교신저자：박기현, 442-721 경기도 수원시 팔달구 원천동 산 5  아주대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   이관은 중이강과 비인강을 연결하는 구조물로서 중이강의 환기, 배액, 방어에 매우 중요한 역할을 담당하는 구조로, 중이에 발생하는 대부분의 질환에 이관 기능의 부전이 근본적인 원인이 되는 경우가 많다. 이관 기능부전에 대한 연구는 오래 전부터 시도되어 왔지만 아직도 명확한 해답을 찾지 못하고 있다. 그동안의 연구는 주로 이관의 분비기능에 관계되는 여러 물질들을 규명하고 각각의 기능에 대한 연구들이 있었다.¹⁾²⁾³⁾ 그러나 보다 근본적인 이관의 기능부전을 이해하기 위해서는 우선 정상적인 이관의 형태학적인 연구가 선행되어야 한다. 특히 이관과 그 주위 구조의 발생학적인 이해는 아직 초보상태에 있으며 이관 상피 및 연골 및 탄성구조 등의 발생과 성장에 대한 보고는 부분적으로 이미 기술된 바 있지만 충분치 않은 상태이다.⁴⁾ 이관의 발생에 대한 형태학적인 연구는 향후 이관기능부전 연구에 중요한 자료가 될 수 있으리라고 생각된다.
   이관 발생에 대한 연구는 대부분 실험동물을 통해 이루어져 왔는데,^1)2)5)6) 중이의 발생, 특히 중이 점막 상피 발달과 이관 및 중이 점막의 섬모계, 분비요소의 발생 구조에 관해서도 보고되었다.^7)8)9)10) 그러나 중이강과 이관에서 가장 중요한 역할을 하는 상피세포의 기원 및 발생기전과 연골 및 탄성구조의 발생 기전 등에 대해서는 연구가 부족한 실정이다.
   이에 저자들은 이관의 탄성구조를 유지하는데 필수적인 이관 연골의 발생과 탄력섬유(elastic fiber) 및 교원섬유(collagen fiber)의 발현을 알아보고, 또한 이관 탄성유지에 직접적으로 관련된 탄성섬유를 분해하는 탄력섬유분해효소인 elastase에 대해 방어역할을 하는 항탄력섬유분해효소인 α1-antitrypsin의 발현을 통해 발생 및 성장시 탄력섬유의 보존여부를 알아봄으로써, 탄성구조물의 형성측면에서 이관의 발생 과정을 이해하고, 또한 향후 발생학적인 측면에서의 이관기능부전의 병인에 관한 연구에 형태학적인 기초자료를 마련하고자 하였다.

대상 및 방법

재  료
   임신 11일부터 생후 21일까지의 BALB/c 흰쥐 34마리를 이용하였다. 성적 발육이 충분한 암컷과 수컷을 함께 두어 교미를 유도한 후 암컷의 질에서 전(plug)이 형성되는 날을 임신 1일째로 계산하는 질전법(vaginal plug technique)을 이용하여 임신 기간을 결정하였다. 임신 11일째부터 18일까지(흰쥐의 임신기간은 18일) 매일 한 마리씩, 그리고 출생 후 21일까지 매일 한 마리씩 희생시키면서 양측 이관의 표본을 제작하였고, 이 중 표본이 불량하였거나 출생 후 표본에서 이관과 중이 상피층에서 염증세포가 관찰된 경우인 5마리의 표본은 제외시켰다.

방  법

표본제작
   흰쥐를 흡입마취 후 통증없는 상태에서 고정액의 관류없이 절두 후 10% 중화 완충 포르말린(10% neutral-buffered formalin)으로 상온에 2일간 담궈 고정하였으며, 생후에 채취한 표본들은 고정 후 10% EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid in 0.1 M Tris buffer, pH 6.95)에 2주동안 탈석회화 시켰다. 완전히 골조직을 탈석회화 시킨 후에 0.1M phosphate buffer액으로 세척한 후 70%, 80%, 90%, 100% 에탄올의 순서로 약 10분간씩 담구어 탈수시키고 통상적인 방법으로 파라핀에 포매시켰다.

Hematoxylin & Eosin(H & E) 염색 및 Alcian blue & periodic acid-schiff(AB-PAS) 염색
   포매한 표본들을 이관이 나타나기 시작한 부위에서 종축과 횡측으로 microtome을 이용하여 5마이크로미터 두께로 연속적으로 세절한 후 탈포매 및 재수화시켜서 H & E 염색을 하였다. 이관의 분비세포의 점액 성분을 증명하기 위해 Alcian blue(pH 2.5) and periodic acid-schiff(AB-PAS) 염색을 하였는데, 이 염색으로 카르복실화 되고 황화(sulfated)된 산성 점액질은 푸른색으로 염색되고 중성점액질은 자홍색으로, 중성과 산성 혼합 점액질은 보라색으로 염색된다.

Verhoeff 탄력섬유 염색
   탄력섬유(elastic fiber)의 관찰은 Verhoeff 탄력섬유 염색법을 이용하였다. Verhoeff hematoxylin용액에 넣어 15~30분간 염색한 후 수돗물에 2~3회 헹군 후, 현미경하에서 배경이 회색, 탄력섬유가 흑색으로 구별될 때까지 2% ferric chloride수용액으로 탈색시켰다. 그 후 다시 수돗물에 씻은 다음 착색된 iodine을 제거하기 위해 5% sodium thiosulfate수용액에 1분간 둔 다음 흐르는 물에 5분간 수세하였다. van Gieson용액에 2~3분간 대조염색하여 흑색의 탄력섬유를 구별하였다.

Masson trichrome 교원섬유 염색
   교원섬유(collagen fiber)의 관찰은 Masson trichrome염색법을 이용하였다. 포르말린에 1차 고정된 절편을 Bouin용액에 옮겨 56°C에서 1시간 또는 실온에서 하룻밤 고정시킨 후 50~70% 에탄올에 옮겨 절편에 착색된 피크르산을 제거하고 수돗물에 씻었다. 다시 Weigert iron hematoxylin용액에 10분간 염색한 후 흐르는 수돗물에 10분간 수세하였고 계속해서 Biebrich scarlet-acid fuchsin액에 15분간 염색한 후 증류수를 이용하여 헹구워 냈다. phosphomolybdic-phosphotungstic acid용액으로 15분간 분별한 후 수세없이 직접 aniline blue용액 또는 2% light green액에 옮겨 2~5분간 염색한 후 1% acetic acid에 3~5분간 수세한 후 청색으로 염색된 교원섬유를 관찰하였다.

면역조직화학적 염색
   파라핀에 포매된 조직은 각 기간별로 α1-antitrypsin에 대한 단클론항체인 rabbit anti-rat α1-antitrypsin antibody(Peninsula Laboratories Europe Ltd, Merseyside, England)를 이용하여 면역조직화학적 염색을 시행하였다. 조직을 5μm두께로 절편을 만들어 탈포매 및 재수화시킨 후 0.1% CaCl₂가 포함된 0.1% trypsin phosphate-buffered saline(PBS)에 5분간 3회 세척하였다. 비특이성 반응을 줄여 조직항원이 잘 노출될 수 있도록 10% normal goat serum으로 15분간 방치(incubation)하였다. 각 1차항체는 5% normal horse serum이 포함된 PBS에 1：200으로 희석하여 반응시켰으며, PBS로 3번 세척 후 조직절편은 secondary antibody(1：200 diluted horse biotinylated antimouse IgG[Vector Laboratories, Burlingame, CA])로 상온에서 1시간 방치 후 ABC reagent(Vector Laboratories)로 30분간 처리하였다. 발색체로서 0.05% 3, 3’-diaminobenzidine을 사용하였다. 면역조직화학 염색은 3회씩 시행하였으며 음성 대조조직은 모든 과정을 동일하게 하면서 1차 항체대신 normal serum IgGs를 사용하였다.

결     과

   흰쥐의 임신기간은 18일로 임신 15일 전에는 이관 고실강(tubotympanic recess)에서 형성되는 원시 중이강과 이관사이에 명확한 구분이 없었고, 임신 16일에 이관 고실강이 이관(eustachian tube)과 중이강(middle ear cavity)으로 구별되는 것을 의미하는 소위 병목축소현상(bottle neck constriction)이 관찰되었다(Fig. 1A). 임신 16일과 17일에 이관에서 섬모세포(ciliated cell)와 분비세포(secretory cell)가 처음 관찰되었다. 임신 16일에 이관상피세포에서 섬모가 관찰되는 섬모세포가 나타났고(Fig. 1B), 임신 17일에는 이관 상피에서 분비세포가 처음 발견되었으며(Fig. 2), 이 분비세포는 생후에 급격히 증가하였다.
   이관연골의 발달을 관찰한 바, 발생기와 임신초기에는 연골의 형태를 관찰하기 어려웠고 생후 5일째 미분화된 연골조직이 관찰되기 시작했으며(Fig. 3), 생후 7일째부터 어른 쥐에서 관찰할 수 있는 성숙된 형태의 연골이 관찰되기 시작하였다. 탄력섬유는 연골세포(chondrocyte) 사이사이에서 특수 염색을 통해 관찰할 수 있었는데 생후 7일째부터 나타나서 시간이 지남에 따라 그 수가 점점 더 증가하였다(Fig. 4). 교원섬유 역시 생후 7일경부터 관찰이 가능하였다(Fig. 5).
   α1-antitrypsin에 대한 양성 반응은 임신 16일째부터 나타나기 시작하여 생후 점차 강하게 염색이 되어 생후 2일째에 성숙한 수준으로 발현되었다(Fig. 6).

고     찰

   이관은 중이강에 대한 환기, 배액 그리고 비인강으로부터 침범되는 병원균에 대한 방어기능 등 매우 중요한 기능을 하고 있으며, 연하 등의 생리적 작용으로 이관이 열린 후 곧 원위치로 돌아가 닫혀 상기기능들이 유지되게 한다. 이관은 구개범장근이 이관 측벽을 당겨 열리고 곧 바로 본래 위치로 돌아가 닫히게 되며, 따라서 이때 발생되는 이관의 외판과 내판사이의 연골 탄력도와 순응력(compliance)의 이상은 중이 병인에 중요한 요소들로 작용할 수 있다. 이관기능은 중이의 압력을 대기압과 평형을 유지시켜 최적의 청력을 가지도록 하는데 기여하고 있다. 따라서 이관의 기능부전은 중이강의 환기, 배액에 장애를 일으키고 비인강으로부터의 방어기능이 상실되어 중이염을 일으키며 그로 인해 정상 청력 유지에 손상을 입게 된다.¹¹⁾
   최근 흰쥐와 인간이 갖는 중이 및 이관 형태의 유사성, 그리고 병원균으로 감염시 흰쥐 중이가 인간과 비슷하게 반응함으로 중이 및 이관 연구의 실험모델로서 흰쥐가 널리 이용되어지고 있으며,¹²⁾ 흰쥐는 비교적 짧은 임신기간(18일)과 번식이 빠르고 수정 후 형질의 발달이 빠르게 일어나며, 저렴한 비용으로 쉽게 구입할 수 있고 사육이 쉬워 포유류 이관의 형태학적 연구, 특히 발생학적 연구에 매우 유용한 실험 동물이다.
   일반적으로 받아들여지고 있는 이관과 중이강의 발생과정의 기전은 전장(foregut)의 돌출에 의해 생기는 제 1인두낭(pharyngeal pouch)을 싸는 내배엽(endoderm)종말부의 확장에 기인하며, 즉 제 1인두낭으로부터 이관고실와(tubotympanic recess)가 형성되고 이관고실와의 부위는 병목형태의 협착이 일어나게 되며, 이중간부위의 협착부가 늘어나서 이관이 되고 이관외측의 맹관은 확장되어 평평한 중이강을 형성한다고 받아들여져 왔다.¹³⁾
   흰쥐 이관 발생시 이관연골, 탄력섬유 및 교원섬유의 발현을 살펴보면 흰쥐를 이용한 본 연구에서 생후 7일 이후에 이관연골, 탄력섬유 및 교원섬유의 발달이 본격적으로 진행됨을 알 수 있었다. 이관연골, 탄력섬유 및 교원섬유의 미성숙 및 미발달로 인한 형태구조학적인 문제로 인해 생후 7일 이전에는 이관의 기능에 장애가 있을 가능성이 높을 것으로 사료되며 따라서 중이염의 발생빈도가 높을 것으로 예측된다. 인간에서는 이관이 일반적인 성인의 형태와 기능을 갖추는 시기를 7~8세 전후로 보고 있고 완전한 발육은 18~19세에 도달하는 것으로 알려져 있듯이,⁴⁾ 인간에 있어서도 영유아시기에 중이염이 호발하는 원인을 주로 이관의 기능 장애로 생각하고 있는데 본 실험을 통해 영유아시기에 중이염이 호발하는 더 구체적인 원인이, 이관이 어른보다 더 짧고, 더 수평적이고 더 넓은 해부학적인 원인 이외에도 이관연골, 탄력섬유 및 교원섬유의 형태학적 미성숙 및 미발달에 기인한 것으로도 유추해 볼 수 있으리라 생각한다.
   이관에서 이러한 탄력섬유분해효소와 항탄력섬유분해효소 사이의 대등한 균형이 무너질 때 탄력섬유가 파괴되어 이관의 신속한 잠귐장치의 손상을 일으켜 이관의 중요한 3대 기능 중의 하나인 비인강으로부터 중이강의 보호방어 기능이 손상되어 중이염이 초래될 수 있다는 개념하에 탄력섬유분해효소(elastase)와 항탄력섬유분해효소(α1-antitrypsin)의 균형이 매우 중요하리라 생각된다.
   α1-antitrypsin은 인간의 호흡기에서 주요한 항단백분해효소이므로 부족시에는 조기에 시작되는 점진적인 기도의 파괴를 일으킬 수 있으나 건강한 상태에서는 탄력섬유분해효소(elastase)가 분비되어도 자연적으로 존재하는 α1-antitrypsin 보호 때문에 거의 손상을 받지 않는 것으로 알려져 있다. α1-antitrypsin과 같은 항단백분해효소들은 비점막의 장액세포에 다량 선택적으로 존재하며 비분비액 전체 단백질 중 가장 중요한 부분을 차지하고 있으며 기관, 기관지, 비갑개점막, 상악동의 점막하 선조직의 장액세포에서 국소화 되어 분포하는 것으로 알려져 왔으나^{6)7)8)9)10)11)12)13)14)} 최근의 연구에서는 이관의 상피층에도 α1-antitrypsin이 분포한다는 것이 밝혀졌고,¹⁷⁾ 본 실험을 통하여 임신 16일경부터 이관에서 α1-antitrypsin에 대한 양성소견이 관찰되기 시작하여 생후 점차 강하게 염색되는 것을 확인할 수 있었는데 이는 α1-antitrypsin이 출생 전부터 이관의 탄성구조를 유지하는데 중요한 역할을 함을 알 수 있었다.

결     론

   저자들은 흰쥐를 이용하여 이관의 발생과 성장시 이관연골, 탄력섬유 및 교원섬유의 발현과 α1-antitrypsin의 발현을 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
   1) 탄성구조는 상피세포의 비해 발생이 늦음을 알 수 있었고 주로 생후 7일부터 형태학적으로 성숙된 연골의 형태가 관찰되었고 탄력섬유나 교원섬유 역시 비슷한 시기에 성숙된 발현을 보였다.
   2) 항탄력섬유분해효소인 α1-antitrypsin은 임신 16일 경부터 나타나기 시작하여 생후 점점 더 양이 증가함을 확인할 수 있었다.
   이상의 결과로 이관 발생과 성장은 상피세포, 연골 및 탄성구조가 각각 다른 시기에 형태학적으로 일어남을 알 수 있었고, 생후 일정기간 동안에는 정상적인 이관기능을 하지 못할 것으로 생각된다. 따라서 이 시기 동안의 이관 탄성구조의 미발달은 중이염의 높은 빈도와 밀접한 연관이 있을 것으로 사료되며, 본 연구는 향후 이관기능부전 및 중이염의 발병기전에 대한 형태학적 연구에 많은 도움을 주리라 생각한다.

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