교신저자：홍성화, 135-710 서울 강남구 일원동 50  성균관대학교 의과대학 삼성서울병원 이비인후과학교실
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서     론

   신경세포의 분리 배양은 단일 세포에 관련된 변환기전 및 형질이동, mRNA의 발현, 독성작용에 대한 기전을 연구할 수 있는 실험 모델을 제시한다. 중추 신경계의 신경세포에 대한 배양 기법은 많이 사용되어 왔지만, 청각과 관련된 나선 신경절 세포의 분리 배양 기법은 여러 효소반응을 통한 분리기법이 확립¹⁾²⁾되면서 최근에 들어서 사용되고 있다. 이는 나선신경절의 신경세포의 수가 적고(흰쥐에서 15800개),³⁾ 위치상 와우내의 특정부위(Rosenthal's canal)에만 존재하므로 분리율이 매우 작아 어려움이 있기 때문이다.
   이러한 분리배양기법은 나선 신경절 세포의 생존이나 사멸에 대한 연구를 위해 사용되었고, 발생 및 이독성 손상 후 신경절세포의 생존 및 재생에 관련된 NT3나 BDNF와 같은 neurotrophic factor의 연구²⁾⁴⁾⁵⁾ 및 bFGF,⁶⁾ NGF⁷⁾의 연구에 이용되고 있다.
   그러나 세포의 배양 과정에는 효소처리, 물리적 분리과정이 추가되고 배양조건이 달라 와우 내에서의 나선신경절과 배양 후의 나선신경절은 생물학적 특성의 차이가 있을 수 있어 결과 해석에 주의를 요한다. 따라서 조직내의 나선신경절의 세포와 분리배양된 세포간의 생물학적인 차이가 없음을 확인하여야 분리배양 된 세포를 이용할 수 있을 것이다.
   본 연구의 목적은 흰쥐의 와우에서 분리된 나선신경절세포를 배양하는 기법을 확립하는 데 있다. 배양된 나선신경절세포는 intermediate filament(NF 160, NF 200), Calcium binding protein(S-100)과 neuronspecific enolase(NSE)의 항체를 이용한 면역조직화학염색과 면역형광염색을 시행하여 신경세포의 염색학적 특성을 알아보았다.

재료 및 방법

실험동물 및 와우조직표본
   실험 동물로는 생후 5~6일 된 S/D(Sprague Dawley)쥐를 사용하였다. 약 10분간 얼음 마취 후 두부를 절단하고 측두골을 분리한 후 와우를 채취하였다. 파라핀 포매조직을 만들기 위해 조직을 10% neutral buffered formalin 용액에 고정시켰다. PBS(phosphate buffered saline)로 씻은 다음 알코올로 탈수과정을 거치고 Xylene으로 세 차례 처리 후에 파라핀을 침투시켜 포매조직을 만들었다. 이렇게 만들어진 포매 표본은 면역조직화학염색을 위해 4 μm 두께로 잘라서 poly-L-lysine으로 코팅된 슬라이드에 부착시켜 조직절편을 만들었다.

세포분리 및 세포배양
   세포 배양은 본 실험실에서 시행되고 있는 방법을 사용하였다.⁸⁾ 생후 5~6일 된 S/D(Spraque Dawley) 쥐의 와우를 채취한 뒤 와우의 외벽을 이루고 있는 연골조직과 와우의 혈관조(stria vascularis) 및 나선인대(spiral ligament)를 제거하였다. 코르티 기관을 제거하면 와우의 내벽이 노출되는데 이것을 조심스럽게 제거한 후 나선신경절 조직을 얻어 칼슘과 마그네슘을 함유한 HBSS(Hank's Balanced Salt Solution)에 담가두었다. HBSS에 담겨져 있는 나선신경절 조직은 효소용액(0.1% Collagenase, 0.1% Trypsin, 0.01% DNAse I)으로 37°C에서 30분간 반응시킨 후에 10% FBS(Fetal Bovine Serum)로 효소들을 비활성화 시키고 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)으로 두 번 세척하였다. 효소에 의한 일차적 분리를 한 후 조직을 DMEM(10% Horse Serum, 5% FBS) 배양액에 옮긴 후 유리 Pasteur pipette으로 여러 번 물리적 힘을 가하여 물리적 분리를 다시 시행하고 15 μm Nitex mesh를 통과시켜서 깨끗하게 분리된 나선 신경절 세포를 얻었다. 배양용기는 우선 poly-L-ornithine(0.1 mg/ml)로 실온에서 1시간 방치한 후에 증류수로 세 번 세척 후 자외선 아래서 완전히 건조시키고 laminin(20 μg/ml)으로 4°C에서 16시간 이상 방치하여 미리 준비하였다. 이와 같이 코팅된 배양용기에 단일세포로 분리된 나선 신경절 세포를 넣어서 37°C, 5% CO₂ 배양기에서 48시간 이상 배양하였다.

면역조직화학적 염색
   신생 흰쥐의 와우에서 채취한 나선신경절조직에서 신경세포와 슈반세포의 염색을 확인하기 위해 Histostain^TM-plus kits(Zymed, San francisco, USA)를 이용하여 면역조직학적 염색을 시행하였다. 우선 절편조직을 탈파라핀화시키고 함수과정을 거친 후에 내인성 peroxidase의 활성을 없애기 위해 3% H₂O₂를 실온에서 20분간 처리했다. 그 뒤 TBS(Tris Buffered Saline)용액으로 잘 씻어준 후 비특이적 결합을 방지하기 위해 실온에서 1시간 동안 normal goat serum 으로 반응시킨 다음 1차 항체를 실온에서 2시간 반응시키고 TBS 용액으로 3회 세척하였다. 그 후 2차 항체를 실온에서 30분간 반응시키고 DAB(Diaminobenzidine)를 이용하여 현미경상에서 발색했으며 auto hematoxylin으로 대조염색을 시행했다. 염색이 끝난 후에 봉입액을 이용하여 커버 글라스로 봉입한 후 광학 현미경하에서 관찰하였다. 나선 신경절 조직에서 신경세포를 염색하기 위해 사용한 1차 항체는 NSE(Neuron Specific Enolase, Zymed, San Francisco, USA, 1：100), NF-160(Neurofilament-160, Zymed, San Francisco, USA, 1：800), NF -200(Neurofilament-200, Sigma, St. Louis, USA, 1：800)와 주변 세포인 슈반세포에 특이적으로 결합하는 S-100(DAKO, Copenhagen, Denmark, 1：3000) 항체를 이용하였다. 채취한 조직에서 분리 배양한 신경 세포절 세포의 면역학적 염색도 위의 방법 중 몇 단계만 변형하여 동일한 방법으로 시행하였다.

이중면역형광 염색
   나선신경절 조직절편과 조직에서 분리 배양한 나선신경절 세포의 이중면역형광 염색을 시행하였다. 조직절편은 탈파라핀화 과정을 거친 다음 배양된 세포와 함께 일련의 면역형광 염색을 시행하였다. 세포 침투성을 높이기 위해 0.2% Triton X-100을 상온에서 15분간 반응시키고 normal goat serum을 이용하여 37°C에서 1시간 동안 비특이적 반응을 억제시킨 다음 1차 항체(NSE, NF-160, NF-200, S-100)들을 적정비율로 희석하여 37°C에서 1시간 동안 반응시킨 후 PBS로 3회 5분간 씻어준 후 2차 항체를 반응시켰다. 2차 항체는 FITC(Fluorecein isothiocynate)-conjugated goat antimouse IgG(Zymed, San Francisco, USA, 1：50)와 TRITC(tetramethyrhodamin isothiocynate)-conjugated goat antirabbit IgG(Zymed, San Francisco, USA, 1：30)를 희석하여 37°C에서 1시간 동안 반응시켰다. 이것을 PBS로 3회 씻어준 후 대조염색을 위해 Hoechst 33258(Sigma, St. Louis, USA, 1 μg/ ml)로 상온에서 15분간 반응시킨 후 Fluorescence medium으로 봉입하고 형광현미경으로 관찰하였다.

결     과

   파라핀 포매 후 제작된 조직 절편에서 시행한 면역화학염색과 면역형광염색의 결과는 Fig. 1과 같다. NSE는 면역조직화학염색과 면역형광염색에서 모두 나선신경절 세포의 핵과 세포질을 강하게 염색시켰다(Fig. 1A and D). NF-160와 NF-200는 주로 나선신경절 세포의 세포질과 신경섬유에만 강하게 염색되었다(Fig. 1B, C and E). S-100는 주로 신경절 세포 주변의 슈반세포에 염색되는 것을 확인하였다(Fig. 1F).
   분리 배양된 세포에서는 면역조직화학염색으로는 비특이적인 반응이 많이 보여 염색 특성을 확인하기 어려웠다. 그러나 이중면역형광염색을 시행하였을 때 Hoechst로 대조 염색을 시행하였고, TRITC의 형광물질을 부착한 S-100는 빨간색으로 발색되었다. FITC의 형광물질을 부착한 NSE와 NF 200은 초록색으로 발색되었다. Hoechst에 의해 염색된 세포 중에서 NSE나 NF 200으로 염색된 신경세포의 수는 2~3%에 불과하였다. NSE는 주로 신경세포의 핵과 세포질 및 신경섬유를 염색 시켰으며 S-100 항체에 의해서는 신경세포와 슈반세포를 포함한 주변세포들이 비교적 강하게 염색되었다(Fig. 2). NF 200을 이용한 이중염색으로도 NSE와 마찬가지로 신경세포에 특이적으로 반응하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3). 이에 반해 S-100로 염색된 세포의 수는 Hoechst에 의해 염색된 세포의 수보다는 수가 적지만 대부분을 차지하는 것을 확인할 수 있다.
   파라핀 포매조직과 배양세포를 이중면역형광염색을 시행 비교한 결과를 정리해 보면 NSE는 주로 나선신경절 세포의 핵과 핵주위부에 강하게 염색되고, 신경돌기에도 염색되었다. NF-160와 NF-200는 핵주위부와 신경돌기에서 염색되었고, S-100는 나선신경절 세포의 주변 슈반세포와 신경세포에 염색되어 졌다.
   이상으로 분리배양된 신경세포에서의 면역염색학적인 특징은 포매조직과 차이를 보이지 않았고, 신경세포를 확인하기 위하여는 neurofilament(NF 160, NF 200)과 NSE(neuron specific enolase)를 이용한 면역형광염색이 도움이 되었다.

고     찰

   나선신경절 세포를 분리하면 신경세포 뿐아니라 주변의 슈반세포와 섬유세포들이 함께 분리되므로 다른 세포군에서부터 신경세포만을 분리확인하는 것이 필요하다. 본 실험에서 분리된 세포들은 면역염색을 통하여 신경세포와 비신경세포로 구별이 가능하였다. 분리된 신경세포는 형태학적으로는 세포체와 세포체에서 양극성으로 섬유돌기가 자라는 것으로 확인할 수 있다. 또한 신경세포에 특이적으로 반응하는 neurofilament와 NSE 항체에 대한 염색을 통하여 확인할 수 있었다.
   Neurofilament에 대한 항체는 와우 조직에서 신경세포의 세포질과 신경돌기를 염색시키는 것으로 알려져 있다. 특히 200 kDa(NF 200), 160 kDa(NF160), 68 kDa(NF 68)로 알려진 neurofilament의 아형 중에서⁹⁾ 200 kDa의 NF 200은 포유류 와우에서 제 2 형 신경세포에 선택적으로 염색된다고 알려져 왔다. NF-160과 NF-200의 항체를 이용하여 파라핀 포매조직에서 염색을 시행하였을 때 나선신경절세포의 핵주위부와 신경섬유에 염색이 되는 것을 확인할 수 있었다. 배양된 세포에서도 마찬가지로 세포핵부위는 검게 염색되지 않는 것으로 보이고, 세포질과 신경섬유에만 염색이 되는 것을 알 수 있었다. NF-200는 세포의 인산화에 따라 염색의 차이를 보이며 일부의 나선 신경절세포를 선택적으로 염색시킨다고 알려져 있고, filament의 성분이 비교적 풍부한 제 2 형 신경원세포에 선택적으로 염색된다는 보고가 있으나¹⁰⁾¹¹⁾ 본 실험에서는 제 1 형과 제 2 형 신경원의 차이는 확인되지 않았다. 이러한 결과는 제 1 형 신경원으로 추정되는 세포내에 인산화의 posttranslational stage 이전 단계인 인산화되지 않은 subunit가 존재하기 때문이라 생각된다.
   NSE는 거의 모든 유형의 신경세포에서 존재하며 신경세포 성숙의 좋은 지표로 간주되고 있다. 발달 단계의 뇌조직에서 미성숙 신경세포들은 그들의 궁극적인 자리로 이주한 직후에 NSE 면역반응을 나타내게 된다.¹²⁾ 신경세포에서 NSE의 발현을 유도하는 기전은 확립되어 있지 않지만 NSE 발현과 시냅스 형성 사이에 밀접한 관련이 있을 것으로 제안되고 있다.¹³⁾¹⁴⁾ 나선 신경절에서는 제 1 형 신경원으로 생각되는 나선 신경절세포에서는 면역반응성을 나타냈고, 제 2 형 신경원으로 생각되는 세포에는 염색이 되지 않았다는 보고가 있지만 본 실험에서는 파라핀 포매조직과 배양된 세포 모두에서 신경세포의 핵과 수상돌기에 염색되는 양상을 보였다.
   S-100은 calcium-binding protein의 EF-hand family의 한 구성원으로서 포유류의 뇌조직에서 처음으로 분리가 되었으며 말초 및 중추 신경계에 국한되어 존재한다고 생각되어왔으나, 부신크롬친화성세포나 근육세포, 신경교세포, 신경원과 같은 특정한 세포 유형과 관련되어서 많은 종류의 조직에서 발견이 되고 있다.¹⁵⁾ 파라핀 포매조직과 분리배양세포 모두 면역조직화학염색, 면역세포화학염색, 이중면역형광염색 결과 신경세포 및 주변의 세포, 특히 슈반세포에 염색이 되는 것을 알 수 있었다.
   나선신경절 배양을 위해서는 분리된 신경세포의 수가 많을수록 좋다. 본 연구에서는 Hoechst로 염색된 세포중에서 신경세포체가 차지하는 비율이 2~3%에 불과하였다. 신경세포의 수를 높이기 위해서는 효소처리기법이나 기계적인 분리방법을 통하여 세포의 소실을 최소화하면서 분리된 세포에서 신경세포만을 순수분리하는 방법이 필요하다. 본 연구진은 면역자장분리법을 이용하여 분리된 나선신경절 신경세포의 순수도를 50%까지 올릴 수 있다고 보고한 바 있다.⁸⁾
   본 연구를 통해서 분리 배양된 나선신경절의 신경세포와 조직내의 신경세포가 동일한 성상을 가지고 있는 것을 확인되어 향후 이러한 실험모델을 통하여 신경성장인자에 의한 신경절세포의 생존 및 사멸에 대한 연구에 이용될 수 있을 것으로 기대한다.

결     론

   본 연구에서는 생 후 5~6일 된 흰쥐의 와우를 분리하여 얻은 조직과, 와우에서 나선신경절 세포를 분리하여 배양한 세포에서 NSE, NF-160, NF-200, S-100 등의 1차 항체를 이용하여 각각을 면역조직화학, 면역형광염색을 시행하였다. 사용한 1차 항체에 대한 염색양상의 변화는 와우 조직과 배양세포사이에서 차이를 보이지 않았고, 따라서 향후 진행될 나선신경절 세포와 신경성장인자들의 연구에 있어서 분리배양된 나선신경절 세포를 대상으로 한 연구방법은 와우 조직에서와의 같은 결과를 기대 할 수 있을 것이다. 이는 청각기관의 손상 후 재생이나 회복에 대한 기초적인 연구로서의 의의를 가지며, 신경 이과에서의 신경생물학적 연구와 분자생물학적 접근의 기초가 될 것으로 생각된다.

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