교신저자：한창준, 143-130 서울 광진구 화양동  건국대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   신생물의 성장과 발생에는 무수히 많은 세포간 상호작용이 관여한다는 것이 이미 정설로 받아들여지고 있다. 지난 수세기 동안 발암기전의 다단계 과정에 관여할 것으로 생각되는 다양한 돌연변이 현상에 대해 집중적인 연구들이 이어져 왔다. 이러한 돌연변이 현상은 세포 내 다양한 유전자의 활성화 혹은 불활성화 등을 통해 암 유전자 단백질의 발현 또는 세포주기 조절능의 파괴, 면역감시기구의 이상 등을 유발시키고 이것이 암종의 성장과 발현을 초래할 수 있는 것이다.¹⁾ 이와 같은 암으로의 다단계 과정은 여러 조직의 악성종양에서 연구가 되고 있지만 아직 분자생물학적 단계에서의 기전은 확실히 밝혀지지 않고 있다.
   짧은 반감기를 갖고 L-arginine으로부터 생성되는 nitrogen radical species인 nitric oxide(NO)는 다양한 세포 군에서 발견되면서 중요한 세포간 정보전달물질의 하나로서 수많은 생리학적 역할을 하는 것으로 밝혀지고 있다. NO는 nitric oxide synthases(NOS)에 의해 아미노산 L-arginine이 L-citrulline으로 전환되면서 생성되는데 이들 NOS에는 3가지 아형이 알려져 있다. Neuronal NOS(nNOS)는 주로 중추 및 말초신경조직에서 검출되며 새로운 신경전달 물질로서 알려져 있으며 endothelial NOS(eNOS)는 혈관내피에서 발견되며 혈관 평활근의 조절에 관여한다.²⁾ Inducible NOS(iNOS)는 대식구, 호흡상피세포 등 다양한 조직에서 발견되는데 다른 세포학적 기능과 함께 면역조절과 세포독성 기전에 관여하는 것으로 알려져 있다.³⁾
   최근 많은 연구자들에 의해 암종 조직에서의 NO의 역할이 연구되면서 혈관증식, 면역억제, 돌연변이 유발, 세포독성 및 전이 등에 직접 관여할 것으로 보고되고 있다.^4)5)6)7)8) 그러나 각 암종 마다 NOS의 발현과 활성도에 차이가 있어 NO는 조직 특이적으로 각각 다른 효과를 가질 가능성을 배제할 수 없다.
   본 연구에서는 인간의 갑상선 유두상 암종에서의 각 NOS 아형의 존재 및 발현양상을 알아보고 면역조직화학적 염색을 통해서 조직 내 NOS의 세포학적 분포를 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

조직의 채취
   갑상선 유두상 암종으로 갑상선 전 적출술을 시행 받은 환자로부터 비교적 종양의 크기가 크고 경계가 명확하여 조직학적으로 확인할 수 있었던 즉, 분자생물학적 연구에 bias 가능성이 적은 2예의 유두상 암종 조직과 2예의 정상 갑상선 조직만을 RT-PCR과 Western blot 분석에 이용하였다. 분자생물학적 연구를 위한 조직은 수술시 적출하자마자 액체 질소에 담가 즉시 동결시킨 후 -80°C에서 보관하였고 면역조직화학적 염색은 현미경하 최종진단된 10예의 갑상선 유두상 암종에서 시행하였다.

조직으로부터 총 RNA의 추출
   조직 내에 분포하는 총 RNA는 Qiagen RNeasy mini kit(Germany, GmbH)를 이용하여 추출하였다. 동결된 조직 약 20 mg을 액체질소 내에서 마쇄한 후 1%의 농도로 β-mercaptoethanol 10 μl가 포함된 RLT buffer 400 μl를 가하여 완전히 혼합하였다. 이어서 3 cc 주사기와 23 G 주사바늘을 이용하여 핵 DNA를 절편화하고 균등화된 시료를 3분간 원심분리(13000 rpm, microcentrifuge)하였다. 원심분리돤 상층액에 70% ethanol 400 μl를 혼합한 후 RNeasy mini spin column에 넣고 1분간 원심분리(10000 rpm)하였다. RW1 washing buffer 700 μl를 column 시료에 가한 후 원심분리(10000 rpm)를 이용하여 2회 세척하였다. Column 내에 잔존하는 ethanol 성분을 완전히 제거하기 위하여 10000 rpm으로 약 3분간 원심분리하였다. 최종적으로 column resin에 결합된 총 RNA를 분리하기 위하여 50 μl의 RNase-free water를 첨가한 후 10000 rpm으로 1분간 원심분리하여 RNA를 추출하였다. RNA의 농도와 순도는 260 nm와 280 nm에서의 자외선 흡광분석(Pharmacia, UK)을 이용하여 결정하였다.

역전사 반응(Reverse Transcription)을 이용한 전사체 발현 측정
   역전사 효소(Reverse transcriptase)를 이용하여 총 RNA로부터 단일 가닥의 cDNA를 만드는 과정은 RNA PCR kit(TaKaRa Shuzo Co., Ltd. Ver. 2.1)을 사용하여 수행하였다.
   RT-PCR을 위한 반응혼합물의 조성은 다음과 같다.
   (total RNA(1 μg) 1 μl, RNase free distilled H2O 8.5 μl, 10 X RNA PCR Reaction buffer 2 μl, 5 mM MgCl2 4 μl, 1 mM dNTP mixture 2 μl, 1 unit/μl RNase inhibitor 0.5 μl, 0.25 unit/μl Reverse transcriptase 1 μl, 0.125 μM Oligo dT-Adaptor primer 1 μl, 25 μM Radom primer(9 mers) 1 μl)
   상기와 같은 20 μl의 반응 혼합물을 Genius thermal cycler(Techne Ltd. Duxford, UK)에서 30°C에서 5분, 42°C에서 30분, 99°C에서 5분간 역전사 반응을 수행하고 5°C에서 반응을 정지
시켰다.

중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction；PCR)
   역전사 반응을 통해 합성된 1차 단일 cDNA를 주형으로 하여 nNOS, iNOS 및 eNOS의 cDNA에서 특이적으로 제조된 각각 764 bP, 420 bP, 741 bp의 Oligonucleotide를 이용하여 Genius thermal cycler(Techne Ltd. Duxford, UK)에서 PCR을 수행하였다.
   이때 반응용액의 조성은 다음과 같다.
   (cDNA template(1st DNA) 5 μl, RNase free distilled H₂O 32 μl, 10 X RNA PCR Reaction buffer 4.5 μl, 5 mM MgCl₂ 4 μl, 1 mM dNTP mixture 2 μl, Taq polymerase(5 unit/μl) 0.5 μl)
   상기 50 μl의 반응 혼합물을 94°C에서 40초간 변성(denaturation)시키고 반응(annealing)과정으로 55°C에서 40초간, 신장(enlongation)과정으로 72°C에서 1분 30초간, 총 30 cycle을 수행하였다. 증폭된 산물을 ethidium이 포함된 2% Oligonucleotide(sense, antisense) 각 1 μl를 agarose gel(GTG Seakem, FMC, ME)상에서 전기영동(80 V)한 후 polaroid film type 665(pos/neg B & W)를 사용하여 사진을 찍었다.

Western blot을 이용한 단백질 정량분석
   조직 내의 전체 단백질을 분리하기 위하여 320 mM sucrose, 20 mM HEPES, 1 mM EDTA가 함유된 pH 7.2의 buffer에 1 mM DTT, 10 μg/ml의 leupeptin, 10 μg/ml의 soybean-trypsin inhibitor, 2 μg/ml의 aprotinin이 함유된 용액을 제조하여 조직당 5 ml(조직의 3~5배)씩 가하고 30초간 조직 파쇄(homogenizing)시킨 후 10 μg/ml의 PMSF 1 mM을 첨가하여 다시 한번 조직파쇄시켰다. 각 sample은 10,000 g에서 10분간 원심분리하고 상층액을 택하여 100,000 g에서 1시간 초고속 원심분리하였다. 상층액인 세포질성 단백질 분액(cytosolic fraction)은 -80°C에 보관하고 침전물은 다시 동일한 buffer를 첨가하여 100,000 g에서 30분간 원심분리하는 세척과정을 수행하였다. 침전물에 CHAPS((3-〔(3-Cholamidopropyl) demethylaminonio〕-1-propanesulfonate), Sigma)가 포함된 동일한 buffer에서 조직파쇄한 후 20분간 rolling하고 100000 g에서 30분간 윈심분리하여 particulated form으로 용해된 NOS 단백질인(예, eNOS) 상층액을 분리한다.
   앞서 얻은 세포질성 단백질 분액과 함께 단백질 농도를 측정 한 뒤 각각 10 μg씩 SDS-PAGE(Sodium Dodocyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis)로 125 V에서 2시간 동안 전기영동 하였다. 그리고 단백질을 poly-vinylidene difluride(PVDF, Bio-Rad, CA)에 transfer한 후(25 V, 2시간) Tris-HCl(pH 7.5) 10 mM(2M stock 5 ml)과 NaCl 100 mM(5M stock 20 ml), 0.1% Tween 201 ml, 증류수 976 ml이 함유된 buffer로 세척하고 탈지건분유(nonfat-dry milk 2.5 g, 5%)를 washing buffer 50 ml에 녹여 제조한 blocking 용액에서 16시간 처리하였다(4°C). 반응 후 membrane은 각 NOS의 N-말단과 C-말단에서 고안된 1차 항체를 적절히 희석시켜 상온에서 1시간동안 반응시켰다. washing buffer로 세척 후 membrane을 alkaline phosphatase로 표지된 goat anti-rabbit IgG와 1시간동안 반응시키고 다시 washing buffer로 세척하였다. Membrane을 ECL detection kit(Amersham, UK) 용액에서 1분간 처리하고 X-ray film에 조사시켜 결과를 확인하였다.

면역조직화학적 염색
   포르말린에 고정하여 파라핀에 포매한 조직을 4 μm 두께로 박절하여 gelatin으로 전처치한 슬라이드에 부착하여 38°C의 열판에 24시간 동안 둔 후에 xylene과 alcohol로 탈파라핀 및 함수과정을 거쳤다. 내인성 peroxidase의 차단을 위해 3% H₂O₂에 15분간 처리하고 증류수로 수세한 후 0.5% Triton X-100에 5분간 반응시켰다. 30분간 normal goat serum을 처리한 뒤 phosphate buffered saline(이하 PBS)에 1：500배 희석한 1차 항체(nNOS；SC 648, C-terminal, nNOS；SC 1025 N-terminal, iNOS；SC 649, C-terminal, iNOS；SC 651, N-terminal, eNOS；SC 654, C-terminal, eNOS；SC 653, N-terminal, Rabbit polyclonal IgG, Santa Cruz Biotechnology, INC., CA, USA)로 실온에서 각각 60분간 반응시킨 후 PBS로 수세하였다. 2차 항체인 biotinylate anti-rabbit immunoglobulin(ABC kit, Vector Lab, CA, USA)을 가하여 상온에서 1시간 반응시킨 후 수세하였고 다시 Peroxidase-conjugated avidin-biotin-complex(Vector, ABC kit, USA)로 37°C에서 10분간 반응시키고 수세하였다. 이후 DAB(diaminobenzidine, Biogenex, USA)로 10분간 실온에서 발색시켰다. Meyer의 hematoxylin으로 대조염색을 하고 계열 에탄올(70%, 80%, 90%, 95%, 99%)로 탈수하고 xylen으로 투명화 과정 거쳐 permount로 봉입하여 광학현미경하에서 검경하였다. 음성 대조군으로는 일차항체 대신에 정상 serum만을 반응시켜 동일한 방법으로 염색하였으며 양성 대조군으로는 항 eNOS 항체로 염색된 혈관내피세포의 반응정도를 기준 삼았다. 광학 현미경 200배율 시야에서 음성 대조군과 같이 염색되지 않은 것을 -로, 미약한 반응을 ＋, 부분적인 염색을 ＋＋, 혈관내피세포의 염색과 같은 정도를 ＋＋＋등 상대적인 면역반응정도를 4단계로 판독하였다. 이는 2명의 병리의사에 의해 독립적으로 시행되었으며 표본을 무작위 추출하여 반복 판독하였다.

결     과

RT-PCR을 이용한 각 NOS mRNA의 발현

nNOS mRNA의 발현
   정상 갑상선 조직에서는 관찰되지 않았던 764 bp의 nNOS mRNA의 역전사 증폭 산물이 암종에서 강하게 발현되었다.

iNOS mRNA의 발현
   정상 갑상선 조직에서 관찰되지 않았던 420 bp의 iNOS mRNA의 발현이 매우 약하게 관찰되었다.

eNOS mRNA의 발현
   정상 갑상선 조직에서도 741 bp의 eNOS mRNA 증폭산물이 관찰되었고 암종에서는 보다 증가된 eNOS mRNA 산물을 관찰할 수 있었다.
   각 밴드의 농도는 Image analyzing program(Bio-Profile, ver 6.0)을 이용하여 β-actin의 농도와 비교하여 상대적인 정량을 막대그래프로 나타내었다(Fig. 1).

Western Blot을 이용한 각 NOS 특이적 단백질의 발현

nNOS 특이 단백질의 발현
   nNOS 특이 단백질 검출을 위한 1차 항체로는 N-말단과 C-말단에서 고안된 두 가지의 항체를 사용하였는데 그 결과가 각각 상이하였다. 또한 세포질성 단백질 분액(cytosolic fraction)과 소포체성 단백질 분액(microsomal fraction) 등 두 가지의 검체에 따라서도 그 결과가 달랐다. 즉, N-말단의 항체를 사용한 세포질성 단백질 분액의 경우, 정상 갑상선 조직에서는 nNOS가 전혀 관찰되지 않았고 암종에서도 거의 검출되지 않았으나 소포체성 단백질 분액에서는 160 kDa의 nNOS 특이 단백질이 미약하게 관찰되었다.
   한편 C-말단의 항체를 사용한 세포질성 단백질 분액의 경우, 정상조직에서는 N-말단의 항체를 사용한 경우와 마찬가지로 특이 단백질이 관찰되지 않았으나 암종에서는 상당한 양의 nNOS 특이 단백질이 검출되었다. 그러나 소포체성 단백질 분액에서는 nNOS 특이 단백질 발현이 거의 관찰되지 않았다(Fig. 2).
   특이하게도 N-말단의 항체를 사용한 경우, 세포질성 및 소포체성 단백질 분액 모두에서 정상적인 160 kDa의 특이 단백질 외에 보다 작은 크기의 nNOS 특이 단백질이 다량 검출되었는데 세포질성 단백질 분액에서는 약 45 kDa과 50 kDa 크기의 단백질이, 소포체성 단백질 분액에서는 약 80 kDa 정도의 nNOS 특이 단백질 발현이 확인되었다(Fig. 3).
   이들의 비교는 Image analyzing program(Bio-Profile, ver.6.0)을 이용하여 상대적인 강도를 막대그래프와 임의적인 수치로 나타내었다.

iNOS 특이 단백질의 발현
   iNOS의 경우는 iNOS mRNA가 약하게 발현되었지만 iNOS 특이 단백질은 정상 조직과 암종 모두에서 관찰되지 않았다.

eNOS 특이 단백질의 발현
   세포질성 단백질 분액에서는 정상 조직과 암종 모두에서 특이 단백질이 검출되지 않았고 반면 소포체성 단백질 분액에서는 암종에서 125 kDa의 eNOS 특이 단백질이 확연하게 관찰되었으며 정상 갑상선 조직에서도 암종보다는 적지만 상당한 양의 특이 단백질을 관찰하였다.
   각 밴드의 농도는 Image analyzing program(Bio-Profile, ver.6.0)을 이용하여 각 밴드의 상대적인 강도를 막대그래프와 임의적 수치로 나타내었다(Fig. 4).

면역조직화학적 염색을 이용한 각 NOS 아형의 조직 내 분포

nNOS에 대한 면역 염색반응
   암종의 종양세포 세포질에서 매우 강하게(＋＋＋) 면역염색되었으며 정상조직에서는 면역반응물질이 관찰되지 않았다(Fig. 5A).

iNOS에 대한 면역염색반응
   전체적으로 매우 미약한 면역반응(＋)이 성글게 산재되어 관찰되었으며 정상조직에서는 전혀 관찰되지 않았다(Fig. 5B).

eNOS에 대한 면역염색반응
   종양세포의 세포질에서 강한 면역반응(＋＋)을 보였으며 정상조직의 여포세포에서는 전혀 관찰되지 않았다(Fig. 5C).
   다른 조직에서도 이와 같은 양상은 거의 일관되게 관찰되었으며 면역염색강도는 대개 nNOS, eNOS, iNOS의 순이었다(Fig. 5, Table 1).

고     찰

   1980년대 후반, 예전에는 산업공해물질이며 발암물질의 가능성으로 관심을 끌던 분자인 NO에 대해서 이들이 포유동물세포의 산물이며 생리학적 조절물질이라는 사실이 밝혀지면서 수많은 연구가 수행되었다.
   암종의 성장이란 측면에서 NO는 세포 괴사와 종양세포 증식의 매개체로서 이중적인 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다.⁹⁾ 대식구로부터 유리되는 NO는 종양세포에서 세포괴사를 촉진하는 것으로 알려져 있으며¹⁰⁾ 더 나아가서 iNOS 유전자가 존재하는 종양세포에서 생산되는 NO는 그 자신의 괴사 뿐 아니라 주변의 종양세포의 세포독성과 apoptosis를 유발하기에 충분하다는 보고도 있다.¹¹⁾ 반면 암종의 증식에 있어서 NO는 종양의 혈관화와 혈관증식을 촉진시킴으로써, 혈관내피세포로의 종양세포 부착을 매개함으로써, 또는 혈관 투과성을 증진시킴으로써 그 역할을 수행한다. 이와 같은 효과들은 원발 암종의 급속한 성장을 유발시킬 뿐 아니라 타부위로의 전파에도 역할을 하며¹²⁾ 실지로 실험적 연구에서 NOS 활성도가 높은 암종에서 보다 빨리 성장함이 확인되었다.¹³⁾ 이런 연구들에서 NO와 NOS는 직접적으로 발암기전에 역할을 하는 것으로 보여지며¹⁴⁾ 농도에 따라 항암 또는 발암의 양면적인 역할을 할 것이라 추측하고 있다.¹⁵⁾¹⁶⁾
   악성종양과 연관된 NO에 관한 연구는 대개 편평상피세포암, 대장암,¹⁷⁾ 비뇨기 계통의 암,¹⁸⁾ 산부인과적 종양 등¹¹⁾¹⁹⁾에서 이루어졌는데 이들 암종의 성장에 관한 NO의 역할에 대해서 암종의 기원에 따라 심지어는 동일한 암종에서도 서로 상충되는 의견들이 많은 실정이다. 이에 비해 갑상선에서의 NO와 연관된 연구는 거의 없으며 갑상선 암종에서의 보고는 극히 드물다.
   갑상선은 매우 풍부한 혈관 조직으로 이루어진 기관으로 Grave 갑상선 염과 같은 기능 항진증 같은 경우 현저한 혈류증가를 보인다. 갑상선 비대증와 같은 경우에서도 갑상선의 여포세포의 증식 뿐 아니라 혈관의 증식 또한 뚜렷하다.²⁰⁾ 갑상선 비대증의 실험적 모델에서 보면 여포세포의 증식에 앞서 혈관 내피세포의 증식이 선행됨이 관찰되었고 이는 아마도 갑상선 증식에 있어서 혈관화가 중요한 역할을 할 것으로 추정된다.²¹⁾
   1995년 Colin 등²⁰⁾은 rat의 갑상선 조직에서 RT-PCR 증폭을 통하여 처음으로 세 가지 NOS 아형이 발현됨을 보고하였는데 이들은 모두 기능적으로 활성을 가지고 있다고 하였다. 이중에서도 eNOS mRNA가 iNOS, nNOS에 비해 높았다. 실험적으로 rat에 유발시킨 갑상선 비대증 모델에서는 정상 대조군에 비해 nNOS, eNOS가 각각 2.7배, 4.9배 증가하였고 iNOS는 별 변화가 없었다. Iodine으로 쇠퇴(involution)시킨 결과 증가되었던 nNOS, eNOS mRNA 수치는 정상치로 떨어졌다. 이에 그들 연구자들은 실험적 갑상선 비대증 모델에서 적어도 혈관 재배치(vascular remodeling)에 아마도 eNOS가 효소 활성의 주된 역할을 할 것으로 추정하였다.
   본 연구에서는 인간의 갑상선조직에 대해 연구하였고 정상 갑상선 조직에서도 각 NOS 아형의 mRNA는 Colin 등의 연구에서와 마찬가지로 모두 발현되었지만 nNOS와 iNOS의 mRNA 증폭산물은 정상조직에서는 미미하였고 암종에서는 정상조직에 비해 발현이 증가된 양상이었다. eNOS mRNA 증폭산물은 특이하게 정상조직과 암종 모두에서 nNOS와 iNOS에 비해 뚜렷한 증가를 보였는데 이는 갑상선 조직이 기본적으로 정상에서도 풍부한 혈관조직으로 이루어져 있기 때문이라 하겠다. 그러나 역시 암종에서는 정상 조직보다 더욱 많은 eNOS mRNA가 발현되어 암종의 혈관증식에 연관이 있을 것으로 생각된다. 본 연구에서도 각 NOS 특이 단백질의 발현 양상이 달라 일단 NO의 효과에 관여하는 NOS 아형의 효소 활성은 각각 다를 것으로 보인다.
   동일한 연구자들이 수년 후 인간에서 갑상선 기능에 따른 NO의 효과를 연구하였는데²²⁾ 기능항진증을 가진 갑상선 조직에서 eNOS mRNA의 발현이 정상이거나 기능저하증을 가진 갑상선조직에서보다 약 1.6배 증가하였다고 하여 갑상선의 호르몬 분비기능이 증가하였을 때의 eNOS 관여 가능성을 시사하였다. 이들은 또한 면역조직화학적 염색에서 eNOS 항체에 대한 염색이 혈관내피세포 뿐 아니라 여포세포에서도 관찰되었으며 정상이거나 기능저하증 조직에서보다 결절조직과 기능항진증 조직에서 더욱 강하게 관찰되었다고 보고하면서 이런 현상은 NO가 세포학적 기능에는 어떻게 관여할 지 모르지만 기능항진의 혹은 증식성 조직에서 혈관 이완인자(vascular relaxing factor)로서의 역할을 하리라 추정하였다.²²⁾ 이는 본 연구에서 정상조직에 비해 eNOS의 mRNA 산물과 특이 단백질이 검출된 것과 같은 결과로서 기본적으로 암종 역시 혈관 증식성 조직이라는데서 공통점을 갖는다고 하겠다. 향후 암종과 양성 증식성 질환간의 NOS 발현 양상을 비교해 보면 두 군간의 또 다른 차이를 찾을 수 있을 것으로 생각된다.
   이밖에도 Kasai 등²³⁾이 인간 갑상선 선종으로부터 얻은 thyrocytes를 배양하여 anti-carboxy-terminal peptide of mouse macrophage inducible NOS antibody(anti-macNOS Ab)로 면역 염색한 결과 IL-1과 IFN-γ 등의 cytokine으로 자극하였을 경우에만 면역염색 반응을 보였으며 처리하지 않은 세포에서는 면역반응을 관찰할 수 없어 iNOS의 자극에 의한 발현성질을 뒷받침하기도 하였다.
   인간에서 갑상선 암종에 대한 연구는 1999년 Kitano 등¹⁴⁾이 수행한 갑상선 유두상 암종에서의 iNOS발현에 관한 것이 유일한데 이들의 연구결과를 보면 암종에 대한 면역염색에서 암세포에서 양성 세포질반응을 보였으며 이들은 patch로 나타나며 반면 정상 갑상선 조직에서는 면역반응이 관찰되지 않았다고 하였다. 또한 이들을 대식구 특이 항체인 anti-LCA로 확인한 결과 일부만이 대식구에서 염색되어 인간의 갑상선 유두상 암종세포에서 검출되는 iNOS의 대부분은 대식구가 아닌 암세포로부터 기인하는 것이라고 하였다. 본 연구에서도 iNOS에 대해 암종에서 면역반응이 관찰되긴 했지만 그 정도는 nNOS와 eNOS에 비해 약했으며 역시 정상조직에서는 면역반응이 관찰되지 않았다. 이들의 RT-PCR을 이용한 iNOS mRNA의 연구에서도 암종에서는 iNOS message와 상응하는 259 bp의 산물이 검출되었으나 정상조직에서는 전혀 나타나지 않았다. 본 연구에서도 iNOS mRNA의 증폭산물은 암종에서만 발현되었지만 그 강도 역시 nNOS, eNOS에 비해 미약했다. 특이할 점은 Kitano 등은 RT-PCR 수행 후 Western blot 등을 통한 단백질 분석을 시행하지 않았는데 본 연구에 의하면 iNOS mRNA는 발현된데 비해 iNOS 특이 단백질은 전혀 검출되지 않았다. 이를 수행한 다른 연구가 없어 비교할 수는 없지만 이와 같은 현상은 아마도 갑상선 유두상 암종에 존재하는 iNOS mRNA는 단백질을 합성할 능력이 없을 가능성도 있다고 추정할 수 있다. 이와 비슷한 연구는 이전에도 있었는데 1994년 Jenkins 등¹⁵⁾은 인간의 대장 선암 세포주(colonic adenocarcinoma cell line)에서 수행한 연구에서 유사한 상피세포에서 기원한 종양세포에서도 서로 다른 다양한 양상의 NOS 유전자를 가지고 있을 가능성을 제시하고 mRNA 단계에서 검출되었다 하더라도 이들이 항상 측정할 수 있는 활성도를 갖지는 않는다고 하였다. 또한 nNOS의 연구에서 nNOS 특이 단백질의 발현이 N-말단과 C-말단에서 고안한 각각의 항체에 대해 다른 결과를 보인 것은 nNOS 발현의 분포에 차이가 있거나 nNOS 단백질의 전체 길이가 아닌 비정상적인 형태로 존재하고 있을 가능성을 시사한다. 특히 N-말단의 항체를 사용한 Western blot에서 160 kDa보다 작은 약 45, 50, 80 kDa 근처에서 대량의 특이 단백질이 검출된 것은 이와 같은 현상의 가능성을 뒷받침한다고 하겠다.
   이와 비슷한 구조적 다양성(structural diversity)의 가능성은 이전의 연구자들의 보고로도 뒷받침되는데 먼저 1997년 Eliasson 등²⁴⁾은 nNOS mRNA의 무작위접합(alternative splicing)으로 인하여 다른 변형인 nNOS α를 쥐의 뇌 조직에서 발견하였고 이후 역시 뇌 조직에서 nNOS β, nNOS γ가, 최근에는 쥐의 근육조직에서 nNOS μ가 발견되었다. 이와 같이 구조적인 변형이 있음에도 불구하고 nNOS α, nNOS β, nNOS γ는 정상적인 nNOS의 활성도를 갖는 것으로 알려졌으며 nNOS μ는 활성을 갖지 않았다. 한편 iNOS에 대해서도 몇 가지 아형들이 발견되었는데 1995년 Chu 등²⁵⁾은 인간의 폐포 대식구와 기관 상피세포에서 5-untranslated region을 갖는 iNOS mRNA를 보고하였고 이어 Park 등²⁶⁾이 인간의 망막에서 NOS II-1과 NOS II-2 등의 구조변형 된 형태를 보고하였다.
   본 연구에서 보인 nNOS에 대한 결과는 갑상선 암종에서 조직특이적으로 구조적 다양성을 가지는 유전자가 존재할 수 있음을 시사하는 소견이라 생각한다. 특히 80 kDa에서의 밴드는 160 kDa의 정상 크기의 nNOS 단백질이 비교적 소량 검출되었음에도 불구하고 면역염색에서의 매우 강한 면역반응을 설명할 수 있다. 즉, 면역염색반응을 일으킨 nNOS의 단백질 중의 상당량은 80 kDa의 비정상적인 nNOS일 수 있으며 이들이 기능적인 측면에서 어떠할 지는 추가의 연구가 필요하며 이러한 사실로 볼 때 NOS의 발현을 단지 면역염색반응만을 보고 판단하는 것은 성급한 일이라고 사료된다.
   전체적인 연구를 종합해 보면 NO를 생성할 수 있는 각각의 NOS의 발현에 차이가 있었으며 특히 nNOS가 강하게 발현되었고 eNOS, iNOS으로 그 강도가 감소하는 것으로 보아 갑상선 유두상 암종에서는 nNOS와 eNOS가 주된 역할을 할 것으로 추정되며 이들이 과연 기능적으로 활성을 갖는 단백질을 생성하는지는 NO 활성도의 측정을 통해 밝혀야 하겠고 구조적 다양성의 가능성에 대해서는 DNA sequencing 등으로 확인해야 할 것이다.

결     론

   갑상선 유두상 암종에서의 각 NOS의 발현 양상은 다른 암종에서의 연구와는 상이하였으며 상당히 복잡한 양상을 보였지만 대체로 갑상선 유두상 암종에 관여하는 NO는 iNOS보다는 주로 nNOS와 eNOS에 의해 생성되는 것으로 보인다.
   nNOS 경우 이들 중 상당수는 구조적 변형을 가지고 있을 가능성이 있으나 이들이 실제로 NO의 생성을 매개하는 정상적인 기능을 가지고 있는지는 확인하지 못하였다. iNOS에선 mRNA는 발현되었지만 특이 단백질이 검출되지 않아 이는 매우 낮은 iNOS 발현 또는 기능적으로 결함이 있는 iNOS가 존재할 가능성도 있겠다.
   eNOS의 경우 정상조직에서의 발현은 혈관이 풍부한 갑상선의 조직학적 특성을 대변하는 것이며 암종에서의 증가된 발현은 종양내의 비정상적인 혈관증식에 관여하기 때문이라고 생각된다.
   NO가 실제로 인간에서 악성종양의 발생과 전파에 있어서 어떤 역할을 할 것인가는 아직 밝혀지지 않았지만 NO에 연관된 복잡한 기능을 이해함은 향후 NO의 작용을 적절히 조절함으로써 치료에 새로운 응용 가능성을 제시할 수 있다고 사료된다.

1. Yuspa SH, Dlugosz AA, Cheng CK, Denning MF, Tennenbaum T, Glick AB, et al. Role of oncogenes and tumor suppressor genes in multistage carcinogenesis. J Invest Dermatol 1994;103(suppl 5):90-5.

2. Palmer RMJ. The discovery of nitric oxide in the vessel wall. Arch Surg 1993;128:396-401.

3. Nakayama DK, Geller DA, Lowenstein CJ, Chern HD, Davies P, Pitt BR, et al. Cytokines and lipopolysaccharide induce nitric oxide synthase in cultured rat pulmonary artery smooth muscle. Am J Respir Cell Mol Biol 1997;7:471-6.

4. Andrade SP, Hart IR, Piper PJ. Inhibitors of nitric oxide synthase selectively reduce flow in turnout-associated neovasculature. Br J Pharmacol 1992;107:1092-5.

5. Stuehr DJ, Nathan CF. Nitric oxide: a macrophage product responsible for cytostasis and respiratory inhibition in tumor target cells. J Exp Med 1989;169:1543-55.

6. Mills CD. Molecular basis of suppressor macrophages. J Immunol 1993;146:2719-23.

7. Li LM, Killbourn RG, Adams J, Fidler IJ. Role of nitric oxide in lysis of tumor cells by cytokine-activated endothelial cells. Cancer Res 1991;51:2531-5.

8. Calmels S, Hainaut P, Ohshima H. Nitric oxide induces conformational and functional modifications of wild-type p53 tumor suppressor protein. Cancer Res 1997;57:3365-9.

9. Vamvakas S, Schmidt HH. Just say NO to cancer? J Natl Cancer Inst 1997;89:406-7.

10. Cifone MG, Cironi L, Meccia MA, Roncaioli P, Festuccia C, De Nuntiis G, et al. Role of nitric oxide in cell-mediated tumor cytotoxicity. Adv Neuroimmunol 1995;5:443-61.

11. Xie K, Huang S, Dong Z, Juang SH, Wang Y, Fidler IJ. Destruction of bystander cells by tumor cells transfected with inducible nitric oxide (NO) synthase gene. J Natl Cancer Inst 1997;89:421-7.

12. Gavilanes J, Moro MA, Lizasozin I, Lorenzo P, Perez A, Leza JC, et al. Nitric oxide synthase activity in human squamous cell carcinoma of the head and neck. Laryngoscope 1999;109:148-52.

13. Jenkins DC, Charles IG, Thomsen LL, Moss DW, Holmes LS, Baylis SA, et al. Roles of nitric oxide in tumor growth. Proc Natl Acad Sci USA 1995;92:4392-6.

14. Kitano H, Kitanishi T, Nakanishi Y, Suzuki M, Takeuchi E, Yazawa Y, et al. Expression of inducible nitric oxide synthase in human thyroid papillary carcinomas. Thyroid 1999;9:113-7.

15. Jenkins DC, Charles IG, Thomsen LL, Moss DW, Holmes LS, Baylis SA, et al. Roles of nitric oxide in tumor growth. Proc Natl Acad Sci USA 1995;92:4392-6.

16. Moncada S, Palmer RM, Higgs EA. Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology. Pharmacol Rev 1991;43:109-42.

17. Fukumura D, Yuan F, EnDo M, Jain RK. Role of nitric oxide in tumor microcirculation: blood flow, vascular permeability, and leukocyte-endothelial interactions. Am J Pathol 1997;150:713-25.

18. Jansson OT, Morcos E, Brundin L, Bergerheim US, Adolfsson J, Wiklund NP. Nitic oxide synthase activity in human renal cell carcinoma. J Urol 1998;160:556-60.

19. Thomsen LL, Lawton FG, Knowles RG, Beealey JE, Riveros MV, Moncada S. Nitric oxide synthase activity in human gynecological cancer. Cancer Res 1994;54:1352-4.

20. Colin IM, Nava E, Toussaint D, Maiter DM, vanDenhove MF, Luscher TF, et al. Expression of nitric oxide synthase isoforms in the thyroid gland: Evidence for a role of nitric oxide in vascular control during goiter formation. Endocrinology 1995;136:5283-90.

21. Danef JF, Ovaert C, Many MC. Experimental goitrogenesis. Ann Endocrinol (Paris) 1989;50:1-15.

22. Colin IM, Kopp P, Zbaren J, Haberli A, Grizzle WE, Jameson JL. Expression of nitric oxide synthase III in human thyroid follicular: Evidence for increased expression in hyperthyroidism. European Journal of Endocrinology 1997;136:649-55.

23. Kasai K, Hattori Y, Nakanishi N, Manaka K, Banba N, Motohashi S, Shimoda S. Regulation of inducible nitric oxide production by cytokines in human thyrocytes in culture. Endocrinology 1995;136:4261-70.

24. Eliasson MJL, Blackshaw S, Schell MJ, Snyder SH. Neuronal nitric oxide synthase alternatively spliced forms: prominent functional localizations in the brain. Proc Natl Acad Sci USA 1997;94:3396-401.

25. Chu SC, Wu HP, Banks TC, Eissa NT, Moss J. Structural diversity in the 5'-untranslated region of cytokine-stimulated human inducible nitric oxide synthase mRNA. J Biol Chem 1995;270:10625-30.

26. Park CS, Lee HS, Lee HY, Krishna G. An unprocessed pseudogene of inducible nitric oxide synthase gene in human. Biology and Chemistry 1997;1:294-300.