교신저자：박용수, 403-720 인천광역시 부평구 부평6동 665  가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   중이염은 소아에서 가장 흔한 세균 감염 질환이며 소아에서 항생제 치료 및 외과적 치료를 필요로 하는 가장 흔한 질환이다. 삼출성 중이염의 병인으로는 세균이나 바이러스 감염, 이관의 기능 장애, 알레르기 등이 원인으로 생각되고 있으며 이러한 일차적인 원인에 의해 염증성 매개체 및 효소 등이 방출되고 그 결과 중이 점막의 혈관투과도 증가, 주화성에 의한 염증세포 동원, 점액분비 증가, 점액섬모기능 장애 등에 의해 중이강에 삼출액이 저류되어 삼출성 중이염이 발생하는 것으로 생각되고 있다. 
   산화질소(nitric oxide, NO)는 중이염의 발생에 있어서 중요한 염증 매개체로 대두되고 있다. NO는 산화질소 합성효소(nitric oxide synthase, NOS)에 의해 L-arginine이라는 전구물질로부터 생성된다. 그리고 NOS는 발현 세포와 발현 양상에 따라 크게 3가지의 다른 isoform, 즉 Ⅰ형은 nNOS(neuronal NOS), Ⅱ형은 iNOS(inducible NOS), 그리고 Ⅲ형은 eNOS(endothelial NOS)로 각각 나눌 수 있다. 이중 Ⅰ형과 Ⅲ형은 cNOS(constitutive NOS)에 속하며 세포내에 지속적으로 존재하다가 Ca²⁺ 유입에 의해 활성화되어 소량의 NO를 생산한다. Ⅱ형인 iNOS는 면역 반응이나 염증 반응에서 TNF-α, IL-β 등의 cytokines와 세균의 내독소 등에 의해 활성화되어 세포내에서 새로이 합성되어 대량의 NO를 생산한다.¹⁾
   세균으로 유발한 급성 중이염에서 iNOS가 발현됨이 증명되었고²⁾³⁾ 그람 음성균의 세포벽 성분으로서 내독소로 작용하는 lipopolysaccharide(LPS)로 유발한 중이염에서 NO가 혈관투과도를 증가시키고 염증세포를 동원하며 점액분비를 증가시키는 매개체로 작용한다.⁴⁾⁵⁾ 면역 중개성 중이염에서도 iNOS가 발현되고 NO가 중이염의 발생을 중개하는 매개체로 작용한다.⁶⁾⁷⁾ 또한 인간의 삼출성 중이염의 삼출액 내에서 NO 대사물이 검출됨으로써⁸⁾ NO가 삼출성 중이염의 병태 생리에 깊은 연관이 있는 것으로 생각된다. 그러나 NO가 삼출성 중이염의 병인에서 중요한 점액섬모 기능에 미치는 영향에 대한 연구는 아직 보고된 바가 없다.
   NO와 점액섬모 기능에 대한 연구는 주로 하기도에서 다루어져 왔으며 Jain 등⁹⁾이 TNF-α와 IL-1β가 암소의 기관지 상피세포에서 iNOS를 유발하며 이에 의해 발생한 NO가 섬모 운동 횟수(ciliary beat frequency)를 증가시킨다는 보고 이후 여러 연구에서 NO는 섬모 운동 및 점액섬모 기능을 증가시키는 작용을 하는 것으로 알려져 왔다. 이에 반해 Chen 등¹⁰⁾은 저농도(0.1 ng/ml, 1 ng/ml)의 TNF-α는 섬모 운동 횟수를 증가시키지만 고농도(10 ng/ml)의 TNF-α에서는 섬모 운동 횟수가 감소했다고 하였으며 Ueda 등¹¹⁾은 guinea pig의 비강에 LPS를 주입한 실험에서 LPS가 iNOS를 유발하여 대량의 NO를 발생시킴으로써 비강의 섬모 상피세포를 손상시켜서 섬모 운동 횟수를 감소시켰다고 하였다. 
   이와 같은 NO의 유해 작용은 염증시에 대량으로 발생된 NO가 염증 반응에 의하여 함께 발생되는 반응성 산소종(reactive oxygen species, ROS)과 결합하여 반응성 질소종(reactive nitrogen species, RNS)을 형성함으로써 ROS의 유해 효과를 증폭시켜서 일어난다고 생각되고 있다. 반응성 질소종에는 peroxynitrite(ONOO^-)와 dinitrogen trioxide(N₂O₃) 등이 있으며 이들은 nitrosation, oxidation 및 nitration 등의 반응을 통해 살균 작용, 조직 손상, 그리고 발암 작용 등을 나타내게 된다.¹²⁾ Peroxynitrite에 의해 단백질의 tyrosine 기가 질소화된 산물이 3-nitrotyrosine(3-NT)으로서 생체 내에서 peroxynitrite의 상대적인 생산량을 추정할 수 있는 지표가 된다. Peroxynitrite에 의한 조직 손상을 차단하려면 peroxynitrite의 생성을 방지하도록 그 전구자인 NO나 superoxide의 생성을 억제하거나 peroxynitrite 자체를 없앨 수 있는 요산(uric acid, UA)과 같은 제거제를 사용하는 방법이 있을 수 있다.¹³⁾
   본 연구에서는 LPS로 유발한 실험적 삼출성 중이염 모델을 이용하여 NO와 그 최종 생성물인 peroxynitrite가 이관의 점액섬모 활동에 미치는 영향을 이관의 염색액 이동시간을 측정하여 확인하고 3-NT에 대한 면역조직화학 염색을 관찰함으로써 중이염 발생에 있어 NO와 peroxynitrite의 역할을 규명하고자 하였다.

재료 및 방법

시  약
   LPS는 Pseudomonas aeruginosa에서 추출한 것(Sigma, St Louis, Missouri)을 사용하였으며 생리식염수에 1 mg/ml의 농도로 만들어 사용하였다. NOS 억제제인 L-NAME (N^G-nitro-_L-arginine methyl ester)(Sigma)는 생리식염수에 1 mmol/L의 농도로 희석하였다. peroxynitrite 억제제인 요산(Calbiochem, Darmstadt, Germany)은 증류수에 0.1 g/ml의 농도로 희석하여 사용하였다. 

실험동물
   실험 동물로는 수술 현미경 하에서 관찰하여 고막이 정상인 400 g의 외견상 건강한 guinea pig 20마리를 사용하였다. 모든 실험은 ketamine(40 mg/kg)과 xylazine(2 mg/kg)을 근주하여 유도한 전신마취 하에서 실시하였다. 20마리의 guinea pig을 5마리씩(10귀) 4군으로 나누고 각 군에 다음과 같은 용액을 수술 현미경으로 고막을 확인하며 1 ml tuberculin 주사기에 26 gauge 척추 주사침을 연결하여 고실 내로 주입하거나 체내 주입하였다. 음성 대조군으로는 생리 식염수(normal saline, NS) 100 ㎕를 고실 내 주입한 NS 군, 양성 대조군으로는 LPS 100 ㎕를 고실 내 주입한 LPS군을 이용하였다. 실험군으로는 LPS 100 ㎕와 L-NAME 100 ㎕를 고실 내 주입하고 L-NAME (1 ml/kg)를 1회 근주한 L-NAME 군, LPS 100 ㎕를 고실 내 주입하고 12시간 간격으로 3회에 걸쳐 UA 1 ml/kg를 복강으로 주입한 UA 군을 이용하였다.

염색액 이동 시간 
   중이의 점액섬모 기능을 검사하기 위하여 염색액 이동시간을 측정하였다. 각 군에 해당하는 약물을 고실 내 주입하고 24시간 후 전신 마취 하에 동물을 앙와위로 자세를 취한 후 견인자를 이용하여 입을 벌리고 연구개를 절개하여 인두 후벽에 위치한 이관의 개구부를 노출시켰다. 다시 동물을 복와위로 바꾼 후 수술 현미경으로 고막을 확인하여 삼출액이 발생하였으면 이를 흡인하여 제거하였다. 0.1 ml의 5% Coomassie brilliant blue 염색액(Sigma)을 고막을 통하여 주입한 후 동물의 자세를 앙와위로 다시 바꾸고 이관의 개구부를 지켜보면서 염색액 주입 후 이관의 개구부로 푸른 빛의 염색액이 뚜렷이 나타날 때까지의 시간을 측정하였다.

조직 채취 및 염색
   측두골을 절취하고 10% formalin에 24시간 고정한 후 급속 탈회액(Calci-Clear Rapid, National Diagnostics, Atlanta, Georgia)에서 48시간 탈회시켰다. 수세와 탈수 후 파라핀에 포매하고 5 μm 두께로 절편을 만들어 슬라이드에 부착하였다. 중이 갑각 및 이관고실이 잘 나오는 부위를 골라서 hematoxylin-eosin 염색과 peroxynitrite의 생체내 표지자인 3-NT에 대한 면역조직화학 염색을 실시하였다. 

점막의 부종 및 염증세포의 침윤
   고실의 이관 입구부에서 가장 비후된 부위의 점막 상피하층의 두께와 염증 세포의 수를 광학 현미경의 대안 렌즈에 부착시킨 격자를 이용하여 400배로 관찰하였다. 점막의 부종은 이관고실 부위의 골막에서 점막 상피세포까지의 거리를 격자의 눈금(25 μm/눈금)을 이용하여 산출하였다. 염증세포의 침윤은 한 절편 당 10개의 격자 속에 들어가는 염증 세포의 수를 총합하여 그 평균치(격자 당 염증 세포의 수)를 얻었으며 이 때 상부와 우측의 경계선에 걸친 세포는 포함시키고 하부와 좌측 경계선에 걸친 세포는 탈락시켰다. 이 같은 방법으로 연속된 세 절편에서 수를 센 후 그 수를 평균하여 각 군의 대표치로 삼았다. 

면역조직화학 염색
   절편을 부착한 슬라이드를 58℃ 오븐에서 충분히 건조시킨 후 파라핀을 제거하고 pepsin으로 단백질을 소화시킨 후, 내인성 과산화효소를 3% 과산화수소로 억제시켰다. 비특이적 항원항체 반응을 억제하기 위하여 정상 염소 혈청에서 20분간 반응시키고 실온에서 1시간 동안 토끼의 항 인체 nitrotyrosine(Upstate Biotechnology, Lake Placid, New York) 1차 항체를 반응시킨 후 20분간 토끼의 Ig G 2차 항체(consolidated staining system, BioGenex, San Ramon, California)를 반응시켰다. 20분간 streptavidin-HRP(BioGenex)로 반응시킨 후 AEC(3-amino-9-ethylecarbazole) 발색제를 이용하여 발색을 시키고 hematoxylin으로 대조 염색을 하였다. Crystal mount 후 광학 현미경으로 관찰하였으며 고실의 이관 입구 근처의 점막에서 염색 강도에 따라 면역반응성이 전혀 없을 때, 경도, 중등도, 아주 강한 면역반응성을 보인 경우의 4단계로 반정량적으로 판정하였다.

통계검정
   SAS 프로그램(SAS system for Windows version 8, SAS Institute Inc., Cary, North Carolina)을 이용하여 분석하였으며 염색액 이동 시간, 점막의 부종 및 염증세포의 침윤은 일원배치 분산분석과 Duncan 다중 비교로, 면역조직화학 염색의 면역반응성은 Fisher의 정확 검정을 이용하여 통계 분석을 실시하였다. 실험치는 평균±표준편차로 표시하였고 통계적 유의성의 기준은 p<0.05로 하였다.

결     과

염색액 이동 시간
   LPS를 고실 내에 투여하였을 때 염색액 이동 시간(410.3±398.1초)은 NS군(126±96.3초)에 비해 현저하게 증가하였으며 이는 L-NAME와 UA 투여에 의하여 통계적으로 유의하게 개선되었다(각각 140.6±104.3초, 96.8±56.7초). 일원배치 분산분석과 Duncan 다중 비교 방법을 이용한 통계 검정에서 LPS군과 다른 군간에는 유의한 차이가 있었고(p<0.01) L-NAME군과 UA군은 서로 유의한 차이가 없었다(Fig. 1).

Hematoxylin-eosin 염색

중이 점막의 부종
   NS을 투여한 군의 상피하 층은 26.0±29.3 μm로 아주 얇았으며, LPS를 투여한 군에서는 198.8±77.4 μm로 통계적으로 의미있게 증가하였다(p<0.01). L-NAME와 UA를 투여한 군의 상피하층 두께는 각각 145.0±115.8 μm, 162.5±102.2 μm로서 LPS 투여 군에 비해 전반적으로 부종이 덜한 경향을 보였으나 통계 검정상 유의한 차이는 없었다(p=0.48)(Fig. 2).

염증 세포의 침윤
   NS군의 대부분은 상피하층이 아주 얇고 염증세포는 거의 발견할 수 없었다(0.05±0.16). LPS군에서는 밀집된 염증세포의 침윤(4.08±2.58)이 관찰되었고 상피하층 뿐만 아니라 중이 내강 및 상피 표면에 농성 분비물로 보이는 염증세포의 축적이 다수 관찰되었다. 염증세포는 주로 다형핵백혈구로 구성되어 있었으며 일부에서 거대세포가 관찰되었다. L-NAME군(2.63±1.33)이나 UA군(2.60±1.40)에서는 LPS군에 비해 염증 세포의 침윤이 감소되어 보였으나 통계적인 유의성은 없었다(p=0.15)(Fig. 3).

3-Nitrotyrosine에 대한 면역조직화학 염색
   3-NT는 상피세포의 기저면과 점막의 상피하층에 망상으로 널리 퍼져서 붉은 갈색으로 관찰되었다. NS군은 면역반응성이 없거나 아주 약하게 나타났고 LPS군에서는 대부분 중등도 이상의 강한 반응을 보였다. L-NAME군에서는 강한 반응성은 전혀 없고 경도 내지는 중등도의 반응성이 관찰되었으며 UA군에서는 강한 면역반응성을 보인 1예를 제외하고는 모두 경도 내지 중등도의 반응을 보였다(Fig. 4). LPS, L-NAME, UA군에 대한 Fisher의 정확 검정에서 LPS군과 L-NAME 및 UA군간에는 통계적으로 유의한 차이가 있었다(p<0.05)(Table 1).

고     찰

   NO는 체내에서 대식세포의 면역 반응, 병원균에 대한 정균-세균독성 방어, 혈압 조절 및 혈소판 응집 억제, 신경전달물질로 작용하며 염증 반응의 여러 단계에서 작용하는 것으로 생각하고 있다.¹⁾¹²⁾ 염증 과정에서 NO는 iNOS에 의해 대량 생산되며 대량으로 생산된 NO는 침입 유기체에 대한 숙주의 방어 기전에 있어 중요한 역할을 담당한다. 하지만 지속적인 NO의 방출은 건강한 조직까지 손상을 주어 관절염, 간염, 염증성 장 질환 등의 만성 염증성 질환을 일으킬 수도 있다.¹⁾ 이와 같이 NO는 강력한 항염증 성질을 가지고 숙주에게 이롭게 작용하는가 하면 만성 염증을 유발해서 세포 및 조직의 기능 장애를 증가시키는 매개체로 작용할 수도 있다.
   기도에서 NO는 정균, 항바이러스 성질과 점액분비 및 섬모 활동의 조절을 통해 방어 기전에 작용한다. NO의 섬모 자극 효과는 주로 하기도의 호흡 섬모 상피세포를 통한 연구에서 입증되었는데 NO는 isoproterenol, terbutaline, methacholine, 그리고 endothelin-1 등 섬모 작용물질(cilia agonist)들과 TNF-α, IL-1β, substance P, 그리고 bradykinin 등 염증 매개체의 작용을 중개함으로써 섬모 운동성과 점액섬모 활성도를 증진시킨다.^9)10)14) 또한 NO는 histamine, platelet activating factor(PAF), 그리고 TNF-α 등의 염증성 매개체와 ROS, methacholine, bradykinin 등의 작용을 중개하여 기도 상피세포에서 점액분비를 자극한다.¹⁵⁾¹⁶⁾
   상기도의 호흡 섬모 상피세포에 대한 NO의 영향은 최근 활발히 연구되고 있으며 하기도에 대한 효과와 유사하게 섬모 활동성과 점액섬모 활성도를 증진시키는 것으로 생각된다. Lindberg 등¹⁷⁾은 만성 부비동염 환자와 재발성 하기도 감염증 환자를 대상으로 한 실험에서 비강내 NO의 농도가 낮으면 CBF와 점액섬모 활동성이 감소되어 있다고 보고하였다. 또한 인간의 코에서 NO는 비강 점막의 혈류를 증가시키고 점액섬모 활동성을 증가시킨다고 밝혀진 바 있다.¹⁸⁾
   중이 점막은 이관 점막을 통해 상기도인 비강의 점막과 연결되어 있으며 특히 이관의 고실 개구부 주위와 하고실은 기도의 상피세포인 섬모원주상피가 있어서 점액섬모 수송 기능이 가능하여 NO가 기도의 점액섬모기능에 영향을 주듯이 중이 점막에서도 점액섬모기능에 작용을 하리라 생각되며 본 연구에서는 이 부위 상피세포의 점액섬모 수송 기능과 NO와의 관계를 연구하였다. 
   흰쥐의 건강한 중이 점막을 이용한 실험에서 iNOS와 eNOS는 거의 존재하지 않지만 nNOS는 뚜렷이 관찰된다.³⁾¹⁹⁾ 이는 정상 중이강에서 NO가 극히 소량이나마 지속적으로 존재하여 중이강을 병원균으로부터 보호하고 항상성을 유지하는데 관여하고 있는 것으로 생각된다.
   하지만 실험적으로 세균성 급성 중이염 및 면역성 삼출성 중이염을 유발할 경우 중이 점막 및 배양 상피세포와 염증 세포에서의 iNOS 발현이 RT-PCR과 면역조직화학 염색으로 입증되었으며^2)3)6)19) 세균의 내독소로 유발한 실험적 중이염에서는 NO가 점액의 과분비와 혈관투과도를 증가시켜서⁴⁾⁵⁾ 중이염의 발생에 관여한다고 보고된 바 있다. 또한 중이 상피세포를 IL-1β와 TNF-α로 자극하면 iNOS를 발현한다는 보고가 있었다.²⁰⁾ 이와 같이 NO는 중이강을 보호하는 역할을 하면서도 반면 중이염의 병태생리에 깊숙이 관여하는 상반된 작용을 하고 있다.
   Chen 등¹⁰⁾은 인간의 상악동 및 사골동 점막 상피세포의 섬모 운동성이 저농도의 TNF-α에 의해 증가하고 고농도의 TNF-α에 의해서는 iNOS를 발현시키면서 섬모 운동성이 감소했다고 하였다. Ueda 등¹¹⁾은 기니픽의 비강에 주입한 세균의 내독소가 iNOS를 유도하고 이에 의해 대량의 NO가 생산된다고 하였는데 이 경우 증가된 NO는 비강의 섬모 상피세포에 손상을 주고 섬모 운동성을 감소시킨다고 하였다. 
   이와 같은 연구를 종합하여 볼 때 LPS는 TNF-α, IL-1 및 PAF 등과 같은 염증성 매개체를 통해 iNOS의 발현을 유발시켜서 NO를 대량 생산하게 되고 대량의 NO는 ROS와 반응하여 세포 손상에 치명적인 RNS를 형성함으로써 오히려 섬모상피세포를 손상하고 섬모 운동성을 감소시키는 것으로 생각된다. 
   RNS의 하나인 peroxynitrite는 강력한 산화제로서 thiol과 thioether을 산화시키고 tyrosine 기를 질소화하며, guanosine을 산화, 질소화하고 DNA를 분해하며 세포막 지질을 과산화시켜서 세포 손상에 결정적인 역할을 한다고 알려져 있다. Peroxynitrite는 침입 미생물에 대한 강력한 무기로 숙주에 이롭게 작용할 수 있지만 만성 염증과 같은 병적 상황에서 과잉 생산이나 조절을 벗어난 생산은 조직 손상의 주 요인으로 작용할 수 있다.¹³⁾
   조직 손상에 대한 peroxynitrite의 효과를 차단하려면 그 전구자인 NO나 superoxide의 합성을 차단하거나 혹은 이미 생성된 peroxynitrite에 대한 제거제를 사용하는 방법이 있을 수 있다(Fig. 5). 본 연구에서 NOS 억제제인 L-NAME로 NO의 합성을 억제하거나 UA로 이미 합성된 peroxynitrite를 제거하였을 때 염색액 이동 시간이 의미 있게 단축되고 조직의 점막 부종이나 염증 세포 침윤은 비록 통계적 유의성은 없었지만 감소되는 경향을 보였다. 이 같은 결과는 LPS가 강한 염증 반응을 일으켜 중이 점액섬모 수송 기능을 손상하며 이는 새로이 합성된 NO와 peroxynitrite에 의해 중개되어 NO 합성 억제나 peroxynitrite 제거제의 처치로 개선될 수 있음을 제시한다. 
   Morineau 등¹⁹⁾은 중이 상피세포에서 산화질소가 생성되며 이들이 반응성 산소종과 결합하여 peroxynitrite를 형성함으로써 산소 자유기의 독성을 높이는 것으로 보인다고 하였다. 그러나 이들의 연구는 peroxynitrite나 그 대사물인 nitrotyrosine의 존재를 직접적으로 증명하지는 않았다. 
   본 연구에서는 3-NT에 대한 면역조직화학염색을 통해 LPS로 유발한 중이염에서 peroxynitrite가 형성됨을 확인하였다. 면역조직화학 염색상 NS 대조군에서 peroxynitrite의 지표인 3-NT은 거의 발현되지 않았고 LPS로 중이염이 유발된 점막에서는 아주 진하게 발현되어 LPS로 유발된 중이염에서 peroxynitrite가 형성됨을 알 수 있었다. 3-NT에 대한 면역반응성은 NOS 억제제나 UA의 처치 후 약하게 발현되었으며 이는 LPS에 의한 중이염에서 peroxynitrite가 NO와 관련된 경로를 통해 생성됨을 시사한다. 
   이상의 결과로 볼 때 LPS는 중이 상피세포에서 iNOS의 발현을 유발하여 대량의 NO를 발생시키고 이것이 ROS와 결합함으로써 peroxynitrite와 같은 RNS의 합성을 유도함으로써 중이염을 유발하는 것으로 보인다. 또한 NO는 이미 알려진 바와 같이 삼출성 중이염의 발생에서 혈관투과도 증가, 염증 세포 동원, 점액의 과분비⁴⁾⁵⁾ 이외에도 이관의 점액섬모 수송 기능 장애에 관여해 삼출성 중이염 발생의 모든 단계에 관여함을 알 수 있었다.
   NO와 peroxynitrite의 유독한 작용이 삼출성 중이염의 병인에 중요한 역할을 하고 있음을 고려하면 NOS 억제제와 peroxynitrite 제거제의 사용은 삼출성 중이염의 새로운 치료 방향을 제시한다고 생각된다. 즉 NO의 발생을 선택적으로 차단할 수 있는 약제인 aminoguanide, isothiourea 또는 peroxynitrite 제거제인 uric acid, cysteine analogue 그리고 deferoxamine 등의 약물을¹³⁾ 전신적으로 투여하거나 중이강에 국소적으로 투여하는 방법을 개발한다면 중이염의 치료에 도움이 될 수 있을 것으로 생각된다. 그러나 NO 및 peroxynitrite가 병원체에 대한 방어 기전으로도 작용한다는 점을 고려한다면 이러한 약제의 투여는 급성 감염기를 피하고 침입한 병원체가 항생제 등의 치료로 소멸된 후 잔존하는 LPS와 염증 매개체 등의 효과로 만성 염증이 지속되는 단계에 신중하게 투여해야 하리라고 생각한다.

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