교신저자：정종우, 138-736 서울 송파구 풍납동 388-1  울산대학교 의과대학 서울아산병원 이비인후과학교실 
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서     론

   외유모세포의 특징적인 물리전기적인 신호전달은 부동섬모가 위치해 있는 첨부에서부터 시작되는데, 전기화학적인 신호는 기저부에 위치하고 있는 원심성 및 구심성 시냅스와 관련된다. 그리고 전기물리적인 신호전달은 세포의 외측 벽을 따라 발생하며 소리의 주파수에 따른 전기적인 세포의 운동성을 유발하는 역할을 한다.²⁾³⁾⁴⁾
   외유모세포의 운동성은 크게 빠른 운동성(fast motility)과 느린 운동성(slow motility)의 두 가지로 나누어진다.⁵⁾ 빠른 운동성은 소리의 파장이 와우로 전달됨과 동시에 외유모세포의 움직임이 일어나는 것을 의미한다. 이러한 빠른 수축과 연장은 시험관내에서 관찰할 수 있었고⁶⁾ 부동섬모(stereocilia)의 기계적인 이동만으로도 유발됨을 보고하였다.⁷⁾ 이러한 빠른 운동성은 Ca^2＋과 세포내 에너지의 함유량과는 무관하며 이들은 세포막전위의 변화에 의하여 유발된다.⁸⁾⁹⁾
   이에 반하여 느린 운동성은 일반적으로 자극 후 수 초간에 걸쳐서 서서히 생기는 움직임으로서 Ca^2＋과 무관한 수동적인 모양의 변화와 Ca2＋ 의존적인 운동성으로 구분될 수 있다. Ca^2＋ 의존적인 운동성으로는 ionomycin 등의 자극에 의한 세포내 Ca^2＋ 농도의 증가에 의하여 생기는 운동성이 있고, 수동적인 모양의 변화는 고농도의 K^＋의 첨가에 의한 삼투압 변화에 의하여 발생한다.¹⁰⁾ 이 밖에 기계적인 자극에 의한 운동성이 있으나 이는 아직 그 기전이 정확히 밝혀져 있지 않다. 이러한 운동성은 자극된 음신호의 증폭 및 조절을 담당할 것으로 여겨지고 있다.⁴⁾⁵⁾
   아세틸콜린은 원심성 섬유의 기본적인 신경전달물질이며 최근 코티기관에서 새로운 alpha-9 형의 아세틸콜린수용체가 clone되었으며, 이는 특히 외유모세포에 중점적으로 분포되어 있다.¹¹⁾ 일반적으로 원심성 자극은 와우의 음의 증폭 및 진행을 억제하는 것으로 여겨지고 있으나, 분리된 외유모세포에서 아세틸콜린은 막전압 고정법을 이용한 연구에서는 빠른 운동성의 증가를 나타내어 전기적 운동성의 크기를 증가시키는 상반된 결과가 보고되었다.⁴⁾¹²⁾ 이에 대해서는 자세한 기전이 아직 밝혀지지 않고 있다.⁵⁾
   전기적인 자극을 유지하지 않은 상태에서 아세틸콜린의 투여에 의한 외유모세포의 길이는 큰 변화가 없는 것으로 알려져 있다.¹³⁾ 이는 아세틸콜린을 통한 원심성 조절이 외유모세포의 느린 운동성을 유발하지 않음을 보여주고 있다. 그러나 원심성 신경전달물질로서 아세틸콜린이 외유모세포의 물리적인 조절을 담당할 가능성은 다른 여러 가지 경로로 가능하다.
   그러므로 본 연구에서는 유발된 느린 운동성에 대한 아세틸콜린의 영향을 알아보고자 시행하였다. 느린 운동성은 고농도의 KCl을 통한 삼투압의 변화와 ionomycin 투여를 통한 세포내 Ca^2＋ 농도의 증가로 유발하였다.

대상 및 방법

외유모세포의 분리
   백색 기니픽(200~250 gm)에 sodium pentobarbital(50 mg/kg)을 복강 내 주사하여 마취시킨 후 양측의 측두골을 얻었다. Hank's balanced salt solution (HBSS, 300 mOsm, pH 7.4) 용액 내에서 중이강을 열고 와우를 노출시킨 후 와우골포를 제거한 후 코티기관을 꺼내어 1 mg/ml의 collagenase IV (Sigma Chemical Co. St. Louise, MO, USA)로 10분간 처리한 후 Hamilton syringe로 흡인, 배출하여 외유모세포를 분리하였다. 분리된 외유모세포를 50 μl의 HBSS 용액이 포함된 35 mm 배양용기에 넣어 약 20분간 세포가 바닥에 붙도록 기다렸다. 분리된 세포 중 세포의 모양이 실린더 모양이고, 핵이 세포의 기저부에 위치하며, 세포의 첨부표면에 유모가 있는 것을 관찰하여 외유모세포임을 확인하였다(Fig. 1).

세포길이의 변화측정
   50 μl HBSS 용액에 50 μl의 150 mM KCl을 첨가한 후 시간에 따른 세포의 길이를 관찰하였다. 또한 최종농도가 10 μM이 되도록 0.5 mM의 ionomycin (Sigma Chemical Co.) 1 μl를 첨가한 후 시간에 따른 세포 길이의 변화를 관찰하였다. KCl은 느린 운동성을 충분히 나타내는 농도인 150 mM의 자극 (최종농도, 약 75 mM)을 이용하였으며, ionomycin도 이미 느린 운동성의 유발농도로 알려져 있는 농도를 사용하였다.
   외유모세포를 도립현미경 (Leitz fluovert fluoroscope)과 이에 부착된 CCD camera를 이용하여 실시간으로 촬영하였고, 이 영상을 Workbench 2.1 software (Axon Instrument Inc, Foster City, CA, USA)를 이용하여 분석하여 세포길이의 변화를 측정하였다.

Acetylcholine의 영향관찰
   Carbamylcholine Cl (Sigma Chemical Co.) 1 mM의 HBSS 용액이 있는 용기에 외유모세포를 넣고 바닥에 부착되도록 한 후 약 20분 후 KCl 용액과 ionomycin을 추가하여 세포의 길이의 변화를 관찰하였다. Carbamyl choline의 영향을 보기 위하여 대조군으로 choline Cl (Sigma Chemical Co.) 1 mM의 HBSS 용액을 이용하였다. 1 mM의 carbamylcholine의 삼투압은 외유모세포의 느린 운동성을 일으키지 않는 농도인 302 mOsm이었다.

통계처리
   다중비교와 Bonferroni correction은 SAS Ver 6.12 (SAS Institute, Inc)를 이용하여 실시하였으며 통계적인 의미는 p<0.05를 기준으로 하였다.

결     과

고농도의 KCl 주입에 따른 외유모세포의 길이변화
   50 μl HBSS 용액에 50 μl의 150 mM KCl을 첨가한 후 시간에 따른 세포의 길이를 관찰한 결과 시간이 지날수록 외유모세포의 길이가 점점 감소하고 넓이는 증가하는 현상을 보였다(Fig. 2). 150 mM의 KCl의 투여 후 약 5분 후에 투여 전에 비하여 약 10%정도 길이가 감소하였다. 대조군으로 HBSS를 통량 투여한 군에서는 5분후 약 2%의 길이변화가 관찰되었으며 이는 투여 전에 비하여 통계적인 의의가 없었다.

Carbamylcholine 주입에 따른 외유모세포 길이변화의 영향
   분리된 외유모세포에 아무것도 첨가하지 않은 군과 HBSS 50 μl를 첨가한 군, 그리고 1 mM의 carbamylcholine Cl을 주입한 군에서는 투여 후 5분까지 별다른 세포의 길이변화를 보이지 않았다.
   이후 150 mM의 KCl을 투여한 결과를 보면, 각 군을 HBSS에 KCl을 투여한 군, 1 mM의 carbamylcholine Cl를 20분간 전처치한 후 KCl을 투여한 군, 대조군으로 choline Cl 1 mM을 20분간 전처치한 후 KCl을 투여한 군으로 나누었다. KCl 투여 후 약 5분 후에 세 군 모두 유의한 길이의 변화가 관찰되었으나, 세군 간에는 통계학적으로 유의한 차이는 보이지 않았다(Fig. 3).

Ca^2＋ 농도의 증가에 따른 외유모세포의 길이변화 및 carbamylcholine 전처치에 따른 영향
   Ionomycin 10 μM을 첨가하여 외유모세포의 길이가 시간이 지날수록 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 1 mM의 carbamylcholine Cl가 포함된 HBSS 용액에서도 10 μM의 ionomycin 투여 후 세포의 길이가 증가하였고 두 군간에는 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다. 세포의 너비는 ionomycin에 의하여 변화되지 않았다(Fig. 4).

고     찰

   본 연구의 결과 고농도의 KCl과 ionomycin에 의하여 외유모세포길이의 변화를 관찰할 수 있었다. 고농도의 KCl에 의해서는 세포의 길이의 수축을 볼 수 있었는데, 이는 기존의 연구자들과 같은 결과이다. 고농도의 KCl에 의한 길이의 변화는 세포막의 탈분극에 의해 유발되며 이는 낮은 삼투압농도의 용액에서도 동일하게 유발되어 세포의 수축이라기 보다는 세포내의 삼투압농도의 변화에 의한 수동적인 변화일 것으로 알려져 있다.¹⁴⁾
   Ionomycin을 이용하여 세포 내 Ca^2＋ 농도를 증가시켰을 때 외유모세포의 길이가 증가됨을 관찰할 수 있었는데, 이는 Ca^2＋/calmodulin에 의존적인 과정으로 알려져 있다. 즉, Ca^2＋/calmodulin-dependent protein kinase의 차단제에 의하여 외유모세포의 운동성과 단백질의 인산화과정이 모두 차단되는 현상이 보고되어 이러한 과정을 뒷받침하고 있다.¹⁵⁾ 외유모세포의 운동성 중 하나인 느린 운동성은 위의 2가지 자극을 통하여 유발되는 것으로 알려져 있다. 이외에도 물리적인 자극을 이용한 stretch-induced 운동성도 보고되었으나,¹⁶⁾ 아직 Ca^2＋과의 관계가 밝혀지지 않았다.
   본 연구를 통하여 아세틸콜린의 non-hydrolyzable derivative인 carbamyl choline은 탈분극에 의한 수동적인 느린 운동성이나, 세포내 Ca^2＋ 증가에 의한 외유모세포의 느린 운동성에 영향을 미치지 않는 것을 알 수 있었다. 아세틸콜린은 외유모세포의 신경접합부위에 존재하는 원심성 신경섬유의 신경 전달물질로서 외유모세포에 대한 조절작용을 할 것으로 여겨지고 있다. 외유모세포의 빠른 운동성은 아세틸콜린에 의하여 변화되며 이는 적은 신호를 많이 증폭시키는 쪽으로 작용한다.⁴⁾ 아세틸콜린에 의해 활성화된 외유모세포의 니코틴성 수용체는 이온 친화성 수용체를 통해 급격한 칼슘의 유입을 일으키며, 뒤이어 Ca^2＋ 의존성 K^＋ 채널을 통하여 대량의 K^＋ 전류의 유출이 일어나게 되는 현상이 보고된 바 있다.¹⁷⁾ 이를 통하여 아세틸콜린이 청각신호의 증폭조절작용에 관여할 것으로 추정되고 있다.
   느린 운동성에 대한 아세틸콜린의 역할에 대해서는 아세틸콜린이 세포의 신경접합부위에 작용하여 비특이성 리간드 의존성 양이온통로를 통해 세포 내 Ca^2＋ 농도를 증가시키므로 Ca^2＋과 calmodulin을 통한 느린 운동성의 기전에 영향을 미칠 수 있을 것으로 생각되었다.¹⁸⁾ 그러나 아세틸콜린의 느린 운동성에 대한 보고는 아직 없으며, 세포의 정지상태에서 아세틸콜린을 투여하였을 때 길이의 변화가 없거나 0.3 μm 이하일 것으로 보고되었다.¹³⁾ 본 연구에서는 이미 알려져 있는 느린 운동성 유발자극이 아세틸콜린에 의하여 어떻게 변화하는지를 관찰하였는데, 아세틸콜린의 투여에 의하여 영향을 받지 않았다. 이는 원심성 신경섬유에 분포하는 아세틸콜린이 외유모세포의 느린 운동성 이외의 다른 조절기전을 통하여 외유모세포를 조절할 가능성을 보여주고 있다. 이는 아세틸콜린이 외유모세포의 Ca^2＋ 농도의 증가를 약간 유발하긴 하지만 세포막의 탈분극에 의한 Ca^2＋의 유입현상에는 영향을 미치지 않는다는 보고¹⁾와 유사한 결과라 할 수 있다. 또한 아세틸콜린에 의해 유발되는 K^＋ 전류의 활성화가 외유모세포의 내외에 분포하는 Ca^2＋과 Mg^2＋의 비율에 영향을 받는다는 보고¹⁹⁾²⁰⁾가 있어 이의 영향에 의한 결과의 가능성을 생각해 볼 수 있었다.
   사용한 아세틸콜린의 농도는 302 mOsm의 삼투압을 보였는데, 농도가 높아지면 삼투압도 같이 높아지므로 이는 삼투압에 의한 영향을 통해 느린 운동성이 나타날 가능성이 높다.¹³⁾
   본 연구의 결과해석에는 KCl과 ionomycin에 의해 유발되는 자극의 크기가 워낙 크기 때문에 아세틸콜린의 영향이 크지 않을 가능성도 배제할 수는 없다. 또한 아세틸콜린에 의해 세포내의 Ca^2＋이 증가하는 기전과 ionomycin에 의해 Ca^2＋이 증가하는 기전이 서로 다른 가능성도 생각해 볼 수 있으며 이는 좀더 연구가 필요한 점이라고 생각된다.

결     론

   본 연구에서 아세틸콜린의 non-hydrolyzable derivative인 carbamyl choline은 외유모세포의 느린 운동성을 유발하지 않으며, 고농도의 KCl 용액에 의한 수동적인 삼투압의 변화와 세포 내 Ca^2＋ 증가에 의한 Ca^2＋ 의존적인 능동적인 운동성에 대해서도 영향을 미치지 못하였다.

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