교신저자：홍기환, 561-712 전북 전주시 덕진구 금암동 634-18  전북대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   c-myb이 원발암유전자(protooncogene)로 알려진 초기에는 주로 혈구세포의 성장과 분화에 관한 기능을 수행하는 것으로 알려졌으나 급성 골수성 백혈병에서 c-myb의 과잉 발현이 보고되어 c-myb이 백혈병의 발생에도 중요한 역할을 수행 할 것으로 생각되었다.¹⁾ 그 외 c-myb이 발현되는 조직으로는 신경망막(neurorentina), 평활근육, 장관계 세포에서도 발현이 되고 있어, 이들 조직의 성장과도 밀접한 관련성이 있는 것으로 알려졌다.²⁾
   최근에는 대장암, 유방암, 신경모세포종, 소세포성 폐암 등 여러 암에서도 c-myb의 과잉 발현이 보고되었다.³⁾ 이는 c-myb이 백혈병 세포의 주된 성장 기능이외에 여러 암의 성장에도 중요한 작용을 수행하고 있음을 시사한다. 따라서 c-myb이 과잉 발현되는 여러 암에서 c-myb 암유전자의 기능을 억제시키는 것이 암 세포의 성장을 조절하는 효과적인 치료 방법이 될 수 있을 것으로 사료된다. 암유전자의 기능을 제어시키는 antisense 치료 전략의 단점을 보완 할 수 있는 방법으로 특정 유전자에 대한 dominant negative 전략이 최근에 많이 시도되었으며, dominant oncogene의 기능을 저하시키면 암세포의 apoptosis 유도가 가능하여 이를 이용한 치료적 가능성이 보고되었다.⁴⁾
   현재까지 두경부종양과 관련하여 발암유전자 c-myb의 관련 보고가 거의 없지만 만약 다른 종양처럼 c-myb이 두경부종양의 성장을 유도한다면 c-myb의 제어에 의한 두경부종양의 분자적 치료 접근이 가능할 것으로 사료되어 본 연구에서는 두경부종양에서 c-myb의 발현과 두경부종양 세포주에서 dominant negative c-myb(DN-myb)에 의한 apoptosis의 기전을 연구하여 이를 근거로 adenovirus-mediated DN-myb를 이용한 두경부종양의 유전자치료의 가능성을 알아보고자 하였다.

방     법

두경부종양 세포 SNU-1076의 배양
   두경부종양 세포주는 한국 세포주 은행으로부터 분양 받은 SNU-1076 세포주를 실험에 사용하였다. 이 세포주의 특성은 한국인의 후두암 환자로부터 분리된 잘 분화된 편평상피세포암으로 정상 p53과 변이된 p16를 가지고 있다. 
   세포 배양액은 RPMI-1640(Life Technologies, Grand Island, NY, USA) 배지에 56℃에서 30분간 가열하여 비 활성화시킨 우태아 혈청(FBS, Hyclone, Logan, Utah, USA)을 10%, penicillin(100 unit/ml)과 streptomycin(100 μg/ml) 및 2 mM L-glutamate를 첨가하여 조제하였다. 세포주는 위의 배양액을 사용하여 37℃, 95% 습도, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였고, 통상적으로 세포가 서로 융합되기 직전인 3~4일 간격으로 계대 배양을 하였으며, 실험에는 총 30 계대 이하인 세포만을 사용하였다.

두경부종양 조직 및 배양세포에서 RNA 분리 
   배양시킨 두경부종양 세포주와 직접 두경부종양 환자의 조직으로부터 RNA를 분리하였다. 세포주로는 Trizol^®(Gibco-BRL, NY, USA)을 사용하였으며, 조직은 TRI reagent^®(MRC, molecular research center)를 사용하여 분리하였다. 세포주는 바이러스 감염 및 자극을 시킨 후 100 mm 배양용기에 1 ml Trizol를 첨가 후 강하게 교반하였고, 실온에서 5분간 세포를 용해시켜 RNA를 노출 시켰다. 조직은 100 mg에 1 ml의 TRI reagent를 첨가하여 조직분쇄기(homogenizer)를 이용하여 5,000 rpm에서 30초 이상 조직을 완전 분쇄시켰다. 용해 물질과 분쇄된 조직을 새로운 튜브에 옮겨 상온에서 5분간 방치시키고, 200 μl의 클로로포름을 첨가하여 강하게 섞었다. 이후 15분간 상온에 방치시킨 후 4℃, 13,000 rpm에서 15분간 원심분리시켜, 새로운 튜브에 상층액만 취하였다. 0.5 ml 아이소프로판올를 첨가하여, 실온에서 10분간 방치시키고 4℃, 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 침전된 RNA를 75% 에탄올로 세척하였다. 그 다음 상온에서 방치하여 말린 후, DEPC를 처리한 3차 증류수에 녹여서 농도를 측정한 후 -70℃에 보관하였다.

역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 

cDNA 합성 
   분리한 RNA에 대한 cDNA합성은 Promega(Madison, WI, USA)사의 cDNA합성 kit를 사용하였다. 즉 동일량의 total RNA(2 μg)를 DEPC 처리된 3차 증류수에 넣어 총 8 μl를 만든 후 65℃에 5분간 배양 후 얼음에 넣고, 5× reaction mixture(50 mM Tris-HCl, pH 8.3, 75 mM KCl, 3 M MgCl₂) 4 μl, 0.1 M DTT 2 μl, 500 μM dNTP 2 μl, 100 μM random primer 2 μl, recombinant RNase inhibitor, 50 U/μl 0.6 μl, 역전사중합요소(M-MLV reverse transcriptase 200 U/μl) 1 μl를 첨가하여 잘 섞은 후 42℃에서 60분간 반응시켜 cDNA를 합성하고 95℃에서 10분간 반응시켜 합성을 중지 시켰다.

중합효소 연쇄반응
   c-myb, bcl-2, IGF-II, VEGF의 발현 분석에 사용된 시발체(primer)는 사람의 각 유전자 cDNA의 염기서열에 근거하여 제작하였고 각각의 시발체의 염기서열과 annealing 온도를 Table 1에 나타내었다. 증폭시킬 cDNA 2 μl 에 10× reaction buffer 5 μl, 250 μM dNTP mixture 5 μl, MgCl2 3 μl, 5’와 3’시발체 각 10 pmol, Taq-polymerase(0.25 μl, 5 U/1 μl) 및 증류수를 가하여 총 50 μl 을 만들었다. 중합효소 연쇄반응 조건은 95℃에서 5분간 변성시킨 후 94℃에서 1분간 변성반응(denaturation), 각각의 annealing 온도에서 1분간 결합반응(annealing), 72℃에서 1분간 연장반응(extension)을 30회 반복하였다. 증폭된 DNA중 10 μl 를 취해 1.5% 한천 겔에서 전기영동 하였다. 정량 분석 기준은 β-actin(661 bp)에 대한 중합효소반응을 동시에 실시하여 이를 기준으로 비교 분석하였다.

DN-myb 유전자 제작
   사람의 c-myb 유전자의 아미노기 영역으로부터 DNA 결합영역을 포함한 약 200개의 아미노산 영역을 c-myb cDNA로부터 분리하여 발현벡터인 pcDNA3 벡터에 재조합하여 DN-myb 유전자를 제작하였다. DN-myb 단백질의 발현과 세포내의 존재를 검토하기 위해 표식 유전자가 있는 발현벡터인 pEGFP-N(enhanced green fluorescent protein, Clontech) 벡터에 ORF(open reading frame)에 맞도록 재조합시켰다. 재조합 유전자는 두경부종양 세포주 SNU-1076에 calcium phosphate 법(Promega, Madison, WI, USA)으로 도입시키고, 세포 내 융합단백질의 발현은 도입 3일 후 형광현미경으로 관찰하였다.

DN-myb 아데노바이러스(Ad/DN-myb) 제작
   아데노바이러스의 제작은 AdEasy system(Quantum Biotech., Montreal, Canada)의 회사 방법에 준하여 제작하였다. Ad/DN-myb 아데노바이러스의 구조는 E1이 대치된 아데노바이러스 5 벡터안에 c-myb의 DNA 결합 영역과 표식 유전자인 GFP만을 삽입시켰다. 삽입된 벡터는 pAdEasy-1 바이러스 벡터와 대장균 BJ5183에서 동종 재조합(homologous recombination)을 시켰다. 재조합이 이루어진 균주로부터 DNA를 분리하여 대장균 DH5α에 형질전환시켜서 다량의 재조합 DN-myb을 정제하였다. 이를 제한효소 Pac1으로 절단시키고 QBI-293A packaging cell에 calcium phosphate 방법으로 도입시킨 후 2주일 전후에 형성된 플라크를 확인하였다. 플라크가 형성된 배양용기로부터 바이러스 DNA를 분리한 후 DN-myb 영역을 PCR로 확인하였다. QBI-293A 세포에 재증식시키고, CsCL density purification을 시행하여 투석시킨 후 10% 글리세롤이 함유된 투석 완충액(10 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl₂)에 -80℃로 저장하였다. 두경부종양 세포 SNU-1076에 바이러스를 10, 50, 100 MOI(multiplicity of infection, number of active virus particle/cell number)로 감염시켰으며, 감염은 우태아 혈청이 함유되지 않는 배양액에 5분 간격으로 흔들어주면서 37℃에서 1시간 시켰다.

³H-thymidine incorporation assay
   대수기 증식 상태의 세포(100 mm plate)에 100 MOI의 Ad/DN-myb 아데노바이러스를 감염시키고, 감염 4시간 후 이들 세포를 96 well plate의 각 well에 약 1,000개씩 분주하였다. 바이러스 감염 후 24, 48, 72시간에 세포의 성장을 ³H-thymidine으로 측정하였다. Well 당 1 μCi의 ³H- thymidine(New England Nuclear, Boston, MA. USA)을 첨가하고 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 4시간 동안 배양시켰다. 상층액을 제거시키고 트립신을 처리하여 세포를 부유시켰으며, 부유된 세포를 cell harvester(Skatron Inc, Model No 11019, Norway)를 사용하여 증류수로 세척하면서 세포를 glass fiber filter(Skatron Inc, Norway)에 수거하였다. Filter disc를 scintillation vial에 넣고 60℃ dry oven 내에서 완전히 건조시킨 후 toluene cocktail을 2.5 ml씩 가하고, β-scintillation counter(Liquid scintillation analyzer, PACKARD)를 이용하여 흡수된 방사능을 측정하였다. 모든 실험은 삼중복으로(triplicately) 시행하였다.

Western blot analysis
   서로 융합되기 직전의 세포에 100 MOI 아데노바이러스를 감염시킨 후 실험 시간에 도달하면 세척 후 전체 세포의 용해질로부터 세포 단백질을 제조하였다. 즉 세포를 2~3회 차가운 phosphate buffered saline(PBS)로 세척 후 100 mm 배양용기에 1 ml의 PBS-TDS(1×PBS, 1% Triton X-100, 0.05% sodium deoxycholate, 0.01% SDS, 0.5 μg/ml leupeptin, 1 mM EDTA, 1 μg/ml pepstatin, 0.2 mM PMSF) 용액을 첨가, 15분간 얼음 위에서 방치 후 13,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포막 성분 등을 제거하였으며, 단백질 농도는 BSA(bovine serum albumin)를 표준화하여 Bio-Rad Protein Assay Kit(BIO-RAD Co.)를 사용하여 정량하였다. 10 μg 의 단백질을 7.5% mini gel SDS-PAGE(poly acrylamide gel electrophoresis)로 변성 분리하였고, 이를 nitrocellulose membrane(Hybond-C Amersham Co.)에 60 V로 2 시간동안 전기영동하였다. Membrane의 blocking은 5% skim milk가 함유된 TBS(PBS+0.1% Tween 20)용액에서 상온에서 1시간동안 실시하였다. 측정하고자 하는 유전자의 단백질의 발현 양을 검토하기 위한 1차 항체로는 Akt 항체(phospho-Akt(ser 473), #9276S, #9272, Cell Signaling, Beverly, MA, USA), bcl-2 항체(sc-7382, Santa Cruiz, santa cruiz CA, USA), c-myb 항체(sc-7487, Santa Cruiz, santa cruiz CA, USA)를 1：1000으로 TBS 용액에 희석하여 상온에서 1시간 반응시킨 후 TBS로 3회 세척하였다. 2차 항체로는 HRP(horse radish peroxidase)가 결합된 anti-mouse IgG 혹은 anti-rabbit IgG(Amersham Co.)를 1：5000으로 희석하여 상온에서 1시간 반응하였다. TBS로 3회 세정 후 ECL 기질(Amersham Co.)과 1분 30초간 반응 후 X-Ray 필름에 감광시켰다.

DNA fragmentation
   세포에 Ad/DN-myb 바이러스를 감염시킨 후 다음날 항암제 etoposide 1 μM을 3 시간 반응시킨 후 24, 48시간에 1×10 6 세포를 2~3회 차가운 PBS로 세척 후 1 ml의 용해 완충액(10 mM Tris-HCl pH7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS)를 첨가하여 얼음에서 15분간 용해시킨 후, 세포 찌꺼기를 1,3000 rpm에서 원심 제거하였다. 상층의 용해질을 2회 페놀/클로르포름으로 추출 후 에탄올로 DNA를 침전시켰고, 2 μg의 Rnase A가 함유된 TE 용액에 녹인 후 2% 한천 겔에서 전기영동하였다.

통계처리
   통계 방법 처리는 Student's t-test를 사용하여 P값을 구하였으며 P값은 0.05 미만일 때 통계학적인 유의성을 인정하였다.

결     과

Ad/DN-myb 아데노바이러스에 의한 DN-myb의 발현
   Myb 단백질은 DNA 결합 영역(DNA binding domain), 전사활성 영역(transcription activation domain), 음성 조절 영역(negative regulation domain) 세 개의 영역으로 구성되어 있다(Fig. 1A). 본 연구에서는 c-myb 단백질이 염기서열 특이 영역(sequence specific domain)에 결합은 가능케 하면서 기타 활성부위가 제거되어 결국 정상 c-myb의 기능을 억제시키고자 c-myb의 아미노기 말단으로부터 DNA 결합부위까지의 유전자를 선택하여 DN-myb 유전자를 제작하였다(Fig. 1B). 아데노바이러스를 제작하기 위하여 DN- myb 유전자를 pAD 벡터에 재조합 시켰으며, 또한 DN-myb 단백질의 발현 및 세포내 위치를 확인하기 위하여 GFP 단백질과 융합시켰다. 두경부종양 세포에서의 DN-myb의 발현부위는 주로 세포의 핵으로 c-myb과 분자간의 경합 부위가 핵내로 확인되었다(결과 미기재). DN-myb 유전자의 도입 및 아데노바이러스에 의한 외래 유전자의 발현을 확인하기 위하여 두경부종양 세포 SNU-1076에 표식 유전자인 GFP만 도입된 대조 아데노바이러스(Ad/GFP)를 50, 100 MOI로 1시간 동안 감염시켜 형광현미경으로 GFP의 발현을 확인하였다(Fig. 1C).

두경부종양 조직에서 c-myb의 발현 
   두경부종양 조직에서 c-myb의 발현을 알아보기 위하여 13예의 두경부종양 환자의 외과적 수술시 얻어진 정상조직과 암조직으로부터 역전사 중합효소 연쇄반응를 수행하여 c-myb의 발현을 검토하였다. 아울러 각각 환자별 조직의 mRNA의 양의 정도는 세포내 구조단백질인 actin의 mRNA양에 대한 중합효소반응을 동시에 실시하여 이를 기준으로 비교 분석하였다. 그 결과 두경부종양 환자 5예를 제외한 8예에서 정상 조직에 비교하여 암조직에서 c-myb의 발현이 증가되었다(Fig. 2).

DN-myb의 발현에 의한 SNU-1076 두경부종양 세포주의 성장 억제
   두경부종양 환자의 암조직 70% 이상에서 c-myb이 정상조직에 비교하여 현저히 발현하였다. 이는 두경부종양에서도 c-myb이 성장을 유도하여 발암과정에 중요한 역할을 할 것으로 추측되어, c-myb의 기능을 저해시키는 DN-myb의 유전자를 SNU-1076에 도입 후 나타나는 성장의 변화를 측정하였다. 대조 Ad/GFP 바이러스 50 MOI를 처리한 세포는 조금씩 성장하였지만, Ad/DN-myb 바이러스 50 MOI 처리세포는 72시간까지 지속적으로 성장이 억제되어 약 60%의 생존율만을 나타내었다(Fig. 3).

DN-myb에 의한 bcl-2 및 c-myb의 발현 억제
   13개의 두경부종양 환자의 조직 시료 중 12예에서 정상 조직에 비교하여 암조직에서 bcl-2 단백 발현이 높게 나타났으며(Fig. 4), 이는 Fig. 2의 c-myb 의 발현 증가와 연관성을 나타내었다. 즉 발암유전자 bcl-2는 c-myb의 전사작용에 의해서 직접 발현이 제어된다. 따라서 DN-myb에 의해서 세포내 c-myb의 전사작용이 저해를 받게되면 bcl-2의 발현은 억제될 것이다. 이를 확인하기 위하여 SNU-1076 세포에 DN-myb의 유전자를 도입한 결과 대조세포에 비해 bcl-2 단백 발현이 현저히 감소하였다(Fig. 5). 또한 DN-myb 발현세포는 c-myb의 전사작용 외에도 단백질 발현을 저하시키고 있었다(Fig. 5).

DN-myb에 의한 SNU-1076 세포의 apoptosis 유도
   DN-myb 유전자는 SNU-1076 세포에서 bcl-2의 발현을 감소시켜 세포의 apoptosis를 유도시키고, 생존율을 저하시키게 될 것이다. 각각의 바이러스를 SNU-1076 세포에 감염시킨 후 다음날 저용량의 항암제 etoposide 1 μM과 5 μM을 3 시간 반응시키고 apoptosis 유도를 조사하였으며, etoposide를 처리한 10일 후 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 성장하는 세포를 관찰한 결과 DN-myb 유전자가 발현된 세포는 대조세포에 비교하여 2배 이상 세포의 apoptosis가 유도되었으며, 특히 etoposide 5 μM 처리세포는 100% 가까운 세포가 생존하지 못하였다(Fig. 6A and B). 이들 생존 억제가 apoptosis에 의한 것인지를 확인하기 위하여 실행한 DNA fragmentation assay에서 이들 세포들은 DNA 단편화가 나타나 apoptosis를 확인 할 수 있었으며, 대조세포에 비하여 DN-myb 유전자 발현세포에서 단편화가 더욱 뚜렷하여 apoptosis가 보다 많이 유도되었다(Fig. 6C). 

DN-myb에 의한 SNU-1076 세포의 발암 기전
   PI-3 kinase에 이은 Akt/PKB의 활성화는 세포의 생존력과 발암기전에 중요한 역할을 하는 것으로 잘 알려져 있다. DN-myb에 의해서 유도되는 apoptosis 경로를 알아보기 위하여 Akt 단백 발현과 Akt/PKB 활성화를 Western immunoblot analysis로 분석하였다. 특히 바이러스 감염 48시간 후에 DN-myb 유전자가 발현된 세포는 대조세포에 비하여 Akt/PKB의 활성화 상태인 인산화가 억제되었다(Fig. 7). DN-myb 유전자가 발현된 세포에서 암의 성장과 진행에 중요한 인자로 알려진 종양 성장인자인 IGF-II가 감소하였고, 또한 암의 전이에 관여하는 VEGF의 발현도 역시 저하되었다(Fig. 8).

고     찰

   특정 유전자의 상보적인 염기서열을 이용하여 유전정보의 흐름을 방해시키는 유전자치료 전략은 세포의 증식이나 형질전환 과정에서 중요한 역할을 하고 있는 발암유전자를 찾아내어 이 유전자의 기능을 파괴시키면 정상세포의 손상 없이 암세포만 선택적으로 죽일 수 있는 전략이다. 이러한 치료 전략 중 dominant negative 전략은 최근 관심의 대상이 되고 있다. 본 연구에서는 유전자의 전달 효율이 높은 DN-myb 유전자의 복제 결함 재조합 아데노바이러스(replication defective recombinant adenovirus, Ad/DN-myb)를 제작하였다. SNU-1076 세포는 형광단백질(GFP)이 삽입된 아데노바이러스를 감염시킨 2일 후 형광현미경으로 관찰 결과 우수한 발현율을 나타내었다(Fig. 1).
   c-myb은 DNA 결합 영역, 전사 활성 영역, 음성 조절 영역, 3개의 기능적인 영역으로 구성되어 있다.⁵⁾ 본 연구에서 시도하는 c-myb에 대한 dominant negative 전략은 3개의 기능 영역중 DNA 결합 영역만을 선별하였다. DNA 결합 영역만이 존재하는 c-myb, 즉 DN-myb은 sequence specific DNA와의 결합은 가능하지만, 기타의 전사조절인자와의 결합이 불가능하기 때문에 실질적인 전사작용이 일어나지 않는다. 또한 외부로부터 DN-myb이 도입되어 다량 발현되기 때문에 암세포내에 존재하는 c-myb이 DNA와 결합을 방해하여 궁극적으로 c-myb의 전사작용을 방해하게 될 것으로 추측된다.
   c-myb과 관련하여 지금까지 보고된 암조직 중에는 대장암, 유방암, 신경모세포종, 소세포성 폐암 등³⁾이 있으나 아직 두경부종양에서 c-myb의 발현 보고가 없다. 따라서 두경부종양과 c-myb과의 발현 관계를 알아본 결과 13예의 두경부종양 환자 조직에서 c-myb이 발현되고 있었으며, 이 중 8예는 정상 조직에 비교하여 종양 조직에서 c-myb이 과잉 발현되고 있었다(Fig. 2). 이는 두경부종양의 진행이나 성장에 있어서 c-myb이 중요한 기능을 할 것으로 사료된다.
   실제로 c-myb 유전자는 두경부종양에서도 매우 높은 발현을 나타내고 있어 두경부종양의 성장과 진행에 관여하고 있음을 의미한다. 이러한 추측의 확인으로 SNU-1076 세포내로 DN-myb 유전자를 이입시켜 c-myb의 발현을 억제시키면 SNU-1076 세포주의 성장이 현저히 억제되었다(Fig. 3). 이는 두경부종양에서도 c-myb이 성장을 증가시키는 dominant oncogene으로써 가능성이 시사된다.
   두경부종양 환자 조직 13예에서 암유전자 bcl-2의 발현을 조사한 결과 1예를 제외한 모든 예에서 발현이 증가되었다(Fig. 4). Fig. 2에서 c-myb의 발현이 증가된 검체를 비롯하여 발현의 증가가 없었던 검체에서도 bcl-2의 발현은 증가하고 있었다. 이는 두경부종양의 발암화 과정에 bcl-2도 dominant oncogene으로 작용하고 있음을 의미하며, c-myb이 bcl-2를 직접 전사시키는 것으로 알려져 있지만,⁶⁾ bcl-2는 경우에 따라서 c-myb 이외의 경로로 발현이 증가되고 있음을 시사한다. 이와 관련하여 최근 보고에 의하면 bcl-2의 발현이 두경부종양 환자의 생존율과는 의미있는 관련성은 없지만 암의 진행과 의미있는 관련성을 나타내 향후 진행 예측 표지자로서 bcl-2가 거론되었다.⁷⁾ DN-myb 유전자에 의한 SNU-1076 세포주의 성장을 억제시키는 경로는 여러 경로가 존재 할 것이다. c-myb이 정상세포를 발암세포로 유도하는 과정은 bcl-2 발현을 증폭시키고 증폭된 발암유전자 bcl-2는 세포의 apoptosis를 억제시켜 결과적으로 세포의 암화를 초래하게 된다.⁶⁾ 따라서, c-myb의 발암화 경로는 bcl-2 작용이 주원인으로 사료되어 Ad/DN-myb을 SNU- 1076 세포에 감염시켜 DN-myb에 의한 c-myb 발현을 억제시킨 결과 대조세포에 비하여 bcl-2의 발현이 현저히 감소하였다(Fig. 5). 그러므로 Fig. 3의 세포성장의 억제는 DN-myb이 직접적으로 bcl-2의 발현을 감소시키고, 세포는 bcl-2의 감소에 따른 apoptosis 유도로 생존력이 저하된 것으로 사료된다.
   DN-myb의 치료 전략은 c-myb 의 전사작용을 억제시켜 하부의 bcl-2와 같은 암화와 관련된 인자의 발현을 억제시켜 암세포의 apoptosis를 유도시키지만,⁸⁾ Fig. 5의 결과에서 DN-myb은 c-myb 단백질의 발현 또한 저하시키고 있었다. 혈구세포에서의 c-myb의 발현은 Pim-1과 전사인자 GATA-1의 복합체가 유도시키는 것으로 알려져 있으나,⁹⁾¹⁰⁾ 그밖에 세포에서의 c-myb의 활성화 경로는 전혀 알려져 있지 않다. 본 연구에서는 DN-myb에 의한 c-myb의 발현 저하는 c-myb의 전사초기과정이 억제되어 세포의 생존력 및 성장의 저하가 c-myb의 발현에 영향을 주는 것으로 생각된다. 이러한 bcl-2 발현의 억제가 SNU-1076 세포주의 apoptosis를 유도하는 지를 알아본 결과 대조세포에 비하여 DN-myb 발현 세포주에서 세포의 성장이 억제되었고. DNA의 단편화 분석에서 단편화가 많이 일어났으며 저 농도 etoposide의 처리에도 apoptosis 유도가 더욱 현저히 나타났다(Fig. 6). 이러한 결과들에 따르면 DN-myb 유전자 치료와 항암제의 병합치료를 임상 적용 시 단독치료보다는 효과가 클 것으로 사료된다.
   신호전달계 중에 암세포와 관련하여 특히 주목받는 경로가 Akt/PKB 이다.¹¹⁾¹²⁾ 성장인자나 세포부착인자에 의해 활성화되는 Akt/PKB는 세포의 생존력을 증가시켜 apoptosis를 억제시키는 대표적인 경로로 알려져 있다.¹²⁾ 따라서, DN-myb에 의해서 유도된 세포성장의 억제와 apoptosis 유도, 특히 bcl-2의 발현 저하가 Akt/PKB 경로와 관련성을 검토하였다. DN-myb 발현 세포에서는 대체적으로 활성화된 phospho-Akt의 발현이 감소되어 48시간에 뚜렷이 나타났다(Fig. 7). 이는 DN-myb에 의해서 유도되는 세포의 생존력 저하는 Akt/PKB 경로의 활성화가 억제되기 때문이라고도 생각 할 수 있으나 DN-myb이 직접 Akt/PKB 경로의 활성화에 관여하는 지는 알 수 없다. 그러나 여러 성장인자로 Akt/PKB를 활성화시키면 c-myb의 전사작용이 증가되므로¹³⁾ DN-myb에 의한 c-myb의 기능 억제는 Akt/PKB 경로의 활성화를 억제시킬 수 있을 것으로 사료된다. 또한 Akt/PKB의 활성화는 bcl-2의 상류에 존재하여 bcl-2의 발현을 제어한다고 알려져 있다.¹⁴⁾ 따라서, Fig. 5의 bcl-2의 저하는 DN-myb이 직접 bcl-2 촉진자(promoter)상에서 wild type c-myb과의 경쟁적 억제의 결과로서,⁸⁾ 혹은 Akt/PKB 신호체계의 억제에도 기인 한 것으로 추정 할 수 있다.
   Akt/PKB의 활성화에 관여하는 대표적인 성장인자로 NGF, IGF, VEGF 등이 있으며, 이들 인자들은 정상세포를 비롯하여 암세포의 성장을 촉진시킨다.¹⁵⁾ 즉 IGF-I과 IGF-II의 발현은 골육종, 윌름씨 종양, 대장암, 유방암, 간암 등의 여러 암에서 증가를 보이며, 이들은 암의 성장과 진행에 중요하게 작용하고 있다.¹⁶⁾ VEGF도 angiogenesis와 vasculogenesis를 촉진시킨 인자이며, 많은 암의 진행과 전이에 필수적인 인자로 밝혀지고 있다.¹⁷⁾ 따라서 IGF system과 VEGF 기능의 억제는 항암치료의 좋은 표적분자로 알려져 있어¹⁸⁾ DN-myb에 의한 이들의 발현관계를 알아보고자 하였다. Ad/DN-myb이 감염된 세포에서는 암의 성장과 진행에 필수적인 인자로 밝혀진 IGF-II와 VEGF의 발현이 감소되었다(Fig. 8). 이러한 결과는 DN-myb이 어떠한 경로를 통하여 IGF-II와 VEGF를 감소시키는지 여러 가지 예측이 가능하다. 이미 IGF와 VEGF는 세포내 Akt/PKB 신호전달을 활성화시켜, 세포의 성장 혹은 암의 진행에 관여하는 것으로 잘 알려져 있다.¹⁹⁾ Fig. 8처럼 IGF와 VEGF의 감소는 Akt/PKB의 활성화를 억제시킬 수 있으며, 반면 Akt/PKB의 활성화 억제(Fig. 8)는 IGF와 VEGF의 발현 감소로도 이어지게 된다.²⁰⁾ 그러므로 DN-myb에 의한 c-myb 기능의 억제로 IGF-II와 VEGF의 발현이 감소되고, 이들 발현 감소는 Akt/PKB의 활성이 감소되어 이러한 연속적인 반응의 사슬은 이들 발현의 저하를 심화시키게 되어 bcl-2 등의 anti-apoptosis 유전자의 발현을 감소시킬 것으로 사료된다.
   이상의 DN-myb 유전자의 항암기전 및 기능을 종합해 보면, DN-myb 유전자는 단순히 세포의 apoptosis를 유도하는 것 이외에도 암세포의 성장과 진행 그리고 전이를 억제시키는 복합적인 기능을 나타내고 있어 여러 종양, 특히 접근이 용이한 두경부종양의 유전자치료에 응용될 수 있을 것으로 사료된다.

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