교신저자：정필상, 330-714 천안시 안서동 산 16번지  단국대학교 의과대학 이비인후­두경부외과학교실
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서     론

   광화학치료는 새로운 암치료 수단으로써 항암효과의 우수성이 점차로 인정받고 있는 최신방법이다.¹⁾ 광화학치료는 1980년대부터 본격적으로 연구되었고 1990년대 들어 캐나다, 독일, 일본 등에서 임상시술이 승인된 이래 미국의 FDA에서도 1996년 1월에 식도암 치료허가를 내주었고, 1997년 9월에는 초기 폐암치료에 대해 승인하였다. 광화학치료의 원리는 체내의 풍부한 산소와 외부에서 공급되는 빛과 빛에 의해 활성화되는 광감각제(photosensitizing agent)의 종합적인 화학반응으로 인하여 생기는 단일유리산소(singlet oxygen)와 자유 라디칼(free radical)이 각종 병변 부위나 암세포를 파괴하여 암을 치료하는 것으로, 광역학치료의 핵심은 최적의 치료효능과 최소의 부작용을 가진 저렴한 광감각제와 이에 맞는 광원의 개발이라고 할 수 있다.²⁾ 
   최근에는 Hematophophyrin derivatives(HPD)를 근간으로 하는 Photofrin이 광감각제로 임상시험 허가가 나와 실제로 임상에 쓰이고 있으며 그 적용범위를 점차 확대하고 있고 결과적으로 부분관해 또는 완전관해효과를 나타내고 있다.³⁾ 
   본 연구에서는 인체 두경부 영역의 편평상피세포암주에서 광감작제로 Photofrin의 일종인 Photogem과 632 nm의 diode 레이저를 이용하여 이들의 항암효과와 세포고사(apoptosis)과정에서 일어나는 세포사멸(cell death)의 기전에 대하여 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

광감작제 및 레이저
   광감작제로는 최근 러시아에서 개발한 Photogem(Mos-cow Institute of High Chemical Technologies)을 사용하였고, 레이저는 Creamoptec사의 632 nm의 광역학 치료용 Diode 레이저(독일)를 이용하였다.

세포배양
   인체 하인두암환자로부터 수립된 SNU-1041 편평상피세포암 세포주를 culture flask(Nunc, USA)에서 세포배양액으로는 RPMI-1640(Gibco BRL, USA) 배양액을 사용하여 5% CO₂ 배양기내에서 배양하였다.

레이저 조사시간(Laser irradiation time)에 따른 세포 생존율 조사
   편평상피세포암 세포주를 96 well plate(10⁴개/well)에서 하루 동안 배양한 후 광감작제인 Photogem을 3.75 ug부터 0.007 ug까지 단계별로 희석된 배양액으로 교환하였다. 대조군으로는 PBS(phosphate buffered saline, pH 7.2)을 사용하였다. 6시간 후 무균 상태에서 Diode 레이저(0.4 W)를 0분, 15분, 30분, 45분, 60분 동안 조사하고 5% CO₂ 배양기에서 72시간 배양하였다. 그리고 MTT solution (2 mg/ml)처리를 통하여 생성된 formazan을 각 well의 배지를 모두 제거한 후 150 μl의 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 첨가하여 ELISA reader(BIO-RED 480, USA)로 540 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 세포독성능을 확인하였다. 측정한 흡광도는 살아있는 세포의 수와 직접적으로 비례하는데 Photogem을 첨가하지 않은 대조군과 비교하여 세포생존율(cell viability)을 아래와 같은 공식을 이용하여 계산하였고 모든 실험은 Photogem 각 농도마다 4개 well씩 평균 흡광도를 계산하여 세포 생존율을 구하였다.

   Cell Viability(%)＝ (Mean Optical Density in test well / Mean Optical Density in control well) ×100

레이저 조사시기(Interval time)에 따른 세포 생존율 조사
   편평상피세포암 세포주를 96 well plate(10⁴ 개/well)에서 하루 동안 배양한 후 광감작제인 Photogem을 3.75 ug부터 0.007 ug까지 단계별로 희석된 배양액으로 교환한 후 0, 3, 6, 9, 12시간이 경과 한 후에 Diode 레이저(0.4 W)를 30분 동안 조사하였다. 대조군으로는 PBS(phosphate buffered saline, pH 7.2)을 사용하였고 5% CO₂ 배양기에서 72시간 배양 후 MTT assay를 통하여 세포 생존율을 조사하였다.

레이저 세기(Laser power)에 따른 항암효과
   편평상피세포암 세포주를 96 well plate(10⁴ 개/well)에서 하루 동안 배양한 후 광감작제인 Photogem을 3.75 ug부터 0.007 ug까지 단계별로 희석된 배양액으로 교환하였고 대조군으로는 PBS(phosphate buffered saline, pH 7.2)을 사용하였다. 단계별로 희석된 Photogem투여 6시간 후 무균 상태에서 0.1 W, 0.2 W, 0.4 W, 0.8 W의 세기로 Diode 레이저를 30분간 조사하고 5% CO₂ 배양기에서 72시간 배양 후 MTT assay를 통하여 세포 생존율을 조사하였다.

Apoptosis기전의 관찰
   3.75 μl/ml부터 0.47 μl/ml까지 단계별로 희석된 Photogem에 세포를 상기 실험과 동일한 조건으로 well plate에 배양후 632 nm Diode 레이저를 0.4 W에서 30분씩 조사하고 0, 0.5, 1, 2, 4, 6시간후 상온에서 paraformal-dehyde sol(4% in PBS, pH7.4)에 30분간 처치하여 조직을 고정시키고, PBS로 5분씩 3번 수세한 다음 0.1% Tryton X-100 in 0.1% sodium citrate로 30분간 반응시키고, PBS로 5분씩 3번 세척하였다. 그리고 DAPI(2 μg/ml)로 상온에서 30분간 반응시키고 PBS로 5분씩 3번 세척후 형광현미경하에서 세포의 핵을 관찰하였다. 대조군으로는 아무런 처치도 하지 않은 세포를 설정하였다. 또한 광역학치료후의 세포내 소기관과 핵의 미세구조의 변화를 알아보기 위하여 투과전자현미경을 이용하여 관찰하였다. 실험 결과는 SAS 통계프로그램을 이용하여 각 농도에서의 레이저 조사시간, 조사시기, 레이저의 세기변화에 따른 Photo-gem의 항암효과와 차이를 two-way ANOVA test로 분석하였고 통계적 유의성은 p<0.05로 검증하였다.

결     과

레이저 조사시간에 따른 흡광도 및 세포생존율
   Photogem을 투여한 후 레이저 조사시간을 변화시킨 실험군이 Photogem을 투여하지 않은 대조군의 흡광도보다 전체적으로 낮았다. 0.234 μg/ml의 Photogem농도에서 실험군의 흡광도는 레이저를 조사하지 않은 군에서 1.052±0.138, 15분 조사한 군에서 0.775±0.068, 30분, 45분 조사한 군에서 0.693±0.194, 0.585±0.049였고 60분 조사한 군에서는 0.406±0.026로 나타나서 레이저 조사시간이 길어질수록 의미있는 세포생존율의 감소를 보였다.
   Photogem의 농도증가 및 레이저 조사시간이 길어질수록 세포 생존율의 감소를 확인할 수 있었고, 살아있는 암세포를 Photogem 비처리군에 비해 50%로 줄일 수 있는 농도를 IC50(Initial Concentration)으로 정의하면 레이저를 45분 조사한 경우 대략 0.234 μg/ml정도로 추정할 수 있는데 이 농도에서 각 실험군의 세포생존율은 LT 0군은 85.65±11.22%, LT 15군에서 63.09±5.53%, LT 30, LT 45군에서 56.47±15.84%, 47.63±3.98%였고 LT 60군에서는32.85±2.14%로 나타나서 매우 낮은 생존율을 보였다(Fig. 1).

레이저 조사시기에 따른 흡광도 및 세포 생존율
   Photogem을 투여한 후 레이저 조사를 시행한 실험군이 Photogem을 투여한 후 바로 레이저 조사를 시행한 대조군의 세포생존율보다 전체적으로 낮았다. 0.234 μg/ml의 Photogem의 농도에서 레이저를 바로 조사한 군의 흡광도는 1.856±0.011였고 3시간 후에 조사한 군의 경우에는 1.039±0.117였다. 6시간, 9시간 후에 조사한 군에서는 각각 0.899±0.086, 0.803±0.072였고 12시간 후에 조사한 군에서는 0.960±0.041였다. 각각의 조사시기의 차이에 따른 세포생존율은 Photogem 투여후 3시간 이후부터 12시간까지 비슷한 세포독성을 관찰할 수 있었다.
   IC₅₀ 으로 추정되는 0.234 μg/ml에서 세포생존율은 IT 0군에서 96.66±0.58%, IT 3군에서는 58.03±6.52%, IT 6군에서는 50.214.80%이고, IT 9군과, IT 12군에서의 세포생존율은 44.81±4.01, 53.60±2.29이었다(Fig. 2).

레이저 세기에 따른 흡광도 및 세포 생존율
   Photogem을 투여한 후 레이저의 세기를 변화시키며 조사한 실험군이 대조군의 세포생존율보다 전체적으로 낮았다. 0.234 μg/ml의 Photogem의 농도에서 레이저를 100 mW의 세기로 조사한 군에서의 흡광율은 0.811±0.043였고 200 mW, 400 mW에서는 0.708±0.026, 0.655±0.018였다. 800 mW의 세기에서는 0.466±0.052의 흡광도를 나타내었다. 레이저의 세기가 증가할수록 흡광도의 감소를 나타내었다.
   IC₅₀으로 추정되는 0.234 μg/ml에서 세포생존율은 100 mW군에서 61.78±3.27%, 200mW군에서는 53.96±2.02%, 400 mW군에서는 49.92±1.42%이고, 800 mW군에서의 세포생존율은 35.51±4.02%이었다(Fig. 3).

Apoptosis의 확인
   형광현미경하에서 관찰한 apoptosis과정은 정상세포에서는 DAPI염색을 통한 핵 염색시 특이소견이 관찰되지 않았으나 Photogem을 농도별로 투여하고 일정시간동안 후 관찰한 현미경하에서는 chromatin과 세포질내 소기관이 농축되어 막에 둘러싸인 사멸체(apoptotic body)를 확인할 수 있었다. 이는 Photogem의 농도가 증가할수록 뚜렷하게 관찰할 수 있었다(Fig. 4). 투과전자현미경 관찰에서도 염색사의 응축을 관찰할 수 있었다(Fig. 5).

고     찰

   본 연구에서는 Photogem의 농도변화에 따라서 레이저세기 및 레이저 조사시간이 길어질수록 세포생존율이 지수적 감소현상을 보였는데 이는 세포 독성효과가 단순한 광감각제의 세포내 농도 증가에 비례하기보다는 세포내에서 광감각제에 의한 새로운 신호전달 과정이 있고 계속해서 반응물질의 생산이 일어남을 시사하는 소견이다. 광감각제 첨가후 특정파장이 아닌 자연광에 폐광장치없이 노출시켰을 경우 세포생존은 평균 210분으로 광감각제만으로도 세포독성이 있다는 보고가 있고⁴⁾ 본 연구에서도 이를 확인할 수 있었다. 특정 파장의 빛을 조사하는 방법에는 연속적 또는 간헐적으로 조사하는 것을 생각할 수 있는데 두 방법이 세포독성효과에는 특별한 영향을 주지 않는다는 보고⁵⁾와 간헐적 조사가 좀더 유의한 세포독성효과를 보인다는 보고⁶⁾로 나뉘지만 본 연구에서는 빛을 연속적으로 조사하였다.
   Photogem투여후 레이저를 조사하기까지의 시간간격에 따른 세포생존율은 3시간이후부터 12시간까지 유의하게 감소하지 않았으나 시간간격을 두지않은 실험군과는 확연한 차이를 보였다. 이는 광감각제를 투여후 최소 3시간이후 부터의 항암효과는 비슷하다고 볼 수 있고 광감각제와 세포의 충분한 반응시간을 두고 레이저조사를 하는 것이 광화학치료시 더 높은 항암효과를 가져올 것이라고 사료된다. 광감각제의 효율성을 좌우하는 것은 단순한 세포내 광감각제의 총 농도가 아니라 목표지점에 있는 광감각제의 양이 중요한 관건이다.⁵⁾ 종양에 의한 광감각제의 흡수율은 정확히 예견하기 어려운데 Hematoporphyrin의 종양내 분포가 최근에야 동물실험에서 밝혀졌으며 종양내로 흡수되는 기전은 아직까지도 불확실하다. 또한 종양의 괴사부위는 광감각제의 흡수력이 떨어져 치료 효과가 반감될 것이다. 현재까지 개발된 광감각제로써 정상조직보다 암조직에 월등히 많은 양이 흡수되는 감각제는 없는 것으로 알려져있다.
   최근의 연구에서 광화학치료시 레이저조사세기와 세포의 종류에 따라 세포의 반응이 apoptosis와 necrosis로 세포파괴기전의 비율이 다른데 돌연변이형 p53유전자를 가진 human bladder carcinoma의 경우 LD₅₀의 광량에서는 apoptosis가, LD₉₀의 광량에서는 necrosis를 통한 세포파괴가 더 활성을 갖는 것으로 보고 되고있다.⁷⁾ 본 연구에서는 세포독성효과의 판정은 MTT분석을 통해 시행하였는데 이는 사구체의 기능에 국한된 검사로서 전반적인 세포파괴기전을 확인하기에는 부족하므로, DAPI염색과정을 통하여 Photogem에 의해 유발된 apoptosis과정을 실제로 관찰하였다. DAPI염색법은 DNA specific dye의 일종으로 핵내의 변화인 염색질 응축이나 DNA 절편화를 세포수준에서 측정하는 방법으로 prapidium iodide나 Hoechst dye를 사용한다. Apoptosis과정중의 핵은 정상적인 핵과 비교하여 작고, 세포질 응축현상으로 인해 상당히 밝으며 DNA가 잘라진 경우에는 염색질이 몇 개의 덩어리로 구성되어 있음을 관찰할 수가 있다. 본 연구에서는 이러한 변화가 광감각제의 농도가 증가함에 따라 더욱 활발히 일어나는 것을 확인함으로써 실제적인 항암효과가 apoptosis에 의한 세포고사기전을 통해서도 발생함을 알 수 있었으나 apoptosis 확인만으로 정확한 세포파괴기전을 단정지을 수 없어 앞으로 apoptosis와 necrosis를 비교하여 두경부편평세포암주에서의 보다 정확한 확인이 필요하다고 사료된다. 그리고 광화학치료에서는 인체에 부작용을 유발하지 않으면서 최대한의 항암효과를 나타낼 수 있는 레이저의 최적세기와 최적조사시간에 대한 연구가 각각의 레이저별로 선행되어야 하며, 향후 Photogem을 비롯한 다른 광감각제와 상호 협동적으로 효용성을 높일 수 있는 투여방식이 연구되어 광화학치료의 실제적 임상사용범위가 더욱 확대될 수 있을 것으로 기대된다.

결     론

   본 연구의 결과 in vitro에서 Photogem을 이용한 광화학치료가 실제적으로 유의한 항암효과를 나타냈고, 그 효과를 최대한으로 발휘하기 위해서는 최적의 레이저환경에 대한 연구가 더욱 필요할 것으로 생각된다. 항암효과의 발현에 필수적인 apoptosis 기전이 실제적으로 세포사멸의 정도와 비례하여 일어남을 확인할 수 있었고 apoptosis 과정을 유도하기 위한 최선의 조건에 대한 연구도 병행되어야 할 것으로 생각된다.

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3. Dougherty TJ, Kaufman JE, Goldfarb A, Weishaupt KR, Boyle D. Photodynamic therapy for the treatment of malignant tumors: Cancer Res 1978;38:1978.

4. Lee WY, Park UH, Kim BS, Han MJ, Hahn BS. Chlorphyll derivatives (CpD) extracted from silk worm excreta are specifically cytotoxic to tumor cells in vitro: Yonsei Medical Journal 1990;31:225-33.

5. Jin He, Min-Fen Horng, J. Thom Deahl, Nancy L. Oleinick. Variation in photodynamic efficacy during the cellular uptake of two phthalocyanine photosensitizers: Photochem Photobiol 1998;67:720-8.

6. Muller S, Walt H, Hallr U, Fiedler D. Enhanced photodynamic effects using fraction rated laser light. J Photochem Photobiol 1998;42:67-70.

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8. Han-Gyun Kim. Anticancer effect of photodynamic therapy using 9-Hydroxypheophorbide-a and 660nm diode laser on human squamous cell carcinoma cell line. Korean Journal of Head & Neck Oncology 2001;17:3-7.