(distal process)가 관찰되었으나, 초기의 세포 손상으로부터 회복된 모습으로 후각섬모와 미세융모의 수가 증가되었다(Fig. 5C). 실험 7일군과 14일군의 후각상피는 대조군과 비슷한 모습으로 회복되었다.

투과전자현미경 관찰
   대조군의 조직 소견은 후각 상피를 구성하는 후각세포, 지지세포 및 기저세포는 핵의 모양이나 분포하는 위치 및 세포질의 형태에 따라서 쉽게 구별할 수 있었다. 지지세포는 윗부분은 넓고 세포핵 아래는 가는 모습으로서 후각 상피의 윗부분을 차지하고 있었다.
   과립세포질망(rough-surfaced endoplasmic reticulum), 무과립세포질망(smooth-surfaced endoplasmic reticulum), 사립체(mitochondria) 및 골지 장치(Golgi apparatus)와 같은 세포소기관이 핵위세포질에 풍부하였으며, 특히 무과립세포질세망이 잘 발달되었고, 중심소체(centriole)도 자유면 세포막 바로 아래에서 자주 관찰되었다. 핵아래부분은 가늘고 긴 모습으로 세포질 및 세포소기관이 적었다. 세포꼭대기의 세포막은 견고연접(tight junction)에 의하여 세포막이 밀착되었고 아래는 부착반점(desmosome)에 의해 연결되었다.
   후각세포의 핵이 위치한 부분은 불룩하였고 대체로 지지세포에 비하여 세포질의 전자밀도가 낮아서 쉽게 구별되었다. 세포 몸통으로부터 양쪽으로 두 개의 세포돌기가 있어서 기저판쪽으로는 몸쪽축삭돌기(proximal axonal process)가, 자유면쪽으로는 먼쪽돌기가 길게 돋아 있었다. 먼쪽돌기는 자유면에서 팽대되어 후각소포(olfactory vesicle)를 형성하였고 여러 개의 섬모가 돋아 있었다. 섬모는 후각소포의 바닥소체(basal corpucle)에서 시작되었으며 전형적인 9＋2구조를 갖고 있었다(Fig. 6).
   3일군의 조직상은 전체적으로 세포의 배열상태가 흐트러지면서 세포의 크기가 불규칙해졌고 세포사이 공간이 벌어지는 등, 세포의 변화가 관찰되었다. 일부 세포는 핵의 염색질이 농축되고, 주변 세포로부터 완전히 분리된 세포들도 있었다. 이런 세포들은 대체로 핵이나 세포질의 전자밀도가 높아져 퇴행성 변화를 보였다. 이러한 변화는 아폽토시스의 전형적인 모습으로서 apoptotic body를 형성한 모습이었으며, 내강쪽으로 배출된 apoptotic body들도 많이 관찰되었다. 또한 세포에서는 용해소체들도 다수 관찰되었다(Fig. 7).
   실험 5일군에서는 무과립세포질망으로 채워진 수포 형태의 세포질이 내강으로 배출되는 양상과 미세섬모가 감소된 소견을 보였다. 그러나, 세포의 손상부위는 드물게 관찰되었고, 대부분 회복된 모습이었다. 세포꼭대기에는 무과립세포질망이 잘 발달되었다(Fig. 8).
   실험 7일군과 14일군의 후각상피는 세포표면의 미세융모가 많아지고, 퇴행성 변화나 apoptotic body는 관찰하기 어려웠다. 상피의 배열도 정상 모습을 되찾았고 세포사이의 연접도 잘 형성된 모습이었다.
   기저판 아래에 있는 후각선의 경우에 실험 3일군에서는 도관이 확장되고 분비과립이 완전히 배출된 모습도 관찰되었으나, 실험 5일군에서는 후각선의 분비과립은 크기와 전자밀도가 다양한 모습으로 매우 증가되어 있었고 세포질에는 과립세포질망이 잘 발달되어, 활발하게 분비과립을 합성하는 모습이었다. 7일 이후에는 분비과립도 거의 대조군과 비슷한 정도로 회복되었다.

고     찰

   사람의 한 쪽 비강 후각상피의 면적은 0.5~1 cm2로 코 안 점막의 5% 미만을 차지하지만, 설치류는 비강의 절반(쥐：50%, 생쥐 47%)이 후각상피로 구성되어 있다.⁷⁾ 그러나 후각상피의 세포비율은 대체로 비슷하여 후각세포가 70~80%, 지지세포가 15~25%, 기저세포가 5%정도 차지한다.⁸⁾ 후각세포는 신경세포이지만 세포주기를 가지고 교체되는 특성을 가진 세포라는 것이 밝혀지면서 후각세포의 재생에 관한 많은 연구가 진행되었고,²⁾ 연구자에 따라 차이는 있지만 사람과 설치류의 후각세포는 대략 한 달 정도의 세포주기를 갖고 있으며, 기저세포로부터 분화되어 새로운 후각세포로 바뀌고 축삭이 후각망울(후구, olfactroy bulb)에 연접되어서 후각세포의 교체가 이루어진다.³⁾ 최근에 후각세포는 아폽토시스과정을 거쳐서 교체되는 것이 알려지게 되었으며⁴⁾ 후각신경을 절단하였을 경우에도 후각세포는 재생되며, 평균 생존기간이 14일로 짧아지지만 이 때에도 아폽토시스에 의해 세포가 교체된다고 한다.⁹⁾¹⁰⁾
   본 실험의 3일군에서는 많은 세포들이 내강으로 탈락되었고, 남아있는 세포의 손상이 심한 모습이었지만, 반복되는 본드가스의 노출에도 불구하고 5일군에서는 3일군에서 보였던 심한 손상부위가 거의 사라진 모습으로 회복되는 양상이었다. 또한 3일군에서 탈락되는 세포들은 apoptotic body를 형성하는 모습이 자주 관찰되었으며, apoptotic body를 형성하지는 않았지만 세포막의 손상없이 주변 세포들로부터 분리된 세포들도 보였다. 또한 상피내에는 큰 포식세포가 없어 아폽토시스과정의 세포는 내강으로 배출되어 처리되는 모습이 많았다.
   약물이나 화학 물질에 의해서 손상받은 경우에는 세포 괴사를 일으키는 것이 대부분의 세포 반응이다. 또한 환경오염물질에 노출된 경우에 후각세포는 괴사를 거쳐서 재생된다는 보고가 있다.¹¹⁾ 하지만 본 실험에서 본드가스와 같은 화학물질에 의해 후각상피의 아폽토시스가 유도된 것은 매우 의미있는 결과로 생각된다.
   점액은 물리적, 화학적 자극에 대한 보호작용, 윤활작용, 탈수방지, 적정세균유지를 위한 항균작용을 담당하고 있다. 점액은 생화학적 성상으로 산성 점액과 중성 점액으로 구분할 수 있으며, 산성 점액질은 주로 윤활작용에 관여하고 중성 점액질은 물리적 또는 화학적 자극에 대한 보호작용에 관여한다.¹²⁾ AB-PAS염색으로 두 점액질을 구별할 수 있는데, AB염색을 하면 산성 점액만이 푸르게 염색되고, AB-PAS염색을 하면 산성과 중성 점액질이 보라색을 띤다. 본 실험에서 대조군과 실험군의 점액은 모두 산성과 중성 점액을 고르게 함유하여 보라색으로 염색되었다. 실험 3일군에서 고유판의 후각선은 점액이 모두 배출되어 점액염색이 매우 약하게 나타났지만, 5일군에서는 점액 생산이 3일군보다 증가되었고 도관은 확장된 모습이었으며, 7일군에서는 대조군과 같은 정도로 회복되었다.
   조직표본에서 세포의 증식과정을 알아보기 위해 BrdU나 PCNA에 대한 면역조직화학염색법이 소개되어 간편하게 사용되고 있다. 이러한 면역조직화학법은 세포분열시에 나타나는 특이 단백질을 표지하여 비교적 간편하게 세포분열양상을 파악할 수 있다.
   본 실험에서 본드가스를 흡입시킨 후 후각상피의 재생을 PCNA 면역조직화학법으로 염색하여 관찰한 결과, PCNA는 기저세포층의 핵에 선택적으로 염색되었고, 단위길이(1 mm)당 PCNA 양성 세포수는 대조군에 비해 5일군에서는 4배, 7일군에서는 3배정도 증가되었다가, 14일군에서는 대조군과 비슷한 수준으로 다시 감소되었다. 이러한 결과는 후각상피에 심한 손상을 주는 화학적 자극이 계속 반복되어도 7일정도 지나면 비교적 정상에 가까운 모습으로 복원되는 후각상피의 재생능력에 의한 것이라고 생각된다.
   본 실험에서 후각상피의 세포들은 본드가스에 노출되면 모두 심한 손상을 받게 되는데, 그 중에서도 지지세포의 탈락이 가장 심하였다. 가스에 노출 후 후각상피는 납작해지는데 특히, 맨 위층이 심하였고, 이러한 모습은 지지세포가 탈락되거나 손상된 모습이었다. 대조군에서는 지지세포의 길고 많은 미세융모에 가려서 후각소포와 섬모를 관찰하기 어려웠다. 하지만 실험 3일군과 5일군에서는 지지세포가 적어지고 미세융모도 감소되면서, 지지세포가 모두 사라져 후각소포들만 무리지어 나타나는 모습이 쉽게 관찰되었으며, 지지세포가 후각세포보다 더욱 심한 손상을 받은 모습이었다.
   지지세포는 후각세포를 둘러싸는 단순한 보호세포일 뿐 아니라, 후각상피에 유입된 물질을 대사시키는 효소를 갖고 있어서 독성을 제거하면서 후각기능을 향상시킨다.¹³⁾ Methyl bromide에 손상된 후각점막이 형태적으로 회복되는 데에는 4주가 걸리고, 생화학적인 효소들까지 정상치로 회복될 때까지는 8주가 걸린다¹⁰⁾고 한 것과 같이 형태적 회복이 먼저 선행되고 이후에 기능이 회복된다.
   본 연구 결과 실험 3일군에서는 후각상피의 세포배열이 불규칙해지고 흐트러졌으며, 상피는 아폽토시스와 괴사에 의하여 세포층이 2~3층으로 낮아지는 변화를 보였다. 후각세포의 섬모가 감소되고, 고유판에 위치하는 후각선의 분비세포까지도 손상된 모습이었다. 이러한 후각상피의 손상은 실험 5일군에서는 세포의 증식이 빨라지고 형태적으로 회복되는 모습이 뚜렷해졌고 7일군에서는 대조군의 모습과 비슷하였다.
   이상의 연구결과로 공업용 본드가스 흡입 후 후각상피에서는 섬모의 소실, 세포의 배열상태가 흐트러지면서 분비과립이 완전히 배출되었으나, 이러한 형태학적 손상은 5일이 지나면서 아폽토시스와 세포증식 과정을 통하여 회복되었다.

결     론

   공업용 본드가스 흡입 후 생쥐의 후각상피에 나타나는 형태학적 변화를 면역조직화학 및 전자현미경으로 연구한 결과 3일에는 섬모의 소실, 세포의 배열상태가 흐트러지면서 분비과립이 완전히 배출되었으나, 이러한 형태학적 손상은 5일이 지나면서 아폽토시스와 세포증식 과정을 통하여 회복되었다. 결론적으로 공업용 본드가스 흡입으로 생쥐의 후각상피는 초기에는 아폽토시스에 의한 퇴행성 과정이 일어나며 반복적인 노출을 하는 경우 지속적인 퇴행성 변화 대신에 세포증식 과정이 일어나는 것으로 사료된다.

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