교신저자：노혜일, 442-723 경기도 수원시 팔달구 지동 93번지  가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   표피 세포층과 표피하 세포층 사이의 상호작용으로 표피 세포층의 성장과 분화, 조직 항상성이 유지되며¹⁾ 이중 표피하 세포층의 섬유아 세포는 세포외 물질을 만들어 구조적 골격을 만드는 역할을 할 뿐만 아니라 여러 성장인자와 cytokine을 분비하여 피부 조직의 표피와 진피층 사이의 물질 교환이 이루어지게 한다.²⁾ 이런 상호관계는 명확히 알려져 있지는 않으나 IL-1β 같은 cytokine이 각질세포로부터 분비되어 섬유아 세포의 각질세포성장인자(KGF：keratinocye growth factor)의 유전자 발현을 촉진하며³⁾ 각질세포성장인자가 분비되면 이는 다시 표피층의 각질세포의 성장과 분화를 촉진한다. 이처럼 각질세포성장인자는 표피 세포층과 표피하 세포층 사이의 상호관계에 작용하는 주변 분비 전달인자(paracrine mediator)로서의 역할이 많이 알려져 있으나⁴⁾ 처음 발견 당시에는 섬유아세포성장인자(FGF：fibroblast growth factor)의 하나로 FGF-7로 명명되었다.⁵⁾ 각질세포성장인자는 섬유아세포에서 분비되지만 주로 표피세포, 특히 각질세포에 세포분열을 일으키고 섬유아세포나 내피세포에는 작용하지 않는다.⁶⁾ 각질세포성장인자수용체(KGFR：keratinocye growth factor receptor)는 transmembrane tyrosine kinase, 즉 FGF type 2 receptor의 변형이며(alterantely spliced varient of FGF type 2 receptor：FGF2IIIb isoform) KGF와 산성 섬유아세포 성장인자와 결합한다.⁷⁾⁸⁾ 여기까지 알려진 결과를 종합하여 모식도로 그려보면 Fig. 1과 같다.
   이 연구의 목적은 위 연구들의 지식을 참조하여 본 실험을 통해서 구인두 점막의 삼차원 세포 배양 시스템을 확립하고자 하였다. 또한 확립된 배양 시스템이 구인두 점막의 표피층과 표피하 세포층 사이의 기능적 상호 작용을 연구할 수 있는 실험 모델로 적합한지 파악하고자 하였으며 이를 위하여 배양된 점막과 정상 점막의 각질세포성장인자와 그 수용체의 면역화학 염색 양상 등을 비교하고자 하였다.

대상 및 방법

   총 5예의 연구개 성형술시 얻은 설구개궁의 점막 조직을 이용하여 각질형성세포와 섬유아 세포를 각각 일차 조직 배양한 후 2차 계대 배양한 각질형성세포와 섬유아 세포를 type I collagen을 사용하여 삼차원적 세포 배양 시스템으로 만들었다. 표피하 세포층의 섬유아 세포에서 각질세포성장인자의 발현을 유도하기 위해 IL-1β를 0.5 ng/ml, 1.0 ng/ml, 10 ng/ml씩 배양액에 첨가하였으며 2주 후 완성된 3차원 배양조직을 파라핀 포매 후 각질세포성장인자와 그 수용체의 발현을 면역조직화학적염색을 이용하여 관찰하였다. 대조를 위해 설구개궁의 점막 조직에서도 각질세포성장인자와 그 수용체의 면역조직화학적염색을 시행하였다.

구인두 조직의 조직 배양
   연구개 성형술시 얻은 설구개궁의 점막 조직을 phosphate buffered saline(PBS)에 담아 실험실로 옮겨 penicillin G sodium 100 U/ml, streptomycin sulfate 100 μg/ml, amphotericin B 0.25 μg/ml(GIBCO, Grand Island, N.Y., USA)가 첨가된 PBS용액으로 3회 세척하였다. 두꺼운 점막 조직을 가늘게 여러 조각으로 자른 후 0.2% collagenase type IV(5 mg/ml, Sigma, St. Louis, Mo., USA)로 4°C에서 12시간 처리하여 섬유아 세포와 각질세포가 조직으로부터 유리될 수 있도록 만들었다. 이중 일부는 200 μg/ml nylon membrane에 통과시킨 후 섬유아 세포가 100 mm petri-dish에 1×10⁶개가 되도록 RPMI(GIBCO, Grand Island, N.Y., USA)에 nonessential amino acids, 1% HEPES, 1% glutamate, 10% fetal bovine serum, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin and 0.25 μg/ml amphotericin B(GIBCO, Grand Island, N.Y., USA)을 첨가하여 세포가 단층을 형성할 때까지 37°C, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배양 세포가 단층을 형성하면 0.25% trypsin과 0.02% EDTA로 분리시켜 계대 배양하였다.
   각질형성세포의 분리는 조직을 collagenase에 처리한 후에 조직을 petridish에 부착시켜 RPMI를 조직이 잠길 정도로만 넣고 각질형성세포가 자라나는 것을 확인하면서 섬유아 세포가 섞여 자라는 경우 0.25% trypsin-EDTA로 2~3분간 처리하여 섬유아 세포가 먼저 쉽게 플라스틱 표면에서 떨어지는 성질을 이용하여 섬유아 세포를 떼어내고 각질형성세포를 남겨 배양한 후 이를 수차례 반복하여 세포가 90%의 단층을 형성하면 DMEM과 Ham's F-12 Nutrient(GIBCO)를 이용하여 계대 배양하였다.

삼차원적 세포 배양과 IL-1β의 처리
   2차 계대 배양한 각질형성세포와 섬유아 세포를 trypsin-EDTA로 처리하여 낱개의 세포로 유리시킨 후 세포농도를 섬유아 세포는 collagen solution mixture에 대해(2.25×10⁵)개로 조정하였으며 collagen gel은 type I collagen(Koken, Tokyo, Japan)을 Buffer와 ×10 P media(1L용 DMEM 3개와 Ham's F-12 Nutrient mixture 1개, Antibiotics-Antimycotic solution 4 ml를 증류수로 녹여 400 ml로 만듬)를 8：1：1의 부피 비로 섞은 후 섬유아 세포를 1.8×10⁷cells에 collagen 8 ml와 잘 혼합하여 섞은 후 24-well에 300 μl씩 분주하여 37°C에서 3시간 동안 polymerization시켰다. 섬유아 세포를 collgen gel에서 2일 정도 배양하다가 그 위에 각질형성세포를 3×10⁶cells/ml로 만들어 200 μl씩 분주한 후 다시 7일간 배양하였다. 2일마다 배양액을 바꾸었으며 7일 후에는 각질 세포 위의 배양액은 세포가 잠기지 않고 공기에 노출이 되도록 하였다.
   IL-1β(R & D systems Inc, Minneapolis, MN. U.S.A.)는 4군으로 나누어 첨가하지 않은 군과 0.5 ng/ml, 1.0 ng/ml, 10 ng/ml 씩 첨가한 군으로 각각 섬유아 세포층의 배양액에 첨가하였으며 배양 시작에 첨가하여 배양액을 교환할 때마다 같은 농도를 유지하였다(Fig. 2).

면역조직화학적염색
   공배양된 각질형성 세포층과 섬유아 세포층을 24-well plate에서 구조적 변형이 없도록 조심스럽게 들어내어 10% neutral formalin 용액에 고정하여 파라핀 포매 후 6μm의 두께로 연속절편을 만들어 특수 처리된 슬라이드(Poly-L-lysine coated, Probe On Plus Microscopic slides, Fisher Scientific, Pittsburg, PA, U.S.A)에 붙인 후 일부는 hematoxylin-eosin 염색하여 형태와 구조를 관찰하였고 나머지 조직절편들을 R.T.U. VECTASTAIN Universal Quick Kit(Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA, U.S.A.)를 이용하여 다음과 같은 과정을 거쳐 각질형성세포성장인자와 그 수용체에 대한 면역조직화학염색을 실시하였다.
   조직 절편이 부착된 슬라이드를 60°C 오븐에 15분간 넣은 후 Xylene으로 실온에서 10분간 3회 반복 처리하여 파라핀을 제거한 후 100%, 90%, 80%의 연속적 알콜과 증류수로 함수시킨 후 내인성 과산화 효소의 반응을 억제시키기 위하여 3% hydrogen peroxide에 45°C에서 15분간 반응시켰다. 이후 세척 완충액으로 3회 세척후 비특이 단백의 결합을 제거하기 위해 비면역 말혈청(normal horse serum, NHS)에 10분간 작용시켰다. KGF에 대한 일차항체는 goat polyclonal anti FGF-7(Santa Cruz Biotechnology, Inc CA, U.S.A.)을, KGFR에 대한 일차항체는 goat polyclonal anti KGFR(Santa Cruz Biotechnology, Inc CA, U.S.A.)을 1：50으로 희석하여 45°C에서 1시간 동안 반응시킨 후 PBS 완충액으로 5분간 2회 세척하였다. 이차 항체는 biotinylated pan-specific secondary antibody(Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA, U.S.A.)를 사용하였으며 streptavidin/peroxidase를 사용하여 biotinavidin 특이 결합을 유도한 후 AEC(3-amino-9-ethyl carbonate)을 이용한 10분간의 발색을 거쳐 20초간 Mayer's hematoxyline 염색으로 대조 염색하였다. 각 항체에 대한 양성 대조군으로 KGF, KGFR 모두 구인두 점막 조직을 이용하였고 음성 대조군으로는 일차 항체 대신 PBS를 썼다.

결     과

   설구개궁의 점막 조직에서 각질세포성장인자와 그 수용체의 면역조직화학적염색 결과 5예 모두 표피 세포층의 basal layer, suprabasal layer 이상의 intermediate layer와 superficial layer의 세포질내에서 강한 양성 반응을 보였다(Figs. 3 and 4). 총 5예 중 4예에서 삼차원적 세포 배양 시스템을 성공하였고 광학 현미경하에서 H&E 염색에서 섬유아 세포가 포함된 collagen matrix 상부의 표피 세포층에 각질세포들이 10여 층을 형성하면서 상층으로 갈수록 비각질성 중층 분화(noncornified and stratified differentiation)를 보였다. 삼차원적 세포 배양 시스템에서 얻은 조직에서의 각질세포성장인자와 그 수용체의 면역조직화학적염색 결과, 4예에서 모두 10 ng/ml의 IL-1β를 첨가한 군에서만 각질세포성장인자가 표피 세포층에 국소적으로, 표피하 세포층의 섬유아 세포 주위의 간질 조직에 미만적으로 분포하였고(Fig. 5) 각질세포성장인자의 수용체는 표피 세포층에 국소적 염색되었으나(Fig. 6) 모두 실제 조직과는 달리 세포층에 따른 분포 양상의 차이는 없었다.

고     찰

   Interleukin-1이 발견되고 처음 명명될 때에는 주로 T 임파구에 영향을 미친다고 알려졌으나 최근에는 과립세포와 B 임파구, 섬유아 세포, 혈관내피세포에도 작용하며⁹⁾ 이를 분비하는 세포도 단핵구 세포나 거대세포 뿐만 아니라 다른 여러 세포들에서도 만들어지는데 특히 표피 세포중 각질 세포에서 IL-1을 분비한다는 발견¹⁰⁾이 있었으며 각질세포에서 분비된 IL-1β가 섬유아세포에서 KGF 발현을 유도하며³⁾ IL-1β의 발현과 KGF mRNA의 발현 사이에 강한 연관 관계가 있으며¹¹⁾ 사람의 각막 섬유아세포에서 IL-1β이 KGF을 유도하며 표피-간질조직간 조절(epithelialstromal regulatory loop)에서 IL-1β이 중요한 조절자 역할을 한다는 사실과¹²⁾ 사람의 피부 세포에서 배양한 섬유아세포와 각질 세포로 만들어진 삼차원 배양 시스템에서도 IL-1β이 KGF을 유도한다는 것을 RT-PCR 방법으로 증명하였다.¹³⁾
   특별한 자극을 주지 않아도 구인두점막에서 섬유아세포만을 배양하여 IL-1β와 KGF를 포함한 여러 cytokine을 측정해보면 피부 조직의 섬유아 세포보다도 많은 양이 분비된다. 이는 구강의 점막 섬유아 세포들이 피부 조직의 섬유아 세포보다 외부 자극이나 염증 반응에 대하여 더 활발한 상태에 있다고 생각한다.¹⁴⁾
   본 실험에서 사용한 IL-1β의 용량은 KGF이 80 ng/ml 첨가된 경우는 500 pg/ml의 용량으로도 KGFR의 mRNA의 발현이 증가되었으며¹⁵⁾ 각막의 섬유아세포 배양 실험에서는 10 ng/ml의 용량으로 KGFmRNA의 발현이 증가되었다는 보고¹²⁾를 참고하여 실험 용량을 설정하였고 본 실험에서 면역조직화학적염색 결과 KGF와 KGFR 단백질의 발현은 10 ng/ml의 용량부터 발현이 관찰되었다. 따라서 배양액에 첨가된 IL-1β의 용량과 KGF와 KGFR 단백질의 발현이 관련이 있다고 생각한다. 이런 여러 연구들의 결과를 종합하여 구인두 표피 세포층과 표피하 세포층 사이의 상호작용을 세포 분비, 교환 물질인 IL-1β의 영향 하에서 각질세포성장인자와 그 수용체의 발현을 삼차원 배양 시스템에서 실재 조직과 관찰할 수 있다면 이 결과를 통하여 구인두 점막의 표피층과 표피하 세포층 사이의 상호 작용을 연구할 수 있는 실험 모델로서 삼차원 세포 배양 시스템이 적합하다는 결론을 유추할 수 있다.
   본 연구는 위의 축적된 지식을 바탕으로 하여 인두 점막의 세포들을 배양하여 형성한 삼차원 배양 시스템에서 표피 세포층과 피하 세포층 사이의 cytokine과 성장인자 사이의 상호 관계를 증명할 수 있는지를 알아보고자 하였다. 예비 실험을 통하여 각질세포성장인자와 그 수용체의 발현이 일반 피부조직보다는 구인두 점막 조직에서 면역 조직화학적 방법으로 잘 확인된다는 점과 구인두 점막조직을 이용한 조직 배양과 삼차원배양이 다른 조직들에 비해 구축하기가 실험적으로 쉽다는 점을 이용하였다. 조직에 비해서 삼차원 배양 조직에서 각질세포성장인자와 그 수용체의 발현이 면역 조직화학적 방법으로 나타나지 않아 각질 세포분비 물질의 하나인 IL-1β을 세포배양액에 첨가하여 각질세포성장인자와 그 수용체의 발현을 유도하였고 이 과정에서 삼차원 배양 시스템이 표피 세포층과 피하 세포층 사이의 유기적인 관계, 즉 세포층간에 역동적인 정보 교환이 이루어지고 있음을 추정할 수 있었다. 또한 이 결과로 미루어보아 이 시스템의 실험 모델로서의 가치를 평가할 수 있었다.
   1980년대 인체의 표피와 유사한 기저 세포층, 유극 세포층, 과립층, 각질층으로 구성된 피부 조직을 얻을 수 있는 각질 형성 세포의 삼차원적 세포배양이 개발되어 피부의 분화를 연구하고 독성 검사나 약물 대사 등의 연구에 이용되고 있다. 또한 이 시스템은 세포와 세포, 세포와 기질사이의 물질 교환을 연구하는데 적합한 모델로 알려졌다.¹⁶⁾ 인공 피부 모델 외에도 사람의 구강 점막의 섬유아 세포와 각질 세포를 collagen lattis를 이용하여 구성한 living oral mucosa equivalent, LOME이 국내에서 발표된 바 있다. 이 모델은 생체 상태와 분화 표식자가 동일함을 확인하였고 이 시스템에 retinoic acid와 calciprtriol 등의 영향을 확인한 바 있어 약물 연구에 적합함을 증명하였다.¹⁷⁾ 삼차원적 배양은 단층 배양에 비해 생체에 근접한 환경을 제공할 수 있고 삼차원적 배양한 섬유아 세포는 생물학적 차이뿐만 아니라 형태학적인 면에 있어서도 차이를 보여 섬유아 세포의 생물학적 연구에는 삼차원 배양 모델이 적절하다고 보고하였다.¹⁸⁾ Kim 등은 각질 형성 세포를 섬유아 세포와 함께 공배양시 각질 형성 세포의 증가가 관찰되고 세포핵의 형태가 다양하게 나타나는 등의 증식이 증가되고 분화가 억제된 소견을 보여서 섬유아 세포가 각질 형성 세포의 증식과 분화에 영향을 미치는 것을 시사하였다.¹⁹⁾
   그 외에도 실험실적 연구의 범위에서는 세포 공배양 시스템이 세포간 물질 이동을 알아보는 연구 모델로는 적합하다고 하였는데 이는 단층 배양 상태보다는 좀더 생리적인 환경을 조성해주기 때문이다.²⁰⁾ 그러나 실제 생체 조직에서는 세포간에 확산 가능한 물질과의 정보교환 외에도 세포와 세포 간질 사이의 유착 분자의 역할이 있으므로 삼차원 배양 시스템도 생체 조직과는 분명한 차이를 보인다. 이런 모델의 단점을 보완하여 실험에 사용하기 위하여는 한계점을 정확히 아는 것이 필요하다. 본 실험에서는 구인두 삼차원 배양 시스템에서 배양액에 첨가된 IL-1β에 의해 표피하층 섬유아세포에서 분비되어 표피층으로 확산하는 각질세포성장인자와 표피층에 분포하는 수용체의 발현을 면역 조직화학적 염색 방법으로 확인할 수 있어 이 시스템이 역동적인 세포간 분비물질을 확인하는 모델로서는 적합했다고 생각한다. 그러나 세포층의 분화 정도와 세포-기질간의 성숙이 미비하여 생체 조직에 비해서는 불완전한 물질 이동 분포를 나타냈다. 그러므로 이 모델을 이용한 실험에서는 그 결과 해석에 있어 정상 조직과의 차이를 충분히 고려하여야 한다.

결     론

   구인두 점막을 이용한 삼차원 세포 배양은 실험적으로 가능하였고 배양된 세포층에서 각질세포성장인자와 그 수용체의 면역 조직화학적 결과 정상 점막과는 분포 양상에 차이를 보이지만 IL-1β의 첨가로 KGF와 KGFR의 발현을 유도할 수 있었으므로 삼차원 세포 배양 시스템에서 표피 세포층과 표피하 세포층 사이에 분비 물질을 통한 정보 교환이 이루어짐을 추정할 수 있었다. 따라서 구인두 삼차원 세포배양 시스템은 표피층과 표피하 세포층 사이의 상호작용을 연구할 수 있는 실험 모델이지만 정상 조직에 비해서는 분비 물질의 이동이 불완전하여 이 모델을 이용한 실험에서는 그 결과 해석에 있어 정상 조직과의 차이를 충분히 고려하여야 함을 알 수 있었다.

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