교신저자：왕수건, 602-739 부산광역시 서구 아미동 1가 10번지  부산대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   방사선 치료는 후두암을 비롯한 많은 두경부암의 치료방법으로 사용되고 있다. 방사선 치료는 암세포의 DNA에 작용하여 DNA-double-strand breakage를 초래하는 직접적인 작용과 세포 내에 있는 물(H₂O)과 반응하여 HO free radical를 만들어 주위 조직에 작용하는 간접적인 작용에 의해 세포에 작용한다.¹⁾²⁾ 방사선 치료 후 재발한 암에서 방사선 치료에 의해 추가적인 유전자의 변화가 발생할 가능성이 있다. 이러한 유전자의 변화는 방사선 치료에 대한 저항성과 연관성이 있을 가능성이 있다. 
조기 후두암에서 방사선 치료를 시행 받고 재발한 환자에서 방사선 치료 전과 방사선 치료 후 재발한 동일인의 조직에서 세포의 발생, 증식, 고사와 연관성이 있는 p53 유전자와 세포의 증식에 관여하는 proliferating cell nuclear antigen(PCNA)의 발현 차이가 있는지를 알아보고자 본 연구를 시행하였다. 

대상 및 방법

대  상
   1995년 1월부터 2002년 12월까지 이비인후과에 방문하여 후두내시경, 컴퓨터 단층촬영 및 조직검사 상 후두성문암 T1 또는 T2로 진단되어 방사선치료(70.2 Gy)를 시행한 후 재발하여 수술을 시행 받은 15명을 대상으로 하였다. 대상은 모두 남성이었으며 평균 나이는 58.7세이었다. 방사선 치료 후 재발까지의 평균 기간은 14.8개월(1~74개월)이었다. 

면역조직화학 염색
   포르말린에 고정하여 파라핀에 포매된 조직을 5 μm의 두께로 자른 다음 면역조직화학염색을 시행하였다. 조직절편을 탈파라핀과 함수과정을 거친 후 0.01M citrate buffer(pH 6.0) 1L가 담긴 특수 프라스틱 용기에 넣어 전자렌지(Samsung RE-400B, 700 W)를 이용하여 5분간 두 번 가열하여 항원성을 증가시켰다. 내인성 peroxidase를 억제하기 위해서 3% H₂O₂로 처리한 다음 5% 정상가토혈청으로 비특이적인 항원-항체반응을 억제하였다. 면역조직화학염색은 avidin-biotin peroxidase 방법인 Vectastain ABC elite kit(Vector laboratories, Burlingame, CA, USA)를 사용하였고, 발색제는 3-amino-9-ethylcarbazole(Vector laboratories, Burlingame, CA, USA)을 사용하였다. p53, PCNA 대한 일차항체는 p53(DO-7, Dako, CA, USA), PCNA(PC-10, Dako, CA, USA)를 각각 1：100으로 희석하여 사용하였다.

염색정도의 판정
   p53 면역조직화학 염색에서 종양세포들의 10% 이상에서 핵에 국한하여 적갈색의 뚜렷한 양성반응을 보이는 경우를 양성으로 간주하였다. PCNA도 종양세포의 핵에서 적갈색의 염색반응이 관찰될 때 양성으로 인정하였다. PCNA에 양성 반응을 보일 경우 저배율에서 반응이 가장 현저한 부위를 선별한 뒤 400배 시야에서 종양세포 500개를 계수하여 이들 중 양성반응을 보이는 세포들의 백분률을 PCNA 반응 지수(index)로 결정하였다. 

통계학적 분석
   방사선치료 전과 치료 후 조직의 p53과 PCNA의 발현의 변화에 대해 paired t-test를 시행하여 p값이 0.05이하인 경우 유의하다고 하였다.

결     과

방사선 치료 후 재발한 후두암에서 p53 발현의 변화
   방사선 치료 전에 p53의 발현이 양성인 경우가 15예 중 4예(26.7%), 음성인 경우가 11예(73.3%)이었다. 그러나 재발한 암에서는 p53이 발현된 경우가 15예 중 8예(53.3%)로 증가하였다(Table 1, Fig. 1, p<0.05). 

방사선 치료 후 재발한 후두암에서 PCNA index의 변화
   방사선 치료 전에 암 조직의 PCNA index는 평균 11.9%(0.2~20.8%)이었으나 방사선 치료후 재발한 암 조직의 PCNA index는 평균 18.0(7.0~39.6%)으로 증가하였다(Table 1, Fig. 2, p<0.05).

고     찰

   p53과 PCNA의 발현이 방사선 치료 후 재발에 영향을 주는 예측인자에 대해 여러 가지 연구가 있다. 본 연구는 p53과 PCNA가 방사선 치료 후 재발의 예측 인자로서의 가능성에 대한 직접적인 연구는 아니다. 방사선 치료가 재발암의 p53과 PCNA의 발현에 어떠한 영향을 주었는지에 대한 연구이다.
   방사선 치료 후 암의 재발하는 기전은 1. 기존의 암 성분 중 방사선에 내성이 있는 세포가 방사선치료에 살아 남아서 재발하는 경우, 2. 방사선 치료에 의해 기존의 암에 변화가 유발되어 다른 암으로 재발한 경우, 3. 새로운 종양이 발생하는 경우 등으로 생각할 수 있다. 어떠한 기전에 의한 것인지는 알 수가 없으나 방사선에 저항성을 가지는 방향으로 진행될 가능성이 있다고 생각된다. 
   방사선 치료 후 암이 재발한 경우에는 치료 전에 비해 추가적인 유전자적인 변화가 있을 가능성이 있다. 방사선 치료 후 재발한 전립선암에서는 방사선 치료 전에 비해 조직학적으로 분화가 나쁘고, 또한 재발한 암이 치료전의 암 보다 공격적인 표현형(aggressive phenotype)으로 바뀐다고 하였다.³⁾
   Gallo 등⁴⁾은 동일한 두경부암 환자에서 방사선 치료 전 암 조직과 재발한 암 조직에서 p53의 돌연변이를 치료하였다. 방사선 치료 전에 p53 돌연변이가 있는 16명에서 방사선 치료 후 돌연변이가 소실된 경우가 31%(5명)이었다. Tjebbes 등⁵⁾은 방사선 치료 후 재발한 후두암 21명을 대상으로 치료 전과 치료 후 재발한 암 조직에서 p53의 돌연변이를 조사하였다. 방사선 치료 전에는 21명 중 16명에서 p53 돌연변이 관찰되었고, 이 중 15명(94%)에서 방사선 치료 후 역시 p53 돌연변이가 관찰되었고, 단 1명(6%)에서 정상적인 p53 유전자가 관찰되었다. 후두암에서 방사선 치료 후 재발한 암은 94%에서 처음의 암과 같은 p53 돌연변이를 가진다고 보고하여 방사선 치료는 재발한 암의 p53 유전자에 미치는 영향이 미미하다고 하여 Gallo 등⁴⁾의 결과와 차이를 보이고 있다. 그 차이는 p53 유전자의 돌연변이를 검사법의 민감도의 차이라고 설명하였다. 
   본 연구에서는 방사선 치료 전 p53의 돌연변이가 없던 11예중 4명(36%)에서 방사선 치료 후 p53 돌연변이가 발생하여 통계학적으로 의의가 있었다(p<0.05). 방사선 치료 후 재발한 전립선암에서 방사선 치료 전에 비해 방사선 치료 후 재발한 암에서 p53의 돌연변이가 증가한다는 결과와 일치하는 소견이다.⁶⁾ 방사선 치료 후 재발한 암에서 p53의 발현이 증가하는 것은 p53이 방사선 치료의 저항성과 연관성이 있을 가능성이 있다. 이러한 결과는 p53이 발현되는 경우 방사선 치료에 저항성을 가진다는 보고⁷⁾⁸⁾⁹⁾와 일치하는 결과이다.
   PCNA index는 방사선 치료 후 재발한 암에서 의미있게 증가하였다(p<0.05). 방사선 치료 후 재발한 전립선암에서 세포의 증식이 많다는 보고와 일치하는 소견이다.⁵⁾¹⁰⁾ 방사선 치료 후 재발한 암에서 PCNA의 발현이 높다는 것은 PCNA가 방사선 저항성과 연관성이 있을 가능성이 있다. 이러한 결과는 후두암에서 PCNA index가 방사선 치료의 좋은 지시자라는 Dobros 등¹¹⁾의 연구와 일치하는 소견이다. 

결     론

   방사선 치료 후 재발한 후두암에서 방사선 치료 전에 비해 p53 과 PCNA의 발현이 증가하였고 이러한 것은 방사선 치료 후 재발한 암이 분자생물학적 측면에서 재발 전에 비해 공격적으로 변화한 것을 의미한다. p53과 PCNA의 변화와 방사선 저항성과의 관계에 대한 계속적인 연구가 필요할 것으로 생각된다. 

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