교신저자：김선태, 405-760 인천광역시 남동구 구월1동 1198  가천의과대학 이비인후-두경부외과학교실
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서     론

   만성 부비동염에서 알레르기 진균성 부비동염(allergic fungal sinusitis)이 얼마나 존재하는지는 아직 정확히 알려진 바가 없으며, 진균의 역할에 대해서도 많은 논란이 있어왔다.^1)2)3)4) 일반적인 만성 부비동염 환자에서 알레르기 진균성 부비동염(allergic fungal sinusitis)이 동반된 경우는 6%에서 93%로 다양하게 보고되고 있다.⁵⁾⁶⁾
   알레르기 진균성 부비동염의 진단은 비용 및 만성 부비동염이 있으면서, 알레르기성 점액(allergic mucin)에서 호산구나 호산구 산물인 Charcot-Leyden Crystals과 진균이나 균사 등을 확인 할 수 있어야 한다. 그러나 알레르기성 점액에서 기존의 진균 배양방식이나, 조직학적 검사상 균사를 발견하기가 어렵기 때문에 알레르기 진균성 부비동염의 진단율이 다양하며 저평가되는 경향이 있었다. Ponikau 등⁵⁾은 비강세척을 이용하여 만성 부비동염 환자와 정상인에서 각각 96%와 100%의 진균을 배양하였다고 보고하였다. 그러나 배양을 하기 위해서는 약 30일간의 오랜 기간이 필요한 단점이 있었다.⁶⁾
   이에 저자들은 기존의 배양방식에 비교하여 진균 검출에 대한 민감도와 정확도를 높이고 보다 쉽게 사용할 수 있는 방식을 찾고자 중합효소 연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)을 이용하여 진균검출을 시도하였다. 또한 정상인과 만성 부비동염 환자에서 존재하는 진균의 빈도와 종류를 비교하고자 하였다.

대상 및 방법

대  상
   2000년 8월부터 2001년 6월까지 본원에 내원하여 만성 부비동염 및 비용으로 진단된 82명의 환자(남자 42명, 여자 42명, 연령 18~50세)를 대상으로 하였다. 알레르기 피부반응검사와 RAST상 음성이었으며, 최근 1개월간 약물 복용력이 없는 환자로 컴퓨터 단층촬영과 비내시경 검사상 비용을 동반한 만성 부비동염 환자였다. 정상 대조군으로는 단순 방사선과 비내시경 소견상 정상이며 최근 3개월간 비염증 증상을 호소하지 않았던 40명(남자 19명, 여자 21명, 연령 20~55세)을 대상으로 하였다.

방  법

비세척액
   1% phenylephrine hydrochloride를 양측 비강 내로 분무시켜 비점막을 수축시킨 후 환자로 하여금 흡기 후 숨을 참게 한 후, 양측 비강 내로 각각 10 ml의 멸균 증류수를 주입하였다. 비강내 콧물(mucus) 등의 내용물이 나오도록 주입된 증류수를 환자로 하여금 호기시 강하게 분출하게 하여 비강 내를 세척한 증류수를 멸균된 용기에 모아 진균배양과 PCR을 위해 각각 10 ml씩 채취하였다.

진균배양
   채취된 10 ml의 세척액을 3000 rpm에서 10분 동안 원침한 후 침사층으로 진균배양을 시행하였다. 오염된 세균의 성장을 억제하기 위해 chloramphenicol이 첨가된 sabouraud dextrose agar를 기본 배지로 사용하였으며, 실온에서 4주 동안 배양하였다. 배지는 매일 관찰하였으며 만약 진균 집락이 관찰된 경우에는 현미경 소견 및 기타 생화학적 검사를 시행하여 균을 동정하였다.

중합효소 연쇄반응(PCR)
   채취된 10 ml의 세척액으로 PCR을 시행하였다. 진균 유전자의 DNA 추출을 위해 비강 내에서 채취된 검체를 3000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 침전물을 -20°C 냉동고에 보관하여 사용하였다. DNA의 추출은 침전물과 동량의 2X lysis buffer를 넣고 68°C 항온수조에서 3시간 동안 반응시킨 다음 3000 rpm에서 10분간 원심분리 하였다. 상층액을 취하여 phenol/chloroform/isoamylalcohol(25：24：1)과 chloroform/isoamylalcohol(24：1) 처리과정을 순차적으로 1회씩 처리한 후, 3000 rpm에서 30분간 원심 분리하여 상층액을 반복하여 취하였다. 이 상층액에 동량의 isopropanol을 첨가하여 12시간 이상 -20°C 냉동고에 보관하였고 보관된 상층액을 3000 rpm에서 30분간 원심분리하여 DNA를 침전시켰다. 침전된 DNA를 70% ethanol 1 ml를 넣고 세척한 다음 원심분리하여 만든 침전물을 증류수 50 μl에 녹인 후 흡광광도계를 이용하여 흡광도를 측정하여 DNA의 농도를 정량하였다.
   추출된 진균 유전자의 DNA을 이용하여 진균의 유전자 발현을 보기 위해 PCR을 실시하였다. 1~5 μl DNA에 10×PCR reaction buffer, 2.5 mM dNTPs, panfungal gene과 7개의 빈번한 진균인 Candida albicans, Penicillium, Aspergillus fumigatus, Aspergillus versicolor, Alternaria, Fusarium, Cladosporium 등의 유전자⁵⁾ sense와 antisense primer(Table 1), Taq DNA polymerase, 증류수 등을 넣어 중합효소 연쇄반응에 이용하였다. 중합효소 연쇄반응은 Gene Amp PCR system 2400(Perkin Elmer, USA)에서 94°C에서 5분간 변성 시킨 후 94°C에서 35초, gene에 따라 52~57°C에서 30초, 72°C에서 30초 주기로 약 35회 증폭한 후 최종 72°C에서 약 5분간 반응을 연장시켰다. 음성 대조군으로는 DNA대신 증류수와 반응액을 혼합한 것을 사용하였다. 최종 PCR 산물을 1.5% agarose gel에서 전기영동을 한 후 ethidium bromide용액으로 30분간 염색하여 확인하였다. 총 DNA의 파괴여부 및 상대적 정량비를 구하기 위하여 대조군으로 panfungal gene과 7개의 빈번한 진균의 유전자를 사용하여 각각의 중합효소반응 띠의 밝기를 농도분석기(Image analyser, Bio-Profile, Viber Lourant, France)를 사용하여 비교하였다.

결     과

   PCR 결과는 82명의 만성 부비동염 환자의 panfungal gene에서는 92.5%로 높은 검출율을 보였고, 7종의 진균 유전자에서는 51.2%의 검출율을 보였으며 그 중 Aspergillus versicolor가 30.4%로 높은 검출율을 보였다. 40명의 정상 대조군의 panfungal gene에서는 97.5%로 높은 검출율을 보였으나, 7종의 진균 유전자에서는 20%의 검출율로 그 중 Candida albicans가 20.7%로 검출되었다(Fig. 1). 검출된 진균의 PCR 소견은 panfungal gene과 Candida albicans에서는 정상 대조군과 부비동염 환자에서 발현의 증가가 관찰되나 Aspergillus versicolor, Penicillium 그리고 Aspergillus fumigatus에서는 정상 대조군에서는 발현되지 않고 부비동염에서는 발현의 증가를 관찰 할 수 있었다(Fig. 2). 82명의 만성 부비동염 환자와 36명의 정상 대조군에서의 진균 배양상 부비동염에서는 총 23.2%가 검출되었으며, 그 중 Candida albicans가 가장 많이 검출되었고, 정상 대조군에서는 총 30.5%로 Aspergillus가 가장 많이 검출되었다(Fig. 3). 이는 같은 군으로 시행한 PCR에 비해 진균 검츌율이 상대적으로 낮음을 보이고 있다. 배양을 통해 검출된 진균은 Candida albicans, Penicillium, Aspergillus fumigatus, Aspergillus versicolor, Aspergillus niger, Alternaria, Fusarium, Cladosporium이었다. 82명의 만성 부비동염 환자에서 PCR과 배양결과를 비교하면 PCR에서는 Aspergillus가, 배양에서는 Candida albicans가 높은 검출율을 보였고 PCR에 비해 진균배양에서 검출율이 낮았다(Figs. 1 and 3).

고     찰

   진균은 구강과 비강내에 정상 상재균으로 존재하는 것으로 알려져 있다. 임상적으로는 비강의 면봉 도말법을 이용하여 얻은 검체로는 진균을 배양하기가 어려워 조직을 얻어 배양하는 방법이 사용되어 왔다.¹⁵⁾¹⁶⁾ Ponikau 등⁹⁾에 의하면 만성 부비동염환자와 정상인에서 비강 세척을 이용한 진균배양 결과 정상인의 100%에서 진균이 검출되었고 만성 부비동염환자와 정상인과의 진균 검출율에는 유의한 차이가 없었다. 그리고 만성 부비동염환자의 93%에서 알레르기 진균성 부비동염의 소견을 보여 알레르기 진균성 부비동염의 유병률이 상당히 높다고 주장하였다.⁵⁾ 그러나 정상 대조군에서도 진균이 100% 검출되어 만성 부비동염환자에서 검출된 진균이 병원균으로 작용했다고 볼 수는 없었다. PCR은 목적으로 하는 DNA를 수 십만배 증폭시켜 감염성 인자의 검출에민감하게 반응을 보일 수 있어 각종 유전병의 진단 및 검색등에 사용되며 바이러스성 질환 및 병원균의 증명에 사용되어져 왔다.¹⁷⁾ 비강과 폐에서 병원균을 검출하는데 PCR을 많이 이용되었는데⁷⁾⁹⁾ 최근에 panfungal gene과 Candida, Aspergillus 등에 대한 PCR은 진균의 검출에 민감도와 신뢰도가 높은 방법으로 알려져 있다.^{8)9)10)11)12)13)14)} 그러므로 알레르기 진균성 부비동염에서 PCR은 임상적 증상의 정도가 심할수록 진균의 검출이 잘 될 것으로 생각된다.
   본 연구에서는 PCR에서 panfungal gene을 이용한 경우 만성 부비동염환자와 정상 대조군에서 92.5%와 97.5%로 높은 검출율을 보인 반면, 7개의 빈번한 진균 유전자를 이용한 경우 총 검출율이 51.2%와 20.0%로 현저히 낮아 7개의 진균만으로 시행한 PCR 결과가 전체를 대표 할 수 없고, 진균배양 상에서도 두 군에서의 총 검출율이 23.3%와 30.5%로 panfungal gene에 대한 PCR에 비해 현저히 낮아 배양으로 얻어진 진균의 종류 및 빈도는 전체를 대표한다고 볼 수 없었다(Figs. 1 and 3). PCR이 진균의 검출에 탁월함을 보여 추후 진균의 검출에 진균배양법 보다는 PCR을 이용하여 보다 정확하고 민감한 방법으로 시간을 단축시킬 수 있을 것이다. 본 연구의 결과로 만성 부비동염에서 발견된 진균이 병원균으로 작용했다고 볼 수는 없는데 이는 만성 부비동염과 정상 대조군에서 검출된 진균의 비율이 차이가 없으며 오히려 정상 대조군에서 높게 검출되었기 때문이다. 추후 보다 광범위한 진균들로 부비동염과 정상인에서의 검출된 종류를 비교하여 부비동염에서 보다 많이 검출되는 진균류가 있는지 또한 이 진균류들이 실제로 부비동염을 일으키는지에 대한 계속적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.

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