교신저자：왕수건, 602-739 부산광역시 서구 아미동 1가  부산대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   고도의 산업발달에 따른 교통사고의 빈발에 의해 사람의 신체에 심한 타격을 주는 예가 늘어나므로 장애의 치유와 재활에 대한 관심은 물론 장기이식이 널리 시행되어 이에 대한 외과의들의 관심은 더욱 급증하는 추세이다. 이와같이 외상의 치유는 물론 이식장기의 기능회복을 위해선 혈관 및 신경문합은 절대적인 과정이다.
   이비인후과 영역에서도 후두 및 기관의 외상에 의해 손상된 후두기능의 회복과 후두이식에 있어서도 혈관문합과 함께 신경재지배는 그 첫째의 과제이다.
   후두 및 기관의 외상에 대한 기능회복 수술과 후두이식에서 신경문합에 널리 이용되고 있는 신경은 미주신경(vagus nerve), 횡격신경(phrenic nerve) 및 설하신경고리(ansa hypoglossi) 등이다. 이와같은 신경의 재지배과정을 연구하는 데 있어서 용이한 방법중 하나는 골격근의 지배신경을 절단하고 이웃하는 다른 신경을 이용하여 절단신경이 지배하는 골격근의 기능을 판정하는 방법이다.
   신경재지배(reinnervation)의 가장 신빙성이 있는 평가 방법은 전기자극을 주어 직접 근육의 수축을 관찰하는 것과 horseradish peroxidase(HRP)를 이용한 척수 및 뇌간에 표식된 신경세포의 검사(axonal transport study using HRP)이다.¹⁾ 그외 직접 자발적인 움직임을 관찰하든지, 조직화학적검사를 통하여 근육세포의 변화와 운동신경종판(motor end-plate) 및 축삭(axon)을 측정하는 것도 도움이 된다.
   저자는 성대마비환자의 치료 및 후두이식을 위한 기초적인 자료를 제공할 목적으로 백서를 이용하여 신경문합 또는 이식방법별 골격근의 신경재지배 양상을 관찰하였다. 실험동물의 비복근(gastrocnemius muscle)을 지배하는 경골신경(tibial nerve)을 절단하고 1개월후 비골신경(peroneal nerve)이 지배하는 전경골근(anterior tibial muscle)의 일부를 포함하는 신경근육변을 크기와 고정방법을 달리하여 비복근에 이식하였고, 그외 비골신경을 절단된 경골신경의 원위부에 직접 문합(direct anastomosis) 혹은 비복근내에 비골신경을 이식한 후 근전도검사(elcectromyography), 근수축력검사와 근섬유, 운동신경종판에 대한 조직화학적 검사를 시행하여 문합 또는 이식 방법별 효과를 평가하였다.

재료 및 방법

대  상
   실험동물은 200 gm 내외의 백서(Sprague-Dawley rat)암컷 40마리를 이용하였으며 실험기간 동안 일정한 조건하에서 동일한 사료로 사육하였다.

실험방법
   실험동물은 sodium pentobarbital(Nembutal^®)을 체중 kg당 20 mg씩 복강내로 주입하여 마취하였고 1차수술은 복와위 자세로 고정시킨 후 우측 대퇴부의 털을 제거하고 포비돈 용액으로 소독 후 대퇴부의 슬관절 상방, 대퇴부 후방에 2 cm 가량의 절개를 가하고 좌골신경(sciatic nerve), 경골신경(tibial nerve), 비골신경(peroneal nerve)을 노출시키고, 비복근을 신경지배하는 경골신경을 약 5 mm정도 절단하여 양 절단부를 결찰한 후 근위부를 대퇴부(femoral muscle)에 매몰시켜 신경의 자연재생(spontaneous regeneration)을 방지하고 피부를 봉합하였다. 2차수술은 1차수술 4주 후에 재마취한 후 근전도검사(electromyography)를 시행하여 경골신경의 신경차단(denervation)을 비복근에서 확인하고 비골신경을 이용하여 비복근의 신경재지배를 시도하였다. 10배로 확대한 현미경을 이용하여 각 군에 맞추어 시술하였으며, 신경문합은 ethilone 10-0봉합사를 사용하였다.
   40마리의 실험동물에서 뒷다리를 좌우 측으로 나누어 8개의 군으로 나누고, 각 군마다 5마리씩 우측다리를 이용하여 실험하였고 반대측 다리는 정상대조군으로 수술하지 않았다. 제 1 군은 전경골근으로 가는 비골신경 분지를 이용한 2×2 mm 크기의 신경근육변(nerve-muscle pedicle)을 만들어 이를 근외막(epimysium)을 2×2 mm 제거한 비복근에 봉합하였다(Fig. 1). 제 2 군은 전경골근으로 가는 비골신경분지를 이용한 4×4 mm 크기의 신경근육변을 만들어 이를 비복근의 근외막을 4×4 mm 제거한 후 비복근에 봉합하였다(Fig. 2). 제 3 군은 전경골근으로 가는 비골신경 분지를 이용한 2×2 mm 크기의 신경근육변을 만들어 이를 비복근의 근외막 및 근육을 2×2 mm 크기의 신경근육변을 만들어 이를 비복근의 근외막 및 근육을 2×2 mm 제거한 후 비복근에 봉합하였다(Fig. 3). 제 4 군은 전경골근으로 가는 비골신경 분지를 이용한 4×4 mm 크기의 신경근육변을 만들어 이를 비복근의 근외막 및 근육을 4×4 mm 제거한 후 비복근에 봉합하였다(Fig. 4). 제 5군은 전경골근으로 가는 비골신경 분지를 이용한 2×2 mm 크기의 신경근육변을 만들어 비복근의 근외막을 절개하고 비복근속에 삽입한 후 신경근육변이 이탈하지 않도록 고정하였다(Fig. 5). 제 6 군은 비골신경을 비복근의 근외막을 절개하고 비복근속에 삽입한 후 신경이 이탈하지 않도록 고정하였다(Fig. 6). 제 7 군은 비골신경을 절단한 원위부 경골신경에 단단문합(end-to-end anastomosis)하였다(Fig. 7). 그외 신경절단군(denervated control group)으로 신경재지배가 없는 경우 조직변화를 관찰하기 위해, 경골신경을 절단하고 자연재생을 방지할 목적으로 절단된 경골신경의 근위부를 대퇴근에 매몰시킨 후 고정하였다.
   3차수술은 2차수술 5개월 후 신경재생의 결과를 보기위하여 근전도 검사와 PhysioLab®을 이용하여 근수축력 검사를 시행한 후, 비복근의 조직학적 검사를 위해 절제하였다(Fig. 8).

근전도검사
   수술 후 탈신경의 확인과 신경재생의 신경생리학적 추적을 위하여 근전도기(Dantec Counterpoint, MK2)를 사용하였다. 근전도검사를 위해 근전도기의 주파수대를 10-2 KHz, 시간단위를 10 msec/div, 그리고 민감도를 100 μV로 지정하였으며, 신경전도검사는 10-2 KHz의 주파수대와 시간단위를 1 msec/div, 민감도를 1~5 mV로 하였다. 탈신경은 근전도 검사에서 해당 근육의 자발전위, 즉 세동전위(fibrillation potential)와 양성예각전위(positive sharp wave)의 발현과 신경전도검사에서 복합 근활동전위(compound muscle action potential)의 소실로 확인하였다. 근전도 검사는 접지전극을 동측의 발바닥에 부착하고, 구심침전극을 좌골절(sciatic notch)에 삽입 후 전기자극하여, 전경골근과 비복근의 외측두에서 구심침전극을 사용하여 복합 근활동전위가 기록되는 자극강도의 약 25% 이상의 초최대자극을 가하였다. 이때 전기자극의 지속시간은 0.2 msec이었으며 가한 초최대자극강도는 8~12 mA이었다. 복합 근활동전위는 근활동전위는 기록전극이 삽입된 근육내에서 구심침전극을 약간씩 움직이면서 주어진 자극강도에서 반복 자극하여 최소 10회 이상의 복합 근활동전위를 기록하여 이중 진폭이 최대인 복합 근활동전위의 진폭을 자료로 사용하였다(Fig. 9). 통계적 처리를 위하여 nonparametric Mann-Whitney 검정을 이용하였고 p 값이 0.05이하인 경우를 통계학적 유의성이 있는 것으로 판정하였다.

근수축력 검사
   마취상태에서 비복근(gastrocnemius muscle)을 박리하고 윈위부의 건(tendon)을 분리하여 봉합사(Vicryl 4-0)로 결찰 후 force transducer(SG-10, PhysioLab^®)에 연결하였다. 이때 건의 loop는 형성하지 않았다. 하지를 고정하기 위하여 stainless steel 철사로 슬관절 부위를 바닥에 고정시키고 신경전기자극 후 수축력의 변화를 기록하였다. 실험에 앞서 근육과 신경의 건조를 방지하기 위하여 광유(mineral oil)를 조직에 뿌렸다.
   분포하는 신경을 통하여 근육을 수축시키기 위하여 sup-ramaximal nerve stimuli(square pulses, 2 ms pulse duration, 5 V)로 300 ms동안 자극하였다. 전기자극발생에 장비는 Grass S88 Stimulator^®(Grass Instrument Co., Quincy, MA)를 사용하였다(Fig. 10). 전기자극은 bipolar 타입의 silver wire hook electrode를 이용하였다. 근건접합부에서 근수축력은 force transducer를 통하여 PhysioLab^®에 연결하였다(Fig. 11). 이때 건의 loop는 형성하지 않았다. 하지를 P 800(Sarotech, Seoul)을 이용하여 기록하였으며 분석에서 이용하였다.
   골격근의 길이-장력 곡선을 구하기 위하여 연축(twitch) 발생은 square wave로 2 ms, 5 V를 가하여 측정하였으며 근육의 길이를 변화시켜 최대장력이 발생하는 근육의 길이(L₀)를 결정하였다. 각 조건에서 신경전기 자극에 따른 근수축력의 크기는 L₀ 상태에서 기록하였으며, 근수축력은 g로 표시하였다(Fig. 12)(1 g＝9.8 mN).
   통계적 검증은 근전도검사에서 시행한 방법과 동일한 방법을 사용하였다.

근섬유 및 신경의 조직학적 검사

비복근 및 운동신경종판(Motor endplate)의 염색
   3차수술시 전기생리학적 검사를 실시한 후 Nembutal®을 체중 kg당 75 mg씩 복강내로 주입하여 실험동물을 희생시켰다. 희생 즉시 각 동물에서 비복근을 떼어낸 후 즉시 근육조직을 -160~-170C로 냉각된 isipentane에 넣어 급속 동결시켰다. 동결 근육조직 중 일부를 냉동절편기(-20C)를 이용하여 먼저 종단면과 횡단면으로 5~8 μm 두께의 연속절편을 각각 취해서 hematoxylin-eosin(H-E)염색과 NADH-tetrazolium reductase(NADH-TR) 및 pH 9.4 adenosine triphosphatase(ATPase) 효소조직화학 염색을 실시하여 근육의 형태학적 변화와 근섬유의 유형 변화를 각각 관찰하였다. 각 실험군의 형태학적 소견은 봉합부 안쪽 1 mm 지점에서의 근육조직의 변화를 관찰하였다. 나머지 동결 근육조직에서는 종단면과 횡단면으로 500 μm 두께의 절편을 각각 취해서 근육에서의 운동신경종판의 수적변화를 관찰하기 위하여 combined silver acetylcho-linesterase 염색을 실시하였다. 각 군에서 근섬유의 형태학적 크기 변화의 객관적 계측은 화상분석기(image analyser)를 이용하여 측정을 시도하였으나, 염색된 근육조직에서 근섬유들의 방향성이 일정하지 않아 의미있는 결과를 얻기가 힘들었다.

운동신경종판의 계수
   Combined silver-acetylcholinesterase 염색에 의해 근섬유의 내군막(endomysium)쪽에서 짙은 녹색으로 관찰되는 것을 운동신경종판으로 인정하였다. 조직슬라이드의 관찰시 40배 배율에서 운동신경종판이 밀집된 부위를 먼저 선택한 후 5개의 100배 시야에서 운동신경종판을 계수하여 100배 시야에서의 평균치를 결정하였다(Fig. 13).

결     과

전기생리학적 검사
   전기생리학적 검사를 시행한 40마리의 대상에서 정상대조군은 복합 근활동전위의 평균 진폭은 20.43±2.42 mV였으며, 제 7 군 13.98±1.47 mV, 제 3 군 12.10±6.34 mV, 제 4 군 9.53±1.88 mV, 제 5 군 9.19±4.30 mV, 제 6 군 8.44±3.11 mV, 제 1 군 6.99±2.98 mV, 제 2 군 5.95±2.90 mV의 순이었다(Table 1). Nonparametric Mann-Whitney test를 이용한 분석에서 제 7 군은 제 1 군, 제 2 군 그리고 제 6 군에 비해 통계적으로 유의한 차이를 보였다(p<0.05). 그러나 제 3 군, 제 4 군, 제 5 군과는 통계적으로 유의하지 않았다(p>0.05). 제 1 군에서 제 7 군까지 이식한 신경을 절단한 결과 전례에서 활동전위는 사라졌다(Table 1).

근수축력 검사
   검사상 각 군의 시간대별로 나타난 평균 근수축력은 Table 1과 Fig. 7과 같다. 정상대조군은 평균 근수축력이 468±84.00 mN이었으며 제 7 군 322±53.07 mV, 제 3 군 262±43.54 mV, 제 4 군 198±47.50 mV, 제 5 군 194±44.09 mV, 제 6 군 182±38.69 mV, 제 1 군 182±44.45 mV, 제 2 군 110±31.62 mV의 순이었다(Table 2) Nonparametric Mann-Whitney test를 이용한 분석에서 제 7 군은 제 1 군, 제 2 군, 제 4 군, 제 5 군 그리고 제 6 군에 비해 통계적으로 유의한 차이를 보였다(p<0.05). 그러나 제 3 군과는 통계적으로 유의하지 않았다(p>0.05).

비복근의 조직학적 소견
   정상대조군의 근육 조직소견에서 각각의 근섬유들은 일정한 다각형 형태를 취하고 있었으며(Fig. 14), ATPase(pH 9.4)염색과 NADH-TR염색상 1형과 2형 근섬유들이 서양 바둑판 모양(checkboard)을 연상시키는 모자익배열로 각 근섬유속을 구성하고 있었다. 신경절단만 시행한 경우에는 근섬유의 위축이 현저하였고, 지방조직의 증식과 섬유화 소견이 관찰되었으며 angular fiber도 관찰되었다(Fig. 15).
   제 1 군에서 H-E염색상 근섬유의 대부분은 대조군과 유사한 다각형의 형태를 취하지만, 부분적으로 작은 위축성 섬유들이 산발적으로, 그리고 작은 군집을 이루고 일부 근섬유들은 섬유의 중앙에 핵이 위치하는 내부 핵(internal nuclei)의 소견이 관찰되었으며 섬유조직이나 지방조직의 증식은 드물었다. ATPase(pH 9.4)와 NADH-TR염색에서 근섬유들은 신경재지배를 나타내는 유형별 군집(type grouping) 양상으로 배열되었고, 산발적으로 관찰된 위축성 근섬유들은 NADH-TR 염색에서 근섬유들은 신경재지배를 나타내는 유형별 군집(type grouping) 양상으로 배열되었고, 균일한 짙은 염색상을 보였다(Fig. 16).
   제 2 군에서 H-E 염색상 근섬유는 제 1군과 비교하여 위축성 섬유들의 출현이 증가되고, 이들은 훨씬 큰 군집들로 관찰되었으나 핵의 출현 정도는 비슷하였다. ATPase(pH 9.4)와 NADH-TR 염색상에서 근섬유들은 재신경화를 암시하는 유형별 군집이 관찰되었지만, 제 1 군에 비해서 약하게 나타났다(Fig. 17).
   제 3 군에서 H-E 염색상은 제 1 군과 비슷한 정도로 관찰되었으며 ATPase(pH 9.4)와 NADH-TR 염색에서 유형별 군집이 부분적으로 다소 관찰되었고, 작은 크기로 관찰되었다. 섬유조직에서 지방조직의 증식은 제 1 군보다도 훨씬 적게 관찰되었다(Fig. 18).
   제 4 군은 H-E 염색상 근섬유의 위축이 현저하였고, 섬유조직이나 지방조직의 증식도 제 3 군보다 현저하였으며, ATPase(pH 9.4)와 NADH-TR 염색에서 유형별 군집 현상이 다소 관찰되었다(Fig. 19).
   제 5 군은 H-E 염색상 근섬유의 위축이 현저하였고, 내부 핵을 가진 근섬유 및 개별 위축성 섬유의 출현도 빈번하게 관찰되었으며 ATPase(pH 9.4)와 NADH-TR 염색에서 유형별 군집 현상은 현저히 관찰되었으나 섬유조직이나 지방조직의 증식은 드물었다(Fig. 20).
   제 6 군은 H-E 염색상 군집성 위축이 제 4 군과 유사한 정도로 현저하였고, 위축성 섬유들의 출현도 빈법하게 관찰되었으며 섬유조직이나 지방조직의 증식도 뚜렷히 관찰되었고 ATPase(pH9.4)와 NADH-TR 염색에서 유형별 군집 현상은 현저히 관찰되었다(Fig. 21).
   제 7 군은 H-E 염색상 군집성 위축은 관찰되지 않았고, 섬유조직이나 지방조직의 출현은 드물었다. ATPase(pH 9.4)와 NADH-TR 염색에서 유형별 군집 현상은 국소적으로 관찰되었다(Fig. 22). 이상의 조직학적소견의 결과를 요약하면 Table 3와 같다.

운동신경종판의 계수
   운동신경종판계수는 정상대조군 31.2±1.99, 제 7 군 26.1±3.12, 제 3 군 22.2±3.44, 제 1 군 21.4±2.34, 제 4 군 20.2±2.02, 제 5 군 19.4±4.01 제 6 군 14.5±3.33, 제 2 군 18.1±1.07의 순이었다(Table 4). Nonparametric Mann-Whitney test를 사용한 분석에서 제 7 군에서 신경종판이 제일 많았으며 이는 제 1 군, 제 2 군, 제 4 군, 제 5 군, 제 6 군 신경절단군, 정상대조군에 비해 통계적으로 유의한 차이를 보였다(p<0.05), 그러나 제 3 군과는 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다(p>0.05). 제 3 군의 경우는 제 2 군, 제 6 군, 신경절단군, 정상대조군에 비해 통계학적으로 유의한 차이를 보였다(p<0.05).

고     찰

   마비된 근육의 신경재지배 방법에는 신경문합(neurorrhaphy, nerve anastomosis), 신경이식(nerve implantation), 신경근육변이식(nerve-muscle pedicle transfer), 근육에 의한 신경재생(muscle neurotization) 등이 있다. 신경문합은 여러 방법중 가장 확실한 방법이나 신경이 손상을 받게된 경우 대부분의 환자에서 절단된 신경말단을 찾는 것이 어렵고 발견하더라도 재문합하는 것이 결코 쉽지 않으며, 만약 마비가 만성적이든지 좌상(crush injury)에 의한 것이라면 신경의 재문합(reanastomosis)은 별 의미가 없다. 또한 신경문합은 종종 부적절한 신경재생(미입재생, aberrant regeneration), 신경종(neuroma)형성 및 공동반사운동(synkinesis)의 문제점을 내포하고 있다. Frey²⁾는 토끼에서 신경이 절단된 근육에 절단 후 즉시 신경문합, 신경이식, 근육에 의한 신경재생의 세 방법을 시행하고 6개월 후 회복정도를 근육의 수축력으로 평가한 결과 신경문합의 경우가 가장 효과적으로 정상과 비교하여 약 84%의 기능회복을 보였으며, 신경이식의 경우에서도 약 73%정도의 회복을 보인 반면 근육에 의한 신경재생의 경우 근전도검사상 어느 정도 신경재생은 확인되었으나 신경문합 및 신경이식방법에 비해 회복정도가 극히 저조하였다고 보고하였다. Sayers와 Tonge³⁾은 개구리의 골격근에서 이종신경(foreign nerve)과의 문합과 신경이식의 두 방법을 비교한 결과 신경을 이식한 경우에는 근육을 따라 신경이 일정하지 않는 방향(disorganized fashion)으로 자라 들어가는 것이 관찰되었으며, 신경문합의 경우가 신경이식한 경우보다 훨씬 효과적이었을 뿐 아니라 같은 신경분지(neural segment)에서 나온 신경을 이용한 경우에서 신경분지가 다른 신경을 이용한 경우보다도 신경재생이 훨씬 잘 되었다고 보고하면서 이종신경에 의한 골격근의 신경재생은 신경이식보다 신경문합을 시행함으로서 원래의 신경관(original neural tube)을 이용한 신경재생을 도모할 수 있고, 가능한 동종의 신경분지에서 나온 신경을 선택함으로서 보다 효과적인 신경재생을 기대할 수 있다고 하였다. Taggart⁴⁾는 반회신경을 마비시킨 개에서 횡격신경을 후윤상피열근에 이식해서 성대의 외전기능을 회복시키고자 시도하였다. 개 6마리에서 시행하여 5~12개월 후 3마리에서 외전기능이 회복되었다고 보고하였다. Doyle 등⁵⁾은 개 6마리에서 반회신경을 절단한 후 후윤상피열근에 직접 이식하여 3마리가 성공하였다고 보고하였다. 본 실험에서도 신경을 문합한 경우에 가장 좋은 결과를 나타내었으나, 신경을 근육내 이식한 경우에서 오히려 신경근육변을 이식한 경우보다 신경재생의 정도가 저조하여 Sayers와 Tonge³⁾의 결과와 일치하였다.
   신경근육변 이식은 마비된 근육에 이종운동신경과 이 신경이 지배하는 근육의 일부를 동시에 이식함으로서 정상적인 기능을 가진 운동신경종판을 이식하여 신경재지배를 도모하는 방법으로 Tucker⁶⁾는 반회신경 마비환자에서 설하신경고리와 견갑설골근 일부를 후두내근에 이식하여 높은 성공률을 보고하였다. Tucker⁷⁾는 근육변은 2~3 mm×2~3 mm정도로 하는 것이 적당하다고 하였다. 이 정도의 근육변으로도 운동신경종판이 80%이상 포함된다고 하였으며 만약 신경근육변을 크게하면 심한 섬유화로 오히려 실패할 수 있다고 하였다. 본 실험에서는 신경근육변을 작게한 경우에 보다 효과적이었고(Fig. 23), 같은 크기의 근육변을 이용한 경우에는 이식할 근육에 근육변과 동일한 크기로 근외막과 근육 일부를 제거한 경우에 가장 좋았으며, 그외 근외막만 제거하고 이식한 경우가 근외막을 절개하고 근육내에 심은 경우보다 효과적이었다. 이는 근육변은 가능한 적게 만들 것을 제안한 Tucker⁷⁾의 보고와 일치하는 결과였다. 그외 신경근육변 이식시에는 신경의 맥관(vasa nervora)이 손상되지 않도록 하여야 하며 이렇게 하기위해서는 신경 주위에 있는 소량의 지방조직은 신경박리시 신경에 붙여두는 것이 좋으며 Maki 등⁸⁾은 신경이식때 어느정도까지 신경을 박리하여도 혈행장애가 없는지를 검토한 결과 신경외 혈액순환(extrinsic circulation)의 경우 신경의 직경 대비 신경길이가 1：41까지는 가능하다고 하였고, 신경내 혈액순환(intrinsic circulation)은 1：63까지는 가능하다고 하였다. Anonsen 등¹⁾은 토끼에서 흉골설골근에 신경지배하는 설하신경고리를 절단한 후 반대측의 설하신경고리-흉골갑상근육변을 이식하고 경과를 관찰한 결과 8주경에 정상대조군과 비교하여 약 46%의 수축력을 회복하였다고 보고하였다. Neal 등⁹⁾은 개를 이용하여 반회신경을 마비시킨 후 설하신경고리와 이 신경의 지배를 받는 흉골갑상근을 5×5 mm크기로 작도하여 떼어낸 후 마비측 후윤상피열근에 이식하고 2개월 후 조직화학적검사를 시행한 결과 후윤상피열근의 근섬유의 회복은 신경근육변이식에 의한 것으로는 추정하기 어려웠다고 하였다. Crumley¹⁰⁾는 Neal 등⁹⁾의 보고를 확인하기 위하여 동일한 방법으로 실험을 한 결과 전례에서 신경재생에 실패하였으며, 몇마리에서 나타난 후윤상피열근의 신경재지배소견은 하인두수축근에 의한 것이었다고 보고하였다. Meikle 등¹¹⁾은 토끼를 이용하여 흉골설골근으로 가는 신경을 절단한 후 반대측 흉골설골근으로 가는 설하신경고리를 이용하여 신경이식과 신경근육변(5 mm2 크기)을 이식하여 신경재생의 결과를 비교하였다. 모든 실험동물에서 6주이내에 기능의 회복이 있었으며, 두 방법 모두 근육의 긴장도가 정상과 비교할만 하였으며 어떤 방법이 뚜렷하게 좋았다고는 단정할 수 없었다고 보고하였다.
   Sayers와 Tonge¹²⁾는 동물실험에서 이종신경을 근육에 이식하였을 때 신경재생은 확인되었으나 원래의 지배신경(original nerve)보다는 재생이 좋지 못하였다. 이는 이식된 신경섬유의 운동종말판(motor end plate)에서 분비되는 아세틸콜린의 양이 원래의 지배신경에서 나오는 양보다 적기 때문이라고 하였다. 반면에 Elsberg¹³⁾는 정상적인 신경지배를 받고 있는 근육은 추가해서 신경지배를 허용하지 않는다고 하였다. 즉 원래의 지배신경의 부분적인 재생이 일어나면 이종신경 이식에 의한 신경재생을 방해하여 근섬유는 추가적인 신경지배(additional innervation)을 허용할 수 없게 되는 것이다. Crumley¹⁰⁾도 비슷한 결과를 보고하였다. 즉 정상적인 근육에는 성장돌기 억제인자(axon sprouting inhibitor factor)가 존재하여 축삭의 필요 이상의 성장을 억제하고 있으나, 만약 축삭이 어느 정도 잘리게 되면 그 주위에는 뉴로크레틴(neurocretin)의 분비와 신경성장인자(nerve growth factor)가 생산되고 성장돌기 억제인자가 없어지게 되어 주위의 건전한 축삭으로부터 신경이 절단된 운동신경종판으로 신경이 재생하게 되는 것이다. 이런 상황에서 새로운 신경을 이식하면 근섬유들이 새로운 신경에 의한 신경재지배를 받아들일 수 없게 되어 신경재생은 결국 실패하게 된다고 하였다.
   신경 손상 후의 조직학적 변화를 보면 신경재생은 손상 근위부의 축삭에서 일어나게 되고, 손상 6시간 후부터 왈러씨 변성(Wallerian degeneration)이 시작되게 된다. 한편 축삭의 발아(axonal sprout)는 손상 6시간부터 나타난다. 신경절단이나 신경접합 후 신경섬유의 1/6~1/7정도가 절단 원위부의 신경과 연결되며 손상 5일이 지나면 슈반세포(Schwann cell)이 손상부위를 통과하여 더 이상의 축삭지(axonal branch)가 신경손상 부위를 쉽게 통과할 수 있도록 한다. 양측 신경 절단단 사이의 간격이 넓을수록 근위부 신경단에서의 축삭이 원위부 신경단과 연결될 가능성은 줄어들게 된다. 수초(myelin sheath)의 형성은 9~20일 정도 지연되어 일어난다. 재생된 신경섬유마디(Ranvier node)의 간격은 좁아서 신경전도의 지연이 심하며 완전히 수초화가 되기까지는 1년 이상의 기간이 필요하다. 신경절단 후 3년 이상의 충분한 신경재생의 시간이 지나더라도 정상 신경전도의 89% 이상으로 회복되지 않는다. 이는 손상 원위부의 신경섬유의 수초의 두께가 얇아서 신경섬유의 직경이 적고, 신경섬유마디가 정상에 비해 많아 마디(node)간의 간격이 좁아지기 때문이다.
   지배신경의 손상에 대한 전기생리학적 평가방법에는 근전도검사(신경전도검사 및 근전도검사), 근수축(muscle contration)검사가 있다. 이중 신경재지배의 평가에 신빙성이 있는 검사는 근수축검사와 실제 자발적인 움직임을 관찰하는 것이다.¹⁾ 그러나 근수축검사의 최대 단점은 근전도검사와는 달리 한번 이상의 검사가 불가능하여 신경재지배가 일어나는 기간 동안 주기적인 평가가 불가능한 점이다. 후두근육의 신경재지배후 근전도검사에 대하여 Siribodhi 등¹⁷⁾은 반회신경을 절단후 문합하고 경과관찰한 결과 근전도검사상 활동전위가 인정되었으나, 실제적인 기능회복은 없었다고 보고하였다. 이들은 처음으로 후두신경에서 부적절한 신경재생이 일어난 것이라고 보고하였다. Dedo¹⁴⁾도 비슷한 결과를 보고하였으며 Boles와 Fritzell¹⁵⁾도 개에서 반회신경에 좌상을 가한 다음 6~8주후에 근전도검사를 시행한 결과 후두내근의 운동단위활동전위(motor unit action potential)는 정상으로 회복되었을 뿐아니라 조직화학적으로 손상 부위 상하방의 축삭의 수도 거의 정상적이었지만 성대의 움직임은 관찰할 수 없었다고 하였다. 이는 반회신경이 외전 및 내전섬유를 함께 갖고 있기 때문이며 한가지의 기능만을 갖고 있는 신경을 이용한 경우에는 근전도검사도 신경재지배 평가에 좋은 검사법이다. 본 실험에서는 근전도 검사와 근수축력검사 모두 신경문합을 시행한 경우가 가장 좋았으며, 작은 신경근육변을 이식할 근육의 외근막과 근육 일부를 절제한 경우(제 3 군)에서 두 번째로 좋은 결과를 나타낸 것은 근섬유 및 신경의 조직학적 검사와 일치하였으나, 그외의 신경근육변이식(제 1, 2, 4, 5 군)과 신경이식(제 6 군) 사이에서는 근전도검사, 근수축력검사와 조직학적 검사 결과가 일치하지 않았다. 이는 검사상의 오차 때문으로 추정된다.
   근전도검사는 운동신경전도검사와 침전극(needle electrode)을 이용한 검사법이 있다. 운동신경전도검사는 전극을 검사하고자 하는 근육의 운동점부위에 부착하고 지배신경에 초최대 전기자극(supramaximal electrical stimulation)을 주어 근육에서 기록된 복합근활동전위의 기시부까지의 잠복기와 이를 이용한 신경전도속도와, 이 복합근활동전위의 진폭을 측정하여 신경전도검사의 척도로 사용하게 된다. 침전극검사는 근육에 침전극을 삽입할 때 나타나는 삽입전위(insertion activity)와 근육이 이완된 상태에서의 자발전위(spontaneous activity), 운동단위(motor unit)의 운동단위 활동전위(motor unit action potential) 등을 관찰한다. 또한 근육의 최소 수축으로 나타나는 운동단위 활동전위의 형태와 동원양상(recruitment pattern) 등을 척도로 사용하게 된다.
   신경절단 후 절단부를 지나는 신경전도는 즉시 소실되지만 절단 원위부 신경절의 신경전도는 72시간 후 완전 소실된다. 왈러씨 변성이 진행되면 침전극검사상 양성예각파(positive sharp wave)나 세동전위(fibrillation potential)와 같은 비정상적 자발전위가 나타나며 이러한 비정상적 자발전위는 손상부위에 따라 다르나 대개 3주 후에 발현되어 근육의 신경재지배가 일어날 때까지 또는 탈신경된 근육이 완전 위축되어 근섬유가 소실될 때까지 지속된다. Howard는 말초신경 손상후 세동전위가 일어나지 않는 이유로 첫째 시기적으로 월러씨 변성의 기간이 충분하지 않는 경우, 둘째 neuropraxia와 같이 절단된 신경의 손상 정도가 경한 경우, 셋째 근육의 온도가 지나치게 낮은 경우, 넷째 근육섬유가 심한 위축으로 활동성을 상실한 경우, 다섯째 신경재지배가 완성된 경우 등을 지적하였다. 만약 신경재지배가 일어나면 근육의 활동전위의 수는 점차 증가하게 되며, 주위로부터의 축삭발아(collateral sprouting)에 의해 다상성 운동단위 활동전위(polyphasic motor unit action potential)를 형성하게 된다. 해부학적인 신경재지배와 기능적인 회복은 일치하지 않으며, 많은 실험¹⁴⁾¹⁵⁾을 통하여 후두성대마비가 있는 개에서 운동단위활동전위의 양상이 거의 정상적으로 회복되었다고 하더라도 기능회복이 비례하지 않는 경우를 볼 수 있는데 이는 부적절한 신경재지배와 재지배된 신경의 성숙에 더 이상의 기간이 필요하기 때문이라고 설명하고 있다.
   정상 근섬유는 크게 1형 근섬유(slow-twitch or red)와 2형(fast-twitch or white) 근섬유로 분류되고 2형은 2A형, 2B형, 2C형으로 세분한다. 일반적으로 1형 근섬유는 사립체(mitochondria)와 미오글로빈(myoglobin)이 많고 쉽게 피로하지 않으며(fatigue-resistant), 2형 근섬유는 사립체 및 미오글로부린이 적고, myofibrillar ATPase가 풍부하며 섬세하고 빠르고 강한 수축을 하지만 쉽게 피로해진다. 2A형은 빠른 수축을 하지만 2B형에 비해 지속적이고 쉽게 피로하지 않으며 산소성 당분해작용으로 에너지를 생산한다. 2B형은 빠른 수축을 하지만 쉽게 피로해지고 무산소성 당분해작용으로 에너지를 생산하는 것이 2A와 차이점이다. 2C형은 다른 근섬유형의 전구 근섬유로서 태아기나 출생 직후 일시적으로 관찰되고 성인에서는 거의 관찰되지 않는 미분화형이다. 근섬유의 분화 또는 성숙은 지배하는 신경에 의해 결정된다. 실험적으로 근섬유로 가는 신경을 절단하고 이들을 엇갈리게 연결시켜 재생시키면 신경분포에 따라 근섬유의 조직학적 및 기능적 변화가 생기게 된다.¹⁶⁾
   정상적인 근육은 두가지 유형 이상의 근섬유가 서양 바둑판 모양으로 섞여 있으나, 신경 손상 후 재신경화되는 과정에서 비정상적으로 한 종류의 근섬유끼리 모여 근섬유의 유형별 군집(type grouping)을 이룰 수도 있다. 골격근을 지배하는 신경이 절단되면 골격근은 서서히 위축상태에 빠지게 되고 변성을 일으키게 된다. 그러나 신경이 절단된 근육에서 어느 정도 시간이 경과하여야 비가역적인 변화를 초래하는지는 아직도 논란이 되고 있다. 그리고 이러한 변화는 개체간 뿐 아니라 동일한 개체내에서도 근육의 부위에 따라 차이가 있는 것으로 알려져 있다.¹⁰⁾ Neal 등⁹⁾은 개 실험을 통하여 신경 절단 후 8개월까지는 신경재생에 별 문제가 없었다고 한 반면, Anonsen 등¹⁾은 신경절단 후 근육의 위축은 신경절단 기간에 따라 차이가 있으나, 사람의 경우 2년까지는 위축이 경미하다고 하였다. 그외 인자로서 찬곳에 노출된 경우, 신경의 절단된 기간 동안의 재활운동 여부 등이 관여한다.¹⁰⁾ 신경이 절단된 경우 가능한 조기에 근섬유와 새로운 축삭을 연결하여 신경을 재생시킴으로서 섬유화를 줄일 수 있다. 섬유화가 일어나면 축삭의 성장을 방해하게 되고 결과적으로 정상적인 근섬유를 잃게 되어 기능을 다하지 못하게 된다. 대개 신경이 재생된지 8주 경과해도 근육속에는 결체조직이 증가되어 있고 근섬유는 감소되어 있다.¹⁾ Song¹⁶⁾은 신경손상시 이차적으로 무용성 근위축(disuse atrophy)이 오게 되는데, 주로 2형 근섬유의 위축이 오게 된다고 한 반면 Crumley¹⁰⁾는 반회신경 마비가 있는 후윤상피열근(Posterior cricoarytenoid muscle)에서 1형 근섬유가 2형 근섬유보다 빠르게 위축이 오는 것을 관찰하였다.
   신경재지배후 근육의 회복정도를 알기 위한 조직학적 검사는 전체 근육의 단면적, 지방 및 결체조직의 정도, 핵의 위치, 위축섬유, 운동신경종판 등을 관찰함으로서 평가할 수 있다.^2)17)18) 신경재지배가 일어난 근육은 회복정도에 따라 차이는 있으나 핵은 세포의 중심으로 이동되고, 지방 및 결체조직은 증식하며, 근섬유는 다소 위축되며 드물게 비후되기도 한다.²⁾ Anonsen 등¹⁾은 신경재지배의 평가는 HRP를 이용한 확인이 조직학적 검사중에서 가장 신빙성이 있다고 하였다. 저자의 경우 근육조직의 염색후 전체근육의 단면적, 그리고 개별 근섬유의 크기를 개관적으로 측정하기 위하여 화상분석기를 이용하였지만, 근섬유들의 방향성 및 생검부위에 있어서의 다소간의 차이가 있어서 유의한 결과를 얻을 수는 없었다.
   근육의 조직화학적 염색방법¹⁶⁾에는 근섬유 및 결체조직을 보기 위한 modified Gomori's trichrome 염색과 Verhoeff-van Gieson 염색, 근섬유내의 당원 등의 확인하기 위한 Periodic acid-Schiff(PAS) 염색, 지방을 염색하기 위한 oil red O 혹은 Sudan black B 염색법 등이 있다. Modified Gomori's trichrome 염색에서 근섬유는 푸른-초록색, 교원섬유는 연한 푸른-초록색으로 핵, 신경의 수초, 사립체는 붉은 점으로 염색되며 1형 근섬유가 2형보다 약간 진하게 염색되어 어느정도 구별이 가능하다. Verhoeff-van Gieson 염색은 근섬유가 노란색, 교원섬유가 분홍색으로 염색됨으로 교원섬유의 증식을 보기에 적당한 것으로 알려져 있다. 근육의 효소조직화학적 염색방법¹⁶⁾에는 ATPase, NADH-TR, succinate dehydrogenase(SDH), lactic acid dehydrogenase(LDH) 등이 있다. ATPase(pH 9.4)염색에서 근섬유는 약하게 염색되는 1형과, 진하게 염색되는 2형으로 구별할 수 있으며, ATPase(pH 4.3)염색에서 근섬유는 진하게 염색되는 1형, 아주 약하게 염색되는 2형의 구별이 가능하다. NADH-TR 염색에 의하면 1형 근섬유가 가장 진하게, 2A형은 중간, 2B형이 가장 연하게 염색된다.
   신경의 조직화학적 염색¹⁹⁾은 한가지 방법으로 염색해서는 세포 또는 세포의 구성요소가 다 나타나지 않으므로 각각의 구성요소를 염색하여 관찰한 후 이를 종합하여야 한다. 신경조직을 염색하는 방법에는 염기성 아닐린 염료(basic aniline dye)인 toluidine blue, methylene blue, thionine, cresyl violet로 염색하며, 수초(myelin)염색은 중크롬산(potassium dichromate)으로 매염한 후 헤마톡실린(hematoxylin)으로 염색하거나(Weigert method), Luxol fast blue 염색법 등이 있다. 신경 축삭의 염색에는 환원은염색(reduced silver stain), 골지방법(golgi method) 등이 대표적이다.
   Baldissera 등²⁰⁾은 횡격신경에 의한 신경문합 4개월후 재생된 반회신경의 조직학적 검사상 후윤상피열근의 구성은 44%는 1형 근섬유, 56%는 2형 근섬유로서 정상 후윤상피열근의 구조와 거의 유사하였으나, 유수섬유(myelinated fiber)의 증식이 현저하였고, 축삭의 평균 직경은 3.0~5.0 μm로 정상 횡격신경 및 반회신경의 직경인 8~10 μm보다는 다소 작았으며, 마디간 길이(internode length)의 평균은 정상 반회신경의 2분의 1정도였다고 보고하였다.
   본 연구에서 근섬유의 조직학적 검사상 신경문합을 시행한 경우와 작은 신경근육변을 이식할 근육의 외근막과 근육 일부를 절제한 경우(제 3 군)에서 정상대조군에 비해 근섬유는 다소 작았으나 유형별 군집은 드물었고, 섬유조직이나 지방조직의 증식도 거의 관찰되지 않았다. 그외의 신경근육변이식(제 1, 2, 4, 5 군)과 신경이식(제 6 군)에서는 위축성 섬유들이 산발적으로 관찰되었고 NADH-TR 염색상 균일의 짙은 염색상을 보였다.
   운동신경종판검사에 대해 Zheng 등¹⁸⁾은 신경재지배를 평가하는 좋은 검사법이라고 하였으며 실제 신경재지배가 잘 일어난 경우 운동신경종판이 일정하게 숫적으로 증가하였다고 보고하였다. 본 연구에서도 작은 신경근육변을 이식할 근육의 외근막과 근육 일부를 절제한 경우(제 3 군)에서 정상보다 다소 적었으나 신경이식 혹은 신경근육변이식을 크게한 경우보다는 좋은 결과를 보였다.
   결론적으로 신경재지배는 신경문합이 가장 이상적이지만 사정상 시행하지 못하는 경우에는 신경이식보다는 신경근육변이식이 보다 효과적이며 신경근육변의 적절한 혈류공급과 섬유화를 최소화하기 위해서는 신경근육변을 2×2 mm 정도로 작게 만들고, 이식할 근육에는 근외막을 포함하여 약간의 근육을 제거하는 것이 좋다. 그외 신경근육변에 긴장(tension)이 가해지지 않으면서 이탈되지 않도록 적절하게 고정하여야 한다.

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