교신저자：정민교, 301-723 대전광역시 중구 대흥2동 520-2  가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   삼출성 중이염의 원인은 여러 가지 인자들로 인하여 발병하며 그 중 알레르기가 한 원인으로 작용하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 알레르기가 이관의 기능부전을 야기하여 2차적으로 삼출성 중이염을 발생시키는 기전 외에 중이점막이 알레르기 반응의 직접적인 쇽 기관으로 작용하는 기전에 대해서는 아직 논란이 있다.¹⁾ 
   한편, 삼출성 중이염 환자의 중이저류액에서 interleukin (IL)-1β, IL-2, TNF-α, IFN-γ, IL-6, IL-7, IL-8 등의 cytokine들의 존재가 확인되어 삼출성 중이염의 중요한 매개체로서 작용하리라고 알려져 있다.^1)2)3)4) 알레르기 면역반응 중 Th2 반응에서 주로 분비되어 작용하는 IL-4의 중이 저류액내의 존재가 보고되고 있으나,³⁾⁵⁾ IL-4 외에 Th2형의 T 림프구에서 주로 분비되는 cytokine들 중 IL-5, IL-10, IL-13을 중이 저류액에서 측정한 보고는 아직 없다.
   따라서, 이들 cytokine들이 알레르기를 동반한 삼출성 중이염 환자의 중이 저류액내에서 알레르기를 동반하지 않은 환자의 중이 저류액내에 비하여 검출 혹은 높은 농도로 존재하는 지를 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 방법으로 비교하여 알레르기 환자에 있어 삼출성 중이염의 병인기전을 좀 더 규명하고자 하였다.

재료 및 방법

   2002년 4월부터 8월까지 가톨릭의과대학 부속 대전성모병원에서 3개월 이상 지속된 만성 삼출성 중이염 혹은 삼출성 중이염 환자로서 이학적 검사상 점액성 삼출성 중이염의 고막 소견을 보여 환기관 삽입술의 적응이 되었던 42명의 환자를 대상으로 가톨릭중앙의료원 임상연구관리 규정을 준수하여 진행하였다. 조사 기간 동안 환기관 삽입술을 시행하였던 42명의 환자 중 총 IgE는 증가되어 있었으나 특이항원에 대한 양성반응을 보이지 않은 환자 13명을 제외하고 29명의 30귀가 대상이 되었다. 29명의 남녀비는 21：8이었으며 평균연령은 8세이었다. 이 중 알레르기 양성군은 10명, 11귀이었으며 남녀비 8：2, 평균연령 9.4세이었다. 알레르기 음성군은 19명, 19귀이었으며 남녀비 13：6, 평균연령 7.3세이었다.

알레르기 검사
   환기관 삽입술을 시행하기로 결정한 모든 환자들에 대해 수술 전 MAST-CLA(multiple allergosorbent test-chemiluminescent assay) 검사를 시행하여 환자 혈청내의 총 IgE와 한국형 패널 35종의 알레르기 항원들에 대한 특이 IgE를 반정량하였다. 검사를 위한 기기로서 CLA-1 chemiluminescent analyzer(Hitachi Chemical Diagnotics Inc., Mountain View, CA)를 이용하였으며 제작사의 용법대로 각 항원이 부착되어 있는 MAST pette chamber에 환자의 혈청을 채워 실온에서 16~24시간 반응시킨 후 완충용액으로 3회 세척하고, horseradish peroxidase가 부착된 항 IgE 항체용액을 넣어 실온에서 4시간 반응시키고 완충용액으로 3회 세척한 후, 화학발광물질(photoreagent)과 10분간 반응시켜 발광측정기(luminometer)로 측정한 발광도에 따라 각 항원에 대하여 class 0부터 4까지로 판정하고 class 2 이상을 알레르기 양성으로 정의하였다.

중이 저류액의 채취
   삼출성 중이염 환자들에 대한 환기관 삽입 시 이들의 외이도를 알콜로 수차례 세척한 후 Juhn Tym Taps(Xomed Products, Jacksonville, FL)를 사용하여 중이저류액을 무균적으로 채취하였다. 채취한 저류액에 0.1 M 인산염 완충식염수 1.5 ml을 가하여 진탕한 후 4°C, 15000 rpm으로 20분간 원심분리하여 얻은 상층액을 ELISA를 시행하기까지 -70°C 냉동고에 보관하였다.

중이 저류액내 총 단백질과 cytokine의 정량 
   중이저류액은 점도가 높기 때문에 농도 및 용량을 측정하기 곤란하여 먼저 bicinochoninic acid(BCA) 방법⁶⁾으로 BCA protein assay reagent kit(Pierce Chemical Co., Rockford, IL)를 사용하여 저류액내의 총 단백질량을 측정하였다. 방법은 제작사의 용법대로 BCA 용액과 표준용액(소혈청 알부민；0.025, 0.125, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2 mg/ml)을 37°C에서 30분간 반응시키고 562 nm에서의 흡광도를 측정하여 표준곡선을 구한 후, 각 저류액 0.1 ml과 2 ml의 BCA 용액을 역시 37°C에서 30분간 반응시키고 562 nm에서 측정한 흡광도 값을 표준곡선에 대입하여 총 단백질의 농도를 구하였다.
   Cytokine의 정량은 시판되는 각 cytokine에 대한 ELISA kit(Pierce Chemical Co., Rockford, IL)를 이용하였다. 제작사의 용법에 따라 well에 표준곡선을 그리기 위해 각 2.5배씩 희석한 표준 재조합 cytokine과 저류액 표본 각 50 μl를 첨가하여 실온에서 2시간 반응시킨 후 완충액으로 세척하고 horseradish peroxidase가 부착된 이차항체를 첨가하여 실온에서 30분 반응시켰다. 다시 3회 세척 후 기질 용액을 넣어 실온에서 30분간 반응시키고 중지용액을 첨가하여 반응을 중지시킨 후 ELISA reader(Model 550 Microplate Reader, Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA)를 이용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 이어 표준 재조합 cytokine의 각 농도별 흡광도 값으로 표준곡선을 그린 다음, 각 저류액 표본의 흡광도 값을 표준곡선에 대입하여 cytokine의 농도를 측정하였다.

결과 분석
   점도와 부피가 상이한 각 중이 저류액를 희석하여 ELISA 방법으로 측정한 각 cytokine의 농도(pg/ml)를 BCA 검사로 측정한 중이 저류액내의 총단백질 농도(mg/ml)로 나누어 단위가 cytokine의 pg/총단백질의 mg(pg/mg)이 되도록 정량하였다.²⁾⁵⁾ MAST 검사에서 양성, 총 IgE가 증가된 군을 알레르기 양성군으로 MAST 검사에서 음성, 총 IgE의 증가가 없는 군을 알레르기 음성군으로 하였다. 이렇게 알레르기 양성군과 음성군에서 정량화한 각 cytokine의 측정치를 Mann-Whitney U test를 사용하여 비교분석 하였으며 아울러 각 군에서 각 cytokine이 검출되는 빈도는 χ² test 및 Fisher’s exact test를 이용하여 비교분석 하였다. 통계 프로그램은 SPSS version 10.0을 이용하였다.

결     과 

   알레르기 양성군에서 MAST 양성으로 판독된 특이항원은 호밀 꽃가루에 MAST 양성이었던 1명의 환자를 제외하고는 모두 아메리카 집먼지진드기(D. pteronyssinus)이거나 유럽 집먼지진드기(D. farinae)이었다.
   저류액 표본들에서 ELISA로 일정 농도값이 측정되었던 각 cytokine의 검출율은 IL-5에서 알레르기 양성군 54.5%(6/11), 알레르기 음성군 57.8%(11/19), IL-10에서 알레르기 양성군 90.9%(10/11), 알레르기 음성군 94.7%(18/19), IL-13에서 알레르기 양성군 90.9%(10/11), 알레르기 음성군 100%(19/19)로서 통계적으로 유의한 차이는 모두에서 인정되지 않았다(Fig. 1).
   저류액 표본내 총단백질 속에 함유된 cytokine의 양으로 환산하여 측정한 각 cytokine의 농도(Figs. 2 and 3)는 IL-5가 알레르기 양성군에서 0.28±0.33 pg/mg, 음성군에서 0.20±0.39 pg/mg으로 두 군간에 유의한 차이가 없었으며, IL-10은 각각 3.23±3.99 pg/mg과 6.17±8.03 pg/mg로 알레르기 음성군에서 유의하게 높았으며(p=0.019), IL-13도 각각 0.20±0.27 pg/mg과 0.82±0.77 pg/mg으로 알레르기 음성군에서 유의하게 높았다(p=0.006).

고     찰

   알레르기와 삼출성 중이염의 연관성에 있어 Yamashita 등⁷⁾은 일반 모집단의 코알레르기 이환율 17%에 비하여 삼출성 중이염 환자의 50% 이상이 코알레르기에 이환되어 있다고 보고하였으며, Tomogawa 등⁸⁾은 일반 모집단의 삼출성 중이염의 이환율 6%에 비하여 코알레르기 환자 21%가 삼출성 중이염에 이환되어 있음을 보고하는 등 알레르기는 삼출성 중이염의 원인인자로 알려져 있다. 
   알레르기가 삼출성 중이염의 병인에 기여하는 기전으로는 1) 중이점막이 알레르기에 대한 쇽 기관으로 직접 작용하거나 2) 이관의 염증성 부종에 의한 폐쇄 3) 코나 비인두의 염증성 폐색 4) 세균이 함유된 알레르기성 비인두 분비물이 이관으로 역류하여 중이염을 유발할 수 있을 것으로 추측하고 있으며⁹⁾ 후자의 세 가지 원인기전은 모두 이관의 기능부전과 관계 있다.
   중이점막이 쇽 기관으로 직접 작용할 것이라는 가설에 대하여는 아직 논란이 있으나 이를 뒷받침하여 알레르기를 동반한 삼출성 중이염의 중이 저류액에서 호산구의 활성에 대한 지표로서 호산구 양이온 단백질(ECP)이 높은 농도로 존재함과 중이 점막에서 면역화학염색방법으로 증명한 ECP의 존재함이 보고되었다.¹⁰⁾ 또한 Hurst 등¹¹⁾은 알레르기를 동반한 중이저류액에서 특이 IgE가 검출되나 혈청에 존재하는 항체 종류의 30%만이 저류액에서 발견되고 혈청과 저류액에서 측정된 특이 항원의 농도간에 상관성이 없다 하였으며, Wright 등¹²⁾은 아토피 환자의 중이점막에서 면역화학염색방법과 in situ hybridization의 방법으로 호산구에서 분비된 major basic protein(MBP)와 IL-5 mRNA 의 상승된 표현을 보고하여 삼출성 중이염에 있어 중이에서 능동적인 알레르기의 반응이 일어난다고 추론하였다.
   반면 중이점막이 알레르기의 표적 기관으로서 작용한다는 보고에 반하여, Doyle 등¹³⁾은 16마리의 rhesus 원숭이를 알레르기를 가진 인간 혈청으로 수동면역하여 꽃가루 항원을 코와 이관을 통해 주입하고 삼출액의 형성 및 조직학적 관찰을 하였으나 삼출성 중이염이나 염증반응의 형성을 관찰할 수 없다 하였다. Mogi 등¹⁴⁾은 기니픽에게 IgE 항체 혈청으로 수동면역 시킨 후 중이강내 면역복합체와 비강내 알레르기 항원을 병행 투여하는 경우 삼출성 중이염이 지속되지만 비강내 알레르기 항원을 투여하지 않으면 삼출성 중이염이 7~9일내에 자연 소멸함을 관찰하여 IgE 매개성 알레르기 반응이 삼출성 중이염의 발생보다는 중이염의 만성화에 기여한다 하였다. Bernstein¹⁵⁾도 중이점막 자체가 알레르기의 표적 기관이 되는 경우는 드물며, 코와 비인두 점막내의 호염기구와 비만세포에서 분비된 염증 매개체들이 코의 점액섬모 수송체계에 의해 이관의 비인두 개구부에 작용하여 이관부의 부종과 염증을 유발하고 바이러스와 세균감염에 의해 시작된 삼출성 중이염의 만성화에 기여한다고 보고하였다. 
   한편, Mossmann 등¹⁶⁾은 생쥐에서 T-helper 림프구를 그 세포로부터 분비되는 cytokine의 종류에 따라 IL-2, Interferon-gamma, Tumor necrotic factor-beta를 생산하는 Th1형 림프구와 IL-4, IL-5, IL-6, IL-10을 생산하는 Th2형 림프구로 구분하였다. 인체에서 이러한 2분법이 엄격하게 적용되는 것은 아니며 IL-9, IL-13도 Th2형 림프구에서 주로 분비된다.¹⁷⁾ Lee 등¹⁸⁾의 연구결과에 의하면 알레르기에서는 주로 Th2형 세포활성물질이 증가하는 것으로 알려져 있으며, 이들 Th2 cytokine들 중 Jang⁵⁾이 알레르기 환자의 중이 저류액에서 알레르기 음성 환자들에 비해 IL-4와 IL-6가 상승된 농도로 발견됨을 보고하였으나, Park 등⁴⁾은 알레르기 유무를 구분하지 않은 22명 환자의 중이 저류액내에서 IL-4 mRNA의 발현을 발견하지 못하였다. Jang⁵⁾이 알레르기 음성군의 저류액에서도 ELISA 방법으로 61.5%의 환자에서 IL-4를 검출한 것과는 상반된 결과라 하겠다. 
   de Waal Malefyt 등¹⁹⁾은 IL-10이 lipopolysaccharide(LPS)의 자극에 의해 활성화된 단핵구에서 높은 농도로 분비되어 class II 주조직적합체(MHC) 발현 및 IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, GM-CSF와 같은 proinflammatory cytokine들의 생산을 하향 조절한다고 하였다. 따라서 본 연구에서 알레르기 음성군에서 IL-10이 유의하게 높은 농도로 측정된 것은 분비된 IL-10의 근원이 Th2 세포보다는 세균 내독소와 같은 자극에 의해 단핵구 내지 활성화된 대식세포인 것으로 추정된다. 이에 대해서는 향후 알레르기를 유발한 동물이나 수술 중 얻은 알레르기 환자의 중이점막으로 in situ hybridization을 시행하고 대조군과 비교하는 방법으로 증명이 필요할 것이다.
   Borish와 Rosenwasser¹⁷⁾에 의하면 IL-13은 IL-4와 약 30%의 동질성(homology)을 가지며 단핵식세포와 B세포에 대한 비슷한 생물학적 작용을 가져 단핵구 매개성 ADCC, proinflammatory cytokine 생산, nitric oxide 분비를 억제하고 IgE isotype switch와 VCAM-1 발현은 유도한다. IL-13은 IL-4와 마찬가지로 비만세포와 Th2 림프구에서 주로 분비되지만 Th1 림프구에서도 분비되므로 본 연구에서 알레르기 음성군에서 IL-13의 농도가 유의하게 높게 측정된 것은 알레르기 음성군에서 proinflammatory cytokine 생산의 억제와 같은 항염 작용이 알레르기 양성군에 비해 우세한 것으로 추정된다.
   IL-5는 후기 알레르기 염증반응에 관여하는 호산구의 성장과 성숙을 조절한다. 단핵 식세포나 Th1 림프구에서도 분비되는 IL-10, IL-13과는 달리 IL-5는 비반세포와 Th2 림프구에서만 분비되므로,¹⁷⁾ 본 연구에서 알레르기 면역반응의 정도를 좀 더 직접적으로 반영하는 지표로 생각할 수 있으나 본 연구에서는 알레르기 양성군과 음성군간에 검출률과 농도에 있어 유의한 차이를 발견할 수 없었다. 이와 연관하여 Hebda 등²⁰⁾의 연구결과를 참조하면, 이들은 이관만을 폐색시킨 쥐들과 이관 폐색과 더불어 폐렴구균을 중이강내 투여한 쥐들에서 모두 삼출성 중이염을 유발하고 쥐들의 삼출액에서 TNF-α, IL-6, IL-10 등의 cytokine들을 ELISA 방법으로 측정하고 중이점막에서는 이들 cytokine들의 mRNA 발현을 측정하였다. 이들은 폐렴구균을 투여한 군의 초기 삼출액 내에서 cytokine들의 농도가 높았으나 실험 경과 8주경에는 삼출성 중이염이 유지된 상태에서 삼출액내에서 cytokine은 모두 검출되지 않고 중이점막에서의 mRNA 발현율은 이관 폐색군 및 폐렴구균 투여군에서 상향 조절되어 있다고 보고하였다. 이들은 이관만을 폐색시킨 군에서 중이강내 음압에 의한 삼출액의 형성 이외에도 세포 매개 반응에 의해 중이염이 만성화되며 점막에서 상향 조절된 cytokine들의 활성이 주로 점막하 수준에 작용하며 중이강내로 빠져나오는 cytokine의 양은 적을 것으로 유추해석 하였다. Hebda 등²⁰⁾의 연구결과와 함께 Wright 등¹²⁾이 보고한 아토피 환자의 중이점막에서 IL-5 mRNA 발현의 상향 조절 결과를 참조하면, 본 연구에서 중이저류액내 IL-5의 검출 및 농도가 알레르기 양성군에서 유의한 차이를 보이지 않은 것은 IL-5가 중이점막에서는 유전자 발현이 상향 조절되어 있으나 점막하층에서 IL-5가 주로 작용하여 중이강내 농도에서 유의한 차이를 보이지 않거나, 혹은 환자의 알레르기 반응이 중이점막에서보다 이관의 비인두 개구부쪽에 좀 더 기여하는 것으로 유추된다.

결     론

   본 연구 결과에서 삼출성 중이염의 병인에 있어 알레르기 반응이 중이점막을 표적기관으로 하여 좀 더 기여하는 지, 혹은 이관쪽에 미치는 영향이 좀 더 큰 지는 해석할 수가 없다. 그러나, 알레르기 음성군에서 IL-10, IL-13의 농도가 유의하게 높았던 결과는 알레르기 음성군이 바이러스나 세균성 감염 등의 원인으로 삼출성 중이염이 발병되어 이에 반한 방어적 항염작용이 알레르기 양성군에 비해 우세하거나, 적어도 알레르기 양성군과 음성군간에 중이에서 일어나는 발병 및 세포면역반응 기전에 차이가 존재함을 제시하는 것으로 유추된다. IL-10에 대하여는 향후 알레르기 양성군과 음성군의 중이점막으로 in situ hybridization을 시행하여 IL-10를 분비하는 세포에 근원적 차이가 있는 지를 증명할 필요가 있을 것이다.

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