교신저자：김종남, 110-126 서울 종로구 종로 6가 70  이화여자대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   비용은 비점막의 만성 염증성 질환으로서, 그 병인 및 발병기전에 대해서는 알레르기와 만성 감염, T 세포의 불균형, 비강의 기류역학적 요소 등 많은 요인들이 관여하고 있는 것으로 추측되고 있지만 아직도 확실하게 밝혀지지 않고 있다.
   조직학적으로 비용은 호흡상피로 싸여진 기질의 부종, 상피세포의 파괴, 두꺼워진 기저막, 혈관과 선의 감소를 보이고 여러 염증세포의 침윤을 특징으로 하며 80~90%이상에서 상피하 조직에 호산구의 침윤을 보인다.¹⁾
   지금까지 비용의 발생기전을 규명하기 위해 이러한 염증매개물질의 분비와 염증세포의 침윤과 관련하여 염증반응을 매개하는 여러 가지 cytokine, chemokine 및 접착분자에 대한 연구가 이루어져 왔다. 특히 Th2 세포는 알레르기의 병인에 있어서 핵심적인 역할을 담당하는 것으로 알려져 있어 Th1과 Th2 cytokine으로 구별하여 비용의 발병기전으로서의 알레르기의 역할을 밝히고자 하는 연구도 많았다.²⁾ Cytokine은 T 세포의 분화에도 영향을 미칠 뿐 아니라 급성 및 만성 염증반응에서 염증 세포를 동원하고 염증매개 물질을 분비하도록 하여 세포와 조직의 파괴 및 변형을 유발하는 중요 물질이다.
   그러나 연구 방법이나 연구 대상이 되는 조직의 상태에 따라 어떤 cytokine이나 chemokine의 경우 서로 상반되는 결론을 보이고 있다.³⁾ 즉, 비용 내에 특정 cytokine 자체에 대한 단백질 농도의 측정, cytokine에 대한 항체를 이용하여 ELISA법을 이용한 면역 조직화학 염색법, cytokine의 mRNA를 보는 in situ hybridization, 생물기능적 모델을 이용한 방법 등 연구 방법의 차이에 따라, 또 연구에 사용된 비용 조직의 상태에 따라 그 cytokine이 비용 형성에 관련이 있는지의 여부가 다르게 되었다.
   또, 비용의 병태 생리에 있어서 알레르기의 역할은 수년 간 논란의 대상이 되어 왔으나 최근의 cytokine에 대한 연구에 의하면 비용의 형성기전은 IgE 매개 알레르기의 기전과 다를 것으로 추측하고 있다.²⁾⁴⁾
   Th1-Th2 모델의 중요함에도 불구하고 Th1과 Th2의 구별은 각각 세포에서 분비되는 cytokine을 분석함으로써 이루어졌다. 이에 세포가 분비하는 cytokine이 아닌 Th1 세포와 Th2 세포자체의 표식자를 찾기 위한 연구가 이루어져 Rogge 등은 IL-12가 결합하는 IL-12Rβ2가 Th1 세포에만 선택적으로 표현된다는 연구결과를 발표하고 IL-12Rβ2 mRNA가 Th1 세포의 표식자라고 하였다.⁵⁾
   지금까지 비용에 대한 연구는 T 세포가 분비하는 cytokine이나 cytokine의 유전자 발현 자체에 대한 것이었고, cytokine의 수용체나 유전자 발현의 전 단계인 전사인자의 발현에 대한 연구는 거의 없었다.
   본 연구는 비용에서 다양한 cytokine과 전사인자의 발현 양상을 관찰하고 알레르기 동반 여부에 따른 차이점을 살펴 보고자 하였다. 각각 Th1과 Th2 분화에 중요한 cytokine인 IL-12 및 수용체와 IL-4, Th1형으로의 발달과 관계되는 IFN-γ의 전사조절인자인 IRF-1과 IL-4의 전사인자인 c-maf와 IL-5의 발현을 조절하는 GATA-3의 발현을 관찰하였다.

재료 및 방법

재  료
   이화여자대학교 의과대학부속 동대문병원 이비인후과에서 만성 부비동염 및 비용으로 진단받고 부비동 내시경수술을 시행받은 22명의 환자에서 제거한 비용조직을 이용하였다. 환자의 연령분포는 16세에서 64세이었고 남자는 18명, 여자는 4명이었다. 이 중 9명은 병력, 이학적 검사, 피부단자검사, MAST 검사를 통하여 진단된 통년성 알레르기성 비염을 동반한 환자로서 알레르기 비용군으로 분류하였고, 나머지 13명은 알레르기의 증거가 없는 비알레르기 비용군으로 편의상 분류하였다. 환자에서 비용조직을 얻기 전 최소 4주간 항생제, 항히스타민제, 국소 또는 경구용 스테로이드 제재의 사용을 피하도록 하였다.
   대조군으로는 비중격 만곡증으로 비중격성형술을 시행받은 6명에서 하비갑개 점막조직을 채취하여 이용하였다. 대조군의 연령분포는 20세에서 50세이었고 남자는 4명, 여자는 2명이었다.
   각각 얻어진 조직은 즉시 액체질소에서 급속 냉동시킨 후 -70°C에 동결보관하였다.

방  법

전체 RNA의 분리
   전체 RNA는 RNAzol^TM B kit 시약(TEL-TEST, Inc. Friendwood, TX)을 사용하여 분리하였다. -70°C에 보관된 조직 100 mg을 취하여 2 ml RNAzol^TM B을 넣어 polytron(Ultra-Tarrax T25^TM, IKA-Labortechnik Corp., Staufen, Germany)을 사용하여 균질화시켰다. 이 균질액에 0.2 ml의 chloroform을 넣고 잘 섞어 얼음 위에 5분 동안 둔 다음 12,000×g, 4°C에서 15분 동안 원심분리를 하여 얻은 상층액을 새 시험관에 옮겼다. 상층액에 동량의 isopropanol을 넣어 4°C에서 15분간 둔 다음 12,000×g, 4°C에서 15분 동안 원심분리를 하여 얻은 침전을 75% 에탄올로 씻어 준 후 7,500×g, 4°C에서 8분간 원심 분리하여 생긴 침전을 DEPC(diethyl pyrocarbonate) 처리된 증류수에 용해시킨 뒤 RNA를 20배로 희석하여 분광광도계(DU-650, Beckman instruments Inc., Fullerton, CA)로 260 nm에서 O.D.(optical density)값을 측정하였다. 260 nm/280 nm O.D.비값이 1.9~2.0되는 순도가 높은 RNA를 얻어 다음 실험을 행하였다.

역전사 반응(reverse transcription)
   Gilliland 등의 방법⁶⁾을 응용하여 reverse transcription system(Promega^TM Co, Madison, WI)으로 역전사 반응을 시행하였다. 추출된 RNA 2 μg에 oligo(dT) primer(0.5 mg/ml) 2 μl을 넣고 65°C에서 10분 동안 처리한 후, 5 mM MgCl₂, 1 mM의 각각의 dNTP, 1×역전사 완충액(10 mM Tris-HCl, pH 8.8 at 25°C；50 mM KCl；0.1% Triton X-100), 2.5 U rRNasin RNase inhibitor, 15 U AMV 역전사 효소를 최종 부피가 20 μl가 되게 하여 42°C에서 1시간 동안 반응시키고, 95°C에서 5분 동안 가열하여 역전사 효소 활성을 제거한 후 4 °C에 냉각시켜 cDNA(complementary DNA)를 합성하였다.

중합효소 반응(polymerase chain reaction)
   역전사 반응에서 만들어진 cDNA 2 μl에 1×PCR 완충액(10 mM Tris-HCl, pH 8.3 at 25°C；50 mM KCl；1.5 mM MgCl₂), 1 U Taq polymerase^R(Takara Shuzo Corp., Shiga, Japan), 10 pmol의 각각 cytokine의 sense 및 antisense primer를 최종 반응 부피 50 μl가 되도록 혼합한 후 GeneAmp PCR System 9600(Perkin Elmer Co, Norwalk, CT)을 사용하여 중합효소 반응을 시켰다. 반응조건은 다음과 같다. 94°C에서 5분 동안 변성시키고, 94°C에서 1분간 변성 단계를 거친 뒤, β-actin은 58°C에서, GATA-3, c-maf, IL-12p35, IL-12p40, IL-12Rβ2의 경우는 60°C에서, IL-4는 55°C에서, IRF-1은 63°C에서 1분간 annealing 단계를 거친 뒤 72°C에서 1분간 extension 단계를 주기로 하여 35번 반복 시행시킨 후 72°C에서 10분 동안 extension 반응을 추가로 시행하였다. 본 연구에서 사용된 β-actin과 각각의 cytokine에 대한 primer(Bioneer, Cheongwon-Gun, Korea) 염기서열과 반응산물의 크기는 Table 1과 같다.

Southern blot
   중합효소 반응과정에서 증폭된 산물은 1.5% agarose gel상에서 전기영동장치(Mupid-2TM, Cosmo Bio. Co, Tokyo, Japan)를 이용하여 전기영동하고, ethidium bromide로 염색하여 분리 확인하였고, 미세관 확산법으로 NYTRAN-PLUS 막(Scheicher & Schuell, Dassel, Germany)에 옮긴 후 UV-cross linker로 연결시켰다.
   소식자는 Gene Bank 자료를 기초로 하여 합성하였고 그 서열은 Table 2와 같다.
   DNA 보합결합 완충액(hybridization buffer：6×SSC, 5×Denhadt's 용액, 50% formamide, 0.5% SDS, 1 mg/ml denatured salmon sperm DNA)을 가하여 42°C에서 3시간 보합결합 전 반응(pre-hybridization)을 시킨 후, 동위원소로 표지한 β-actin 및 각각의 probe를 섞어 42°C에서 16시간 동안 보합결합을 실시하였다. 그 후 막을 세척액(2×SSC, 0.5% SDS)으로 5분씩, 3번 씻어준 후, 다른 세척액(1×SSC, 0.1% SDS)으로 10분 씻어준 다음 X-ray 필름(Fuji Photo Film Co, Tokyo, Japan)에 감광시킨 후 현상기(FUJI FPM1200, Tokyo, Japan)를 사용하여 현상하였다.

Cytokine과 수용체 및 전사인자의 발현양상 계측
   각 cytokine과 수용체 및 전사인자의 띠강도는 밀도측정기(UKB 2222-020, Phamacia LKB Biotechnology, Up-psala, Sweden)를 사용하여 정량화하였고 밀도비는 각 cytokine의 띠강도를 같은 개체의 β-actin의 띠강도로 나누어 계산하였다.

자료 분석
   세 군간의 발현된 띠강도는 Kruskall-Wallis test를 이용하여 분석하였으며, 통계학적 유의성은 p<0.05로 정하였다.

결     과

비용에서 Th1 cytokine과 그 수용체 및 전사인자의 발현
   IL-12p35, IL-12p40, IL-12Rβ₂, IRF-1의 역전사-중합효소 반응 산물을 southern blotting하여 발현양상을 조사한 결과 정상 대조군보다 비용군에서 많이 발현되었다. 그 중에서 IL-12p40, IL-12Rβ₂, IRF-1은 알레르기 비용군보다 비알레르기 비용군에서 발현이 많았다(Table 3).
   IL-12p35, IL-12p40, IL-12Rβ₂, IRF-1의 southern blot 결과 얻어진 띠강도를 밀도측정기로 측정한 결과 각 군별로 발현되는 개체 수 결과와 상관관계가 있었으며, IL-12p40, IL-12Rβ₂, IRF-1은 비알레르기 비용군에서 정상 대조군과 알레르기 비용군보다 통계학적으로 유의있게 증가되었다(Table 4, Fig. 1).

비용에서 Th2 cytokine과 전사인자의 발현
   IL-4, GATA-3, c-maf mRNA는 정상 대조군보다 비용군에서 많이 발현되었다. IL-4와 c-maf는 알레르기 비용군과 비알레르기 비용군 사이에 발현정도의 차이가 없었으나 GATA-3는 알레르기 비용군에서 더 많이 발현되었다(Table 3).
   IL-4, GATA-3, c-maf의 southern blot으로 얻어진 띠강도를 세 군별로 비교한 결과 GATA-3가 알레르기 비용군에서 비알레르기 비용군과 정상 대조군에서보다 높은 밀도비를 보였다(Table 4, Fig. 1).
   즉, 연구 대상인 cytokine과 수용체, 전사인자 모두가 정상 대조군보다 비용군에서 높게 발현되었으나, 비알레르기 비용군에서는 IL-12p40, IL-12Rβ₂, IRF-1이 통계적으로 유의하게 높은 발현을 보였고 알레르기 비용군에서는 GATA-3가 통계학적으로 높은 발현을 보였다(Table 4, Fig. 1).

고     찰

   여러 cytokine 중에서 IL-12는 Th0 세포에서 Th1 세포로의 분화에 가장 중요한 cytokine으로서 40kDa subunit(p40)와 35kDa subunit(p35)로 된 heterodimeric cytokine으로 p35와 p40 subunit가 공유결합하여 활성 IL-12(p75)cytokine으로 된다.⁷⁾ p35와 p40의 발현은 독립적으로 조절되며 p35는 많은 종류의 세포에서 생성되지만 p40의 발현은 한정된 세포에서 생성된다.⁷⁾
   IL-12는 세포막에 존재하는 IL-12R에 결합하여 작용을 나타내는데, IL-12R는 IL-12Rβ₁과 IL-12Rβ₂ subunit로 이루어져 있고 IL-12Rβ₂ mRNA는 Th1 세포에 선택적으로 발현되고, Th0 세포가 Th1 세포로 분화하는 데 관여한다.⁵⁾ IL-12는 활성화된 단핵구 세포, 대식세포, 수상세포, 중성구, B 세포 등에서 생성되며 Th0 세포에서 Th1 세포로의 분화유도, GM-CSF, TNF-α, IFN-γ 생산 뿐만 아니라 세포 독성 임파구생성에 매우 중요한 역할을 하여 Th1 세포 매개 면역을 증진시킨다. Davidsson 등은 만성 부비동염 환자에서 알레르기군과 비알레르기군에서 IL-12 mRNA 발현정도는 차이가 없었다고 보고하였고⁸⁾, Suzuki 등도 같은 조건에서 IL-12Rβ₂ mRNA 발현을 조사한 결과 알레르기군과 비알레르기군에서 비슷하게 발현되는 것을 보고 Th1 세포의 활동성은 외부 항원에 대해 국소 점막 방어를 나타내기 위해 알레르기군이나 비알레르기군의 부비동 점막에 편재해 있다고 주장하였다.⁹⁾ 반면 Wright 등은 만성 부비동염 환자의 조직에서 알레르기군과 비알레르기군에서 대조군보다 IL-12p40이 낮게 발현되고, 알레르기군에서 대조군보다 IL-12Rβ₂가 낮게 발현되는 결과를 얻고 IL-12가 알레르기 염증반응을 억제하고 이러한 억제는 IL-12Rβ₂에 의해 조절된다고 하였다.¹⁰⁾
   본 연구에서는 IL-12p35는 정상 대조군, 알레르기 비용군, 비알레르기 비용군 모두에서 발현되었으나 IL-12p40와 IL-12Rβ₂는 비용군에서만 발현되었고 비알레르기 비용군에서 알레르기 비용군에서보다 높은 발현율을 보였다. 이는 비알레르기성 비용환자의 조직이 IL-12p40과 IL-12Rβ₂의 활성으로 염증현상을 나타냄을 알 수 있었다. 따라서 비용에서는 Th2로 유도되는 알레르기와 무관하게 다른 여러 기전에 의해 cytokine이 관여한다고 할 수 있다.
   IL-4는 대표적인 Th2 cytokine으로 IL-4는 T와 B 임파구, 대식세포, 그리고 염증반응과 조혈반응에 관여하는 세포의 활성화, 성장, 분화와 같은 여러 가지 생물학적 활성도를 조절하는 cytokine으로 Th2 세포에만 발현된다.¹¹⁾ 또 IL-4는 B 임파구의 활성인자로서 Ig E 생성을 유도하는 특징이 있고, 다른 중요한 역할은 Th0 세포를 Th2 세포로 전환시키는 것이다. 그러나 비용조직에 대한 연구에서는 IL-4 유무와 역할에 대해 의견이 일치되지 않고 있다. Nonaka 등은 비용조직에서 IL-4의 증가를 관찰할 수 있었다고 보고하였고,¹²⁾ Voegels 등도 알레르기 비용군에서 IL-4가 통계학적으로 유의있게 높게 발현되어 IL-4와 비용과 알레르기 사이에 상관관계가 있음을 시사하였다.²⁾ 그러나 Lee 등은 비용에서 IL-4가 정상 대조군보다 증가하였으나 알레르기군과 비알레르기군 사이에 차이가 없다고 보고하였고,¹³⁾ Bachert 등도 정상 대조군과 비슷한 정도로 발현되었다고 보고하였다.³⁾ 최근에는 IL-4를 비롯하여 알레르기 반응을 유도하는 Th2 cytokine들의 발현율이 알레르기가 있는 비용이나 알레르기가 없는 비용군 모두에서 큰 차이를 보이지 않는다는 보고들이 많아 비용의 형성기전은 IgE 매개 알레르기의 기전과 다를 것으로 추측하고 있다.²⁾⁴⁾ 본 연구에서도 IL-4는 정상 대조군보다 비용군에서 높은 발현을 보였으나 통계학적 유의성은 없었고 알레르기 유무와도 상관관계가 없었다. 즉, 알레르기 비용군은 알레르기 비염 점막에서 보이는 다른 결과와 일치하지 않았다.
   항원에 의해 T 세포의 수용체가 활성화되면 T 세포의 cytokine 유전자를 전사시켜 T 세포 특이 cytokine을 분비하는데, cytokine 유전자의 촉진자(promoter)부위에 전사인자의 결합부위가 존재하여 cytokine의 전사를 조절하는 중요한 요소가 된다.
   IRF-1(Interferon regulatory factor-1)은 IFN(interferon)의 전사인자로서, Th1 세포의 발달에 필요하며 IL-12의 목표 유전자이고 IL-12에 의해 유도되는 Th1 세포의 기능이 IRF-1에 의해 매개된다.¹¹⁾
   IFN-γ는 IL-4에 길항 작용을 하는 cytokine으로서 호산구, 장액점액선, 비용의 상피 내에서 발견되는데 재발성 비용에서 증가된다는 보고¹⁴⁾가 있으며 Lee 등¹³⁾도 정상 대조군보다 비용에서 IFN-γ가 증가함을 보고하였다. Coccia 등은 Th1과 Th2 세포에서 IRF-1 mRNA 발현이 비슷하나 IL-12에 의해 유도된 IRF-1은 Th1 세포에만 작용을 하는 것을 보고하였다.¹¹⁾
   한편, Th2 cytokine 발현에는 Th2-특이 전사인자인 c-maf와 GATA-3가 관여한다고 보고되었다.¹⁵⁾¹⁶⁾ 최근 GATA-3가 Th0 세포와 Th2 세포에서 선택적으로 발현되어 IL-4, 특히 IL-5의 유전자 전사를 증진시키지만, Th1 세포에는 발현이 되지 않는다고 보고되었다.¹⁷⁾ c-maf는 IL-4 촉진자의 consensus site(MARE)에 결합하여 IL-4 전사에 직접 작용하고 T 세포에 의한 cytokine 발현을 조절하는 인자로 c-maf 역시 Th2 세포에서 선택적으로 발현되고¹⁸⁾ c-maf가 과발현 되면 Th2 cytokine이 현저히 증가되고 IFN-γ와 같은 Th1 cytokine은 억제된다.¹⁵⁾
   Hamilos 등은 in situ hybridization법을 이용하여 정상 대조군보다 비용군에서 GM-CSF, IL-3이 증가함을, 정상 대조군보다 알레르기 비용군에서 IL-4, IL-5가 증가함을, 정상 대조군보다 비알레르기군에서 IFN-γmRNA가 증가함을 관찰하여 비용에서 알레르기 유무에 따라 호산구증다증의 서로 다른 기전이 존재하며 비알레르기성 환자의 호산구 증가는 IL-4와 IL-5와는 무관함을 주장하였다.¹⁹⁾ 그러나 Bachert 등은 정상 대조군과 비용군 사이에서 여러 cytokine들의 단백질 농도를 비교한 결과 비용에서는 IL-5가 높은 농도를 보였고 그 정도는 알레르기 비용군과 비알레르기 비용군 사이에 큰 차이를 보이지 않았다고 보고하였다.³⁾ 최근의 연구 결과로는 IL-5는 조직 호산구증다증의 병리기전에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있고 호산구의 활성화와 생존을 증진시키는 cytokine으로서 비용 치료의 주요 목표가 되고 있다.³⁾
   본 연구에서는 IRF-1은 알레르기 비용군에서보다 비알레르기 비용군에서 통계학적으로 유의있게 높은 발현을 보였고, GATA-3는 알레르기 비용군에서 다른 군에서보다 통계학적으로 유의있는 높은 발현을 보였으나, 정상 대조군보다 비용군에서 높은 발현을 보였다. c-maf는 정상 대조군에서보다 비용군에서 다소 높은 발현을 보였으나 통계학적으로 유의하지 않았다. 따라서 비용의 호산구증다증을 일으키는 기전은 알레르기, 만성 감염 등 여러 가지 요인들이 복합적으로 작용하여 일어나는 것으로 본 연구에서는 Hamilos 등의 연구와 마찬가지로 비용형성에 있어서 비알레르기 비용군과 알레르기 비용군 사이에 서로 다른 기전이 존재하며, 비알레르기 비용군에서는 IL-12p40, IL-12Rβ2, IRF-1이, 알레르기 비용군에서는 GATA-3가 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다.
   하지만 본 연구에서는 비용조직에서의 호산구, 비반세포 등의 침윤정도, 호산구의 활성화 정도, 비용조직의 구조적 변성 등 조직학적 연구를 시행하지 않아 cytokine, 수용체, 전사인자와 비용조직에 침윤되는 세포와의 관계를 밝히지 못하였다. 따라서 향후 비용조직의 분자생물학적 연구 뿐만 아니라 조직학적 연구가 병행해야 할 것으로 생각된다. 그리고 비용군에서 발현이 증가된 전사인자와 수용체에 대한 길항체를 비용조직의 실험에 이용하여 비용조직에 미치는 영향에 대한 연구도 필요할 것으로 생각된다.
   지금까지 비용 형성의 기전과 병리 생태에 대해 여러 가지 세포 매개체를 대상으로 많은 실험이 행해져 왔으나 아직까지 뚜렷한 기전을 제시하지 못하고 있는 것은 비용 형성과정이 몇 가지 매개 물질로 이루어지지 않는다는 것을 의미한다. 따라서 단순히 비용조직에서 여러 가지 화학적 매개체들의 존재유무를 알아보기보다는 세포 수용체나 전사인자와 같은 특이적인 세포 표식자를 고안하여 실험에 응용하는 것이 도움이 될 것이다.

결     론

   알레르기 비염이 동반되지 않은 비용군에서는 Th1 분화와 연관된 IL-12p40, IL-12Rβ2와 IRF-1이, 알레르기 비염이 동반된 비용군에서는 Th2 분화와 연관된 GATA-3의 발현이 증가한 것을 관찰하여, 알레르기 비염이 있는 군과 알레르기 비염이 없는 군에서 서로 다른 기전으로 비용이 형성될 것으로 생각된다.

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