교신저자：김동욱, 140-743 서울 용산구 한남동 657번지  순천향대학교 의과대학 부속서울병원 이비인후과학교실
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서     론

   후두암은 두경부 영역에서 발생하는 악성 종양 중 갑상선암을 제외하면 가장 흔한 원발성 종양으로, 전체 악성 종양의 2~5%를 차지한다.¹⁾ 후두암의 중요한 환경적 위험인자는 흡연, 공해 및 음주 등인데, 흡연자의 경우 비흡연자에 비해 후두암의 발생률이 4~24배 높고, 위험률은 흡연량에 비례해서 높아진다고 알려져 있다.²⁾ 후두암 뿐만 아니라 다양한 암발생의 중요한 원인으로 알려져 있는 흡연은 Adenomatous polyposis coli(이하 APC) 유전자, β-catenin 유전자, p53 유전자 및 K-ras-2 유전자와 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다.³⁾
   APC 단백은 여러 기능을 가진 분자로 세포내에서 β-catenin의 농도를 조절함으로써 암발생에 관여하는 것으로 알려져 있다.⁴⁾ 즉, 세포내의 β-catenin은 APC 단백, glycogen synthase kinase 3β(GSK 3β), axin 등과 결합하여 복합체를 형성한 후 proteosome에 의해 분해되어 제거되는데, APC 단백의 기능에 결함이 있는 경우 이러한 분해과정이 차단됨으로써 세포 내에 β-catenin이 축적된다.⁴⁾ 또한 β-catenin 자체의 유전자 변이, Wnt 경로의 이상 등이 초래되면 세포질 내에 β-catenin이 축적된다. 이렇게 축적된 β-catenin은 핵내로 이동하여 TCF(T cell factor)/LEF(leukocyte enhancing factor) 전사인자(transcription factor)를 활성화시켜 c-myc와 cyclin D1 등의 표적 유전자를 발현시켜 종양의 생성 및 진행에 관여한다.⁵⁾ 이외에도 β-catenin은 E-cadherin과 결합하여 세포간 접합체를 형성하는 구조 인자의 역할을 하여 세포막의 β-catenin 소실은 세포의 기능이 저하되어 암세포의 전이를 용이하게 한다.⁶⁾ 면역조직화학적 염색으로 정상 세포에서 APC 단백은 세포질 내에서 양성 반응을 보이지만 대장암에서와 같이 APC 단백의 기능이 소실되면 음성 반응을 보이게 된다. 정상 세포에서 β-catenin은 세포막에서 양성 반응을 보이고, 세포질 또는 핵에서 음성 반응을 보이지만 대장암에서는 β-catenin의 세포막 발현이 감소 혹은 소실되고 세포질과 핵에서는 발현이 증가한다.⁷⁾
   저자는 면역조직화학적 염색을 이용하여 후두 편평세포암 조직에서 β-catenin과 APC 단백의 발현 유무와 임상적인 양상과의 관련성을 알아보고자 하였다.

대상 및 방법

대  상 
   1990년부터 2002년까지 후두암으로 진단을 받고 수술적 치료를 받은 15예를 대상으로 의무기록과 병리조직보고서를 검토하여 나이, 성별 및 병기, 분화정도 및 림프절 전이 유무를 조사하였다. 15예의 후두암 환자의 연령 분포는 47세부터 75세까지였으며, 평균 연령은 62.6세였다. 남자는 14예, 여자는 1예였다.

방  법
   각 환자의 파라핀 포매조직을 5 μm의 두께로 연속절편을 만들어 통상적인 ABC(avidin-biotin-immunoperoxidase complex)법으로 APC 단백과 β-catenin의 면역조직화학적 염색을 시행하였다. 조직의 처리는 60℃의 보온기내에서 30분간 처리 후 xylene에서 탈 파라핀을 시행하고 무수 알코홀로 부터 순서대로 희석된 유수 알코홀로 처리하여 증류수에 함수시켰다. 0.3% H₂O₂와 Methanol에 30분간 처리하고, 0.1M citrate 용액에서 70℃에서 10분간 배양하여 30분간 실온에 두었다. 다시 PBS에 세척후 2% BSA가 혼합된 Blocking solution(Blocking solution, Signet laboratories, Dedham, MA, USA)에 1시간동안 배양하였다. Rabbit polyclonal anti-APC(adenomatous polyposis coli) protein(Santa Cruz, CA, USA) 1：100으로 희석하여 4℃에서 16시간 처리하였다. 후에 PBS에 5분씩, 3회 세척을 하고, 2차 항체(Multi-species Reagent, Biotinylated Anti-mouse and rabbit immunoglobulin(Signet laboratories, Dedham, MA, USA)를 사용하여 30분간 배양하였다. 다시 PBS에 5분씩, 3회 세척을 한 후 avidin-biotin peroxidase complex(Vectastain Kit, Vector laboratories, Burlingame, CA, USA)로 30분간 배양 후 PBS에 5분씩, 3회 세척하였다. DAB(3,3'-diaminobenzidine-tetra-hydrochloride) 용액으로 발색시킨 후 증류수로 세척을 하고, Hematoxylin-Eosin으로 대조 염색한 후 광학현미경하에서 발색부위를 관찰하였다. Goat polyclonal anti-β-catenin(Transduction Lab., Lexington, KY, USA)은 1：200으로 희석하고 발색은 AEC(3-amino-9-ethylcarbazole)을 사용하였다. 비종양성 조직과 대장암 조직을 이용하여 염색 유무와 염색 부위를 비교하였으며, 음성 대조염색은 일차 항체를 생략하고 시행하였다.

통계처리
   임상적 및 병리학적 인자들과 후두암의 β-catenin과 APC 단백의 발현 유무를 Fisher's exact test를 사용하여 분석하였고, p값이 0.05 이하일 때 통계적으로 유의성이 있다고 판정하였다.

결     과

   15예의 후두 편평세포암 환자 중 고분화성 암종은 10예, 중등도 분화성 암종은 5예였다. 임상적 병기에 따른 국소병기(T)는 T1 4예, T2 5예, T3 3예, 그리고 T4 3예이었다. 림프절 전이(N) 병기는 N0 11예, N(+) 4예이었다. 흡연경력을 가지고 있었던 경우가 14명이었고, 이중 13명이 30 pack-year 이상의 흡연력을 가지고 있었다.

β-catenin과 APC 단백의 면역조직화학적 발현 양상
   세포막 β-catenin의 발현은 총 15예 중 4예(27%)에서 양성 반응을 보였고, 11예(73%)에서 감소하거나 음성 반응을 보였으며, 세포질에는 6예(40%)에서 양성 반응 보였으나, 핵에서는 관찰되지 않았다(Figs. 1 and 2). APC 단백의 발현은 총 15예 중 10예(67%)에서 양성 반응을, 5예(33%)에서 음성 반응을 보였다(Fig. 3).

임상양상과 β-catenin 및 APC 단백의 발현양상간의 상관관계
   APC 단백의 발현양상과 임상병리학적 지표간의 상관관계를 분석해 보았을 때 종양의 크기, 림프절 전이, 조직학적 분화정도와의 상관관계에 있어서 통계학적 유의성은 없었으나, β-catenin과 림프절 전이와 관련성을 보였다(Table 1 and 2).

β-catenin과 APC 단백 발현 양상간의 상관관계
   세포막 β-catenin 양성 반응을 보인 4예에서 APC 단백 양성 반응을 보인 것은 2예(50%)였으며, 세포막 β-catenin 감소나 음성 반응을 보인 11예 중 APC 단백 음성 반응을 보인 것은 3예(27%)였다(Table 3). 세포질 β-catenin 양성 반응을 보인 6예 중 APC 단백 음성 반응을 보인 것은 1예(17%) 였으며, APC 단백 음성 반응인 5예 중 세포질 β-catenin이 양성 반응인 것은 1예(20%)이었다. 후두암에서 β-catenin과 APC 단백의 각각 발현 양상에서 통계학적 유의성은 없었다(Table 4). 

고     찰

   한국인의 후두암 발생률은 연간 250~400명 정도로 인구 100,000명당 3.2명 정도에 해당하며, 남녀비는 약 10：1, 호발연령은 60대로 알려져 있다.¹⁾ 후두암 환자의 90% 이상이 흡연력을 갖고 있으며, 흡연은 여러 역학적 연구를 통하여 후두암의 위험요인으로 확인되었으나, 어떤 기전을 통하여 후두암을 유발하는지에 대해서는 아직까지 명확하지 않다.⁸⁾ 현재까지 Adenomatous polyposis coli(APC) 유전자, β-catenin 유전자, p53 유전자, K-ras-2 유전자 등이 흡연과 관련이 있는 것으로 알려져 있다.³⁾ β-catenin은 세포간 접합체를 형성하는 구조인자로서의 기능과, 유전자 발현을 조절하는 전사 인자로서 작용하는 두 가지 생물학적 기능이 밝혀져 있다.⁹⁾ 대장의 정상 점막에서는 β-catenin이 세포막을 따라 발현되지만 선종과 암종에서는 감소하거나 소실되고 세포질과 핵에서 발현되는데 이는 선종의 형성과 초기 악성화 과정에 중요한 역할을 담당하고 있다.¹⁰⁾ 또 위암, 간암, 유방암, 흑색종 등에서도 β-catenin 이 세포질과 핵에 축적되는 현상이 관찰되어 다양한 종양의 악성화 과정에 관련되어 있다.¹¹⁾ 본 연구에서 식도암, 비인강암, 구강암에서와 같이¹²⁾ 후두암에서도 β-catenin의 세포막 발현 감소를 73%에서 관찰할 수 있었고, 세포질 내 β-catenin의 발현은 40%에서 관찰되었다. β-catenin은 E-cadherin, α-catenin 등과 결합체를 이루어 세포간 접합부를 형성하고 세포분화를 유도하는 기능이 있다.¹³⁾ 대장암, 식도암, 방광상피암 그리고 유방암에서 세포막 β-catenin의 발현 감소가 조직학적 분화도 및 전이 여부와 의미 있는 상관관계가 있다고 하였고¹⁴⁾ 대장암에서는 조직학적 분화도가 낮을 수록 β-catenin의 핵과 세포질 발현 빈도가 증가하는 것이 보고되었다.¹⁵⁾ 본 연구에서는 중분화도 50%, 고분화도 18%에서 세포질 β-catenin이 관찰되어 조직학적 분화도와 세포질 β-catenin의 상관관계가 없었으며 세포막 β-catenin의 발현 감소가 후두암 예후와 관계되는 T 분류, 림프절 전이 유무 등의 임상 양상과도 통계적 상관 관계를 찾을 수 없었다. β-catenin의 지속적인 발현은 TCF/LEF 전사인자를 활성화시켜 표적 유전자를 발현시키고 암의 생성 및 진행에 영향을 미친다.¹⁶⁾ 림프절 전이와 원격 전이를 동반한 대장암에서 핵형 β-catenin의 발현 빈도가 증가하므로 β-catenin 발현 양상이 암의 침윤과 진행에 관계할 것이라는 보고가 있고,¹⁶⁾ 후두암에서 β-catenin의 세포질내의 발현이 암의 분화도가 나쁜 경우에 증가한다는 결과도 있다.¹⁷⁾ 본 연구에서 핵형 β-catenin의 발현이 없었고, 세포막 β-catenin의 발현이 감소된 군에서 림프절 전이가 9%에서 관찰되어, 후두암의 진행과 침윤에 관계하는 β-catenin의 역할은 미약할 것이라고 생각된다. APC 유전자는 종양억제유전자로서 대장암의 80% 이상에서 기능 소실이 발견되고, APC 유전자 변이로 생긴 APC 단백의 기능 소실이 대장암의 전구 병변인 용종 형성과 관련이 있어 악성화 초기 과정에 중요한 인자로 작용한다고 알려져 있다. APC 단백은 신호전달체인 β-catenin/ TCF/LEF 복합체의 전사를 조절하는 인자로서 작용하나, 유전자의 변이로 인하여 기능이 소실되면 β-catenin이 분해되지 않고 세포질에 축적되는 결과가 초래되고, 축적된 β-catenin은 핵 내로 이동하여 전사 인자인 TCF, LEF와 결합하여 종양의 성장과 진행을 촉진하는 유전자 발현을 증가시키게 된다. 세포질 또는 핵형 β-catenin의 발현은 APC 단백의 이상, β-catenin 자체 변이, Wnt 경로의 이상으로 인한 지속적인 β-catenin의 과다 발현을 의미한다. 본 연구에서는 APC 단백의 발현은 총 15예 중 10예(67%)에서 양성 반응을, 5예(33%)에서 음성 반응을 보였다. 세포질 β-catenin 양성반응을 보인 6예에서 APC 단백 음성 반응을 보인 경우는 1예(17%)였고 APC 단백 음성인 5예 중 세포질 β-catenin이 양성인 것은 1예(20%)로 후두암에서 세포질 β-catenin의 축적은 APC 단백의 기능 이상이 아닌 다른 원인에 기인할 것으로 생각된다. APC 단백과 T 분류, 림프절 전이 유무, 조직학적 분화도 등의 임상 양상과는 통계적 상관관계를 찾을 수 없었다. 후두암의 경우 본 연구의 결과에서 β-catenin이 APC 단백에 비해 악성화 과정에 더욱 적극적으로 참여하고 있다고 생각된다. 후두암에서 세포막 β-catenin의 감소는 T 분류, 림프절 전이와 상관관계가 없었으나 세포질의 발현은 림프절 전이와 관련을 보였다. β-catenin이 후두암 진행과 침윤에는 중요한 역할을 못한다고 생각되지만, 림프절 전이와 관련이 있을것으로 사료되며, 이는 적은 림프절 전이를 갖은 환자수로 인하여 통계적인 유의성이 생긴 것으로 생각되며 향후 더 많은 수의 환자 자료가 필요할 것으로 생각된다. 따라서 후두암 발생에 관여하는 여러 인자에 대해 좀 더 많은 연구가 필요할 것으로 생각된다. 

결     론

   APC 단백의 이상으로 세포질내 β-catenin이 축적되는 대장암과 달리 후두암에서는 APC 단백의 음성 발현율이 적었으며 APC 단백의 발현 양상과 세포질 β-catenin 축적과의 통계적 상관관계가 없었으나, β-catenin의 세포질 발현과 림프절 전이와는 관련성이 있었다. 후두암에서 세포막 β-catenin의 감소가 관찰되지만 T 분류, 림프절 전이와 상관관계가 없어서 β-catenin이 후두암 진행과 침윤에는 중요한 역할을 하지 않을 것으로 생각된다. 세포질 β-catenin 양성 반응은 후두암의 전이와 관련성이 있을것으로 사료되나, 환자수가 적은 관계로 결론을 내리기에는 미흡한 점이 있다. 세포질 β-catenin의 축적이 APC 단백의 이상보다는 β-catenin 자체의 변이나 Wnt 경로의 이상 등으로 발생하였을 것으로 생각된다. 후두암에서 APC 단백의 역할은 미약하며 β-catenin이 후두암의 진행에 관여할 것으로 생각되며 앞으로 β-catenin이 후두암의 발생과정에 어느 정도 관여하는지 알아보기 위해서는 더 많은 연구가 이루어져야 할 것이라고 생각된다.

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