교신저자：장철호, 570-749 전북 익산시 신용동 344-2번지  원광대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   소아 만성 삼출성 중이염에서 병인중의 하나로 알려진 알레르기는 아직 가설로 존재하고 있었지만 최근 알레르기 병인에 대한 연구들^1)2)3)4)이 보고되면서 알레르기가 병인으로 관여하는 것이 알려지고 있다. 알레르기반응에 가장 중요한 역할을 하는 비만세포는 다양한 biologic amine과 효소들을 함유하고 있다. 비만세포가 중이강과 이관의 점막 하 결합조직에 분포되어 있음이 알려졌고⁵⁾ 주로 고막의 이완부와 이관의 고실부에서 비만세포가 분포되어 있으며 삼출성 중이염의 병인에 관여할 것으로 생각되고 있다.⁶⁾⁷⁾ 그러나 아직 삼출성 중이염 병인에서 비만세포의 역할은 잘 알려져 있지 않은 실정이다.
   인체 비만세포 tryptase는 활성화된 형태로 과립 안에 존재하는 serine endopeptidase이다. 이 효소는 인체의 비만세포에 특이하기 때문에 인체의 분비액 속에서 비만세포 tryptase의 측정을 통하여 비만세포 활성화를 간접적으로 측정하는데 사용될 수 있다.⁸⁾
   Hurst 등¹⁾²⁾³⁾은 소아 만성 삼출성 중이염의 삼출액에서 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)를 사용하여 tryptase를 측정하였으며 또한 중이점막을 채취하여 면역조직화학염색을 시행하여 아토피, 알레르기가 있는 환자에서 의미있게 증가함을 처음으로 보고하였으나 아직 이에 대한 연구는 적은 실정이며 국내에서는 보고되지 않았다. 중이 환기관 삽관시 중이점막의 채취가 기술적으로 어려우며, 또한 출혈로 인해 환기관의 폐쇄가 일어나고 보호자의 동의를 구하기 어려워, 저자들은 소아 만성 삼출성 중이염의 삼출액에서 삼출액 내 비만세포 tryptase를 다른 방법인 Western blotting으로 측정하여 알레르기가 소아 만성 삼출성 중이염의 병인에 관여하는지를 알아 보고자 하였다.

대상 및 방법

   1999년 10월부터 2000년 6월까지 보존적 치료에 반응을 보이지 않아 고막절개술 및 중이환기관 유치술을 시행하였던 소아 25명을 대상으로 하였다. 환자의 연령분포는 3세에서 12세였으며 평균연령은 6.3세였다. 남녀 비율은 1：2.5로 여자가 더 많았다. 25명중 알레르기 검사인 MAST(multiallergosorbent test)에 양성을 보인 환자는 13명이었으며 음성을 보인 환자는 12명이었다.
   삼출액의 수집은 전신마취 하에서 외이도를 생리식염수로 세척한 다음 고막을 절개하고 Juhn Tym Taps(Xomed products, Jacksonville, Flo, USA)을 사용하여 무균적으로 중이강 삼출액을 수집하였다. 0.1 M 인산염 완충식염수 1.5 ml를 가하고 2000 rpm으로 10분간 원심분리 한 후 상층액을 분리하여 즉시 -70°C 냉동고에 보관하였다. 삼출액은 모두 점액성이었다.
   체온에서 녹인 삼출액은 4°C가 유지되는 speed vacuum(Eyela Co., Japan)을 이용하여 12시간 정도 농축시킨 후 동량의 증류수를 넣어 전체 volume을 일치시켜 단백질 정량하였다. Bicinchoninic acid(BCA) 용액과 4% CuSO4를 50：1로 섞어 200 μl씩 96-wells plate에 loading한 후, 1/10 희석한 단백질 sample과 순차적으로 희석된 표준용액(BSA；0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2 mg/ml)을 각각 10 μl씩 loading하였다. 37°C에 30분간 둔 다음 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Western blotting을 위하여 50 μg 단백질을 12.5% gel에서 전기 영동한 다음 nitrocel-lulose paper에 transfer하고 10% skim milk로 1시간 동안 blocking시켰다. Tryptase에 대한 1차 항체(Dako Co., Japan)를 PBS-T(phosphate buffered saline with 0.5%-tween)로 1：200으로 희석한 다음 1시간 처리하고 PBS-T로 3회 washing하였다. 2차 항체(Amersham Co., Japan)는 horsereddishperoxidase가 결합된 antimouse IgG를 1：1000으로 PBS-T로 희석한 후 30분 동안 처리하고 3회 washing한 후 ECL(enhanced chemilumines-cence) solution kit(Amersham Co. Japan)로 측정하였다. 알레르기 양성군과 음성군의 tryptase 농도 비교는 Mann-Whitney test를 사용하였다.

결     과

   MAST 양성군과 음성군의 중이 삼출액에서 모두 분자량 32 kd의 띠가 관찰되었다. MAST 반응에 양성을 보인 군에서 MAST 음성군에 비하여 비만세포 tryptase가 강하게 발색되었으며 densitometry를 사용하여 tryptase 발색량 농도를 측정한 결과 MAST 양성군의 평균농도는 2.32 ug/mg of protein이었고 MAST 음성군의 농도는 0.71 μg/mg of protein이었으며 MAST 양성군에서 MAST 음성군보다 통계학적으로 유의하게 tryptase 농도가 현저히 증가되었다(p<0.01)(Figs. 1 and 2).

고     찰

   알레르기 반응에 주로 관여하는 세포는 비만세포와 호산구이다. 두 가지 세포가 모두 골수의 전구세포로부터 유래한다. 소아 만성 삼출성 중이염에서 알레르기 병인의 기전은 1형과 함께 면역복합체에 의한 3형 알레르기 반응인 후기반응에 의한다. Eosinophil cataionic protein은 주로 후기반응에 관여하여 후기반응 시 호산구는 지질산물과 과립단백질을 분비하지만 비만세포는 1형과 3형에 다 관여하는 것으로 알려져 있다.⁹⁾ 비만세포와 호산구는 여러 가지 강한 생물학적 매개물질을 가지고 있다. 이 중 일부는 세포 내 과립에 기 생성(preformed)되어 저장되어 있으며, 또 어떤 것은 IgE나 항원 또는 다른 자극제에 의해서 세포가 활성화 되면 생기게 된다. 비만세포의 탈 과립 과정 중에 생리적 조건의 pH나 ionic strength에 노출되면 proteoglycan에 결합되어 있는 여러 가지 분비물들이 서로 다른 속도로 분리되는데 histamine은 매우 빠르게, tryptase는 매우 느리게 분비된다. 삼출액 내에서 지속적인 cytokine의 분비와 여러 세포로부터 매개물질의 효과는 삼출성 중이염의 만성화에 관여하는데 알레르기도 만성화에 관여하는 것으로 생각되고 있다.¹⁰⁾
   비만세포 tryptase는 비만세포 활성화를 가장 잘 나타내는 효소이다. Stenfors 등¹¹⁾은 쥐 중이강에 비만세포 활성을 유발하여 histamine을 유리시키는 활성제를 사용한 결과 이관폐쇄가 일어났으며 삼출액이 발생되어 삼출액 형성과정에 비만세포가 관여되고 있음을 보고하였다. 본 연구에서는 알레르기 양성군에서 비만세포 tryptase가 알레르기 음성군에 비하여 더 강하게 나타났다. 또한 음성군에서도 비만세포가 활성화되어 tryptase가 발현하였다. 이는 알레르기가 삼출성 중이염에서 관여하고 있음을 나타내 준다. Hurst와 Venge¹⁾는 소아 만성 삼출성 중이염에서 아토피 양성군과 음성군에서 알레르기 반응 매개체로 알려진 eosinophil cataionic protein, myeloperoxidase, tryptase를 삼출액 내에서 이중항체 radioimmunoassay를 사용하여 측정한 결과 아토피 양성군에서 3가지 매개체 전부 통계학적으로 유의하게 증가되어 있음을 보고하였으며 만성 삼출성 중이염에서 알레르기가 병인으로 관여하고 있음을 주장하였다. 본 연구에서는 micro-ELISA보다 더 예민한 western blotting을 사용하여 tryptase 발현을 정량측정 하였다. 중이환기관 유치 시 중이 삼출액을 수집한 후 중이점막을 채취할 수도 있으나 본 연구에서는 시행하지 않았다. 중이점막 채취 후 출혈이 중이환기관을 막을 수 있으며 조직이 너무 적어 고정 및 염색과정이 쉽지 않았기 때문이다.
   Filiaci 등¹²⁾의 연구에 의하면 화농성 삼출액에서 알레르기 양성군과 음성군의 비점막 과민도를 비교한 결과 알레르기 양성군에서 자극의 종류와 관계없이 특이적, 비특이적 자극에 의해 발생한 과민도에 의해 이관폐쇄가 더 심하게 일어났으며 이는 반복적인 histamine 유리에 의한다고 하였다. 중이강도 기도에 연결된 기관이기 때문에 항상 각종 항원의 침입 시 면역적으로 반응한다. 따라서 중이강과 이관의 점막 과민도도 Filiaci 등의 결과와 비슷할 것으로 추정된다.

결     론

   소아 만성 삼출성 중이염에서 비만세포 tryptase가 알레르기 양성군에서 현저히 증가되어있음은 삼출성 중이염의 병인으로 알레르기가 관여되고 있음을 나타내며 효과적인 항 알레르기 치료가 병행되어야 한다고 사료된다.

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