교신저자：왕수건, 602-739 부산광역시 서구 아미동 1가  부산대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   물질에 빛을 비출 때 산란이 된다는 것을 Raman이 1928년에 처음으로 발견하였고¹⁾ 빛이 물질에 충돌하는 경우, 대부분 입사광과 같은 파장으로 광자가 방출되는데 이것을 Rayleigh wave 산란이라고 한다. 그러나 극히 일부는 물질을 구성하고 있는 분자와 에너지를 교환하여 원래의 입사광과 다른 파장의 빛을 산란하는데 이러한 것을 라만 산란(Raman scattering)이라고 한다. 라만 산란은 분자의 화학 구조에 따라 지문과 같은 특징적인 파장으로 출현하는데 이를 분석하는 것이 라만 분광법(Raman spectroscopy)이며 이는 미지의 물질에 단색광의 레이저를 조사하여 산란되는 광자(photon)를 분석하여 분자 구조를 파악하는 방법이다.
   암을 비롯한 신체의 여러 질환은 다양한 과정을 거쳐 해당하는 장기의 세포와 조직의 화학 구성과 분자 구조에 변화를 유발하는데, 이러한 변화를 라만 분광법을 이용하여 관찰할 수 있다면 이때 나타나는 질환별 변화의 진단법으로 사용할 수 있다. 이와 같이 과거에는 주로 유기화학이나 무기화학 분야에서 미지의 물질의 분자구조를 알기 위해 사용되었던 라만 분광법이 최근에는 생명공학 분야에서도 이용되고 있다.²⁾³⁾ 의학 분야에서는 자궁암,²⁾ 유방암,⁴⁾ 간암,⁵⁾ 피부암,⁶⁾ 대장암,⁷⁾ 후두암,⁸⁾ 구강암,⁹⁾ 비인강암¹⁰⁾ 등에서 정상조직과 암조직을 라만 분광법을 이용하여 진단하고자 많은 연구가 진행되고 있다.
   후두암은 후두 상피세포에서 발생하는 암으로 채취한 조직을 조직병리학적으로 확진한다. 이 경우 국소 또는 전신마취가 필요하며, 진단이 잘 되지 않을 때에는 조직검사를 반복적으로 시행하는 경우도 있어 시간적, 경제적 손실이 발생한다. 이러한 전통적인 후두암 진단의 단점들을 보완하기 위한 연구가 다양한 분야에서 진행되고 있다. 이 중 한 방법으로 라만 분광법은 조직생검과 같은 침습적인 방법을 통하지 않고 비침습적으로 생화학 분자 수준에서 점막의 아주 미세한 변화에 대한 측정이 가능하다. 후두암의 조기 진단에 라만 분광법의 적용 가능성에 대해 Stone 등⁸⁾은 1336 cm^-1과 1250 cm^-1의 강도 비율만을 이용하여 연구하였다. 이에 저자는 후두암 진단에 라만 분광법의 적용 가능성에 대하여 연구하기 위해 후두암으로 진단되어 수술을 시행한 환자에서 암조직과 정상조직을 구별할 수 있는 특징적인 라만 파장과 라만 파장들의 특징적인 비율이 있는 지를 알고자 본 연구를 시행하였다.

재료 및 방법

재  료
   2000년 1월부터 2002년 6월까지 부산대학교병원 이비인후과에서 후두암으로 후두전절제술 또는 상윤상후두부분절제술을 시행 받은 13예 후두에서 암조직과 주변의 정상조직을 채취하여 즉시 -70℃에 동결 보존하여 사용하였다. 후두암 조직은 육안적으로 암종이 관찰되고 병리조직검사상 평편상피암으로 진단된 병소에서 채취하였으며, 정상조직은 육안적으로 암종의 소견이 없고 조직검사상 정상조직으로 확인된 부분에서 채취하였다. 동결 보관된 암조직과 주변 정상조직을 해동하여 phosphate buffer solution(PBS)으로 세척한 후 30분 이내에 측정하였다. 연구대상 환자는 모두 남성이었으며, 나이는 52세에서 67세로 평균은 57.8세였다.

라만 분광법
   라만 분광기는 Fourier Transform(FT)-Raman Spectroscopy(FRA 106, Bruker Co, Karsruhe, Germany)를 사용하였다. 라만분광자극광원은 1064 nm 파장의 Nd：YAG 레이저를 180°의 scattering mode로서, 채취한 시료 표면에 직접 조사하였다. 250회 스캔, 15분간의 신호 획득시간(signal acquisition time)으로 InGaAs(Indium Gallium Arsenic) 검출기를 이용하여 0~4000 cm^-1 범위의 라만 스펙트럼을 얻었으며, 이 중 의미가 있는 900~1900 cm^-1 범위의 파장에 대하여 분석을 시행하였다.

통계 처리
   통계적 검증은 student t-test를 이용하였으며, p값이 0.05 미만인 경우를 유의성이 있는 것으로 간주하였다.

결     과

암조직과 주변 정상조직의 라만 분광 비교
   암조직과 주변 정상조직에서 1003 cm^-1, 1240 cm^-1, 1335 cm^-1, 1446 cm^-1, 1655 cm^-1에서 뚜렷한 정점(peak)이 관찰되었고, 이러한 라만 분광 파장에서 라만 분광 강도를 암조직과 정상조직에서 비교하였다. 전형적인 정점이 관찰되는 1446 cm^-1, 1240 cm^-1, 1335 cm^-1, 1655 cm^-1에서 주변 정상조직과 암조직 사이에 라만 분광 강도의 의미있는 차이를 보였고, 1446 cm^-1에서 가장 의미있는 라만분광강도 차이를 보였다(p=0.007)(Table 1, Fig. 1).

암조직과 주변 정상조직에서 라만 분광 강도의 비교
   1003 cm^-1, 1240 cm^-1, 1335 cm^-1, 1446 cm^-1, 1655 cm^-1에서 각 파장에서 상대적 강도를 비교하였다. 조사한 모든 파장의 강도 비율의 변화는 없었다(Table 2).

고     찰

   두경부 영역의 병변을 진단하는 데에는 조직검사에 의한 확진 이전이라도 진단이 가능한 여러 가지 내시경 진단방법이 있다. 육안적인 형태만을 관찰하는 일반적인 내시경 외에 새로운 형태의 내시경법으로 접촉 내시경 검사(contact endoscopy)와 형광 또는 자가분광법을 이용하는 내시경 검사 등이 있다. 접촉 내시경 검사는 세포 형태를 바로 확인할 수 있다는 장점이 있으나 표피층의 병변만 알 수 있고 시술자에 따라 해석이 다를 수 있다는 단점이 있으며¹²⁾ 형광분광법(fluorescence spectroscopy)은 광감작성 약물(photosensitizing drug)에 대한 과민반응이 단점이다.¹³⁾ 최근에는 광감작성 약물이 필요없는 자가형광(autofluorescence) 기술이 개발되었으며, Gillenwater 등¹⁴⁾은 자가형광법을 이용하여 구강암과 구강 정상 조직을 민감도 88%, 특이도 100% 정도로 구별이 가능하다고 하였다. Delank 등¹⁵⁾도 후두암에서 자가형광법을 이용하여 후두암과 후두의 정상조직을 비슷한 비율로 감별할 수 있지만 후두 양성질환의 진단율은 50% 이하라고 하였다. 접촉 내시경 검사를 이용한 암 진단의 정확성을 높이기 위해 메틸렌불루 조직염색을 시도하였으나 정확성이 낮고 또한 표피층의 이상소견만을 알 수 있다는 단점이 있었다.¹²⁾ 따라서 조직검사와 같은 정확도를 가지면서 빠른 시간내에 진단이 가능한 비침습적인 방법이 필요하며 이러한 방법은 수술의 절제연을 결정하는 데에 많은 도움을 줄 수 있다. 그 한 방법인 라만 분광법은 미지의 물질의 성분을 알기 위해 사용하던 것을 의학 분야에서 진단과 수술 절제연의 결정에 적용하기 위해 여러 가지 연구^{4)5)6)7)8)9)10)}가 시도되어 왔다.
   라만효과는 단색광의 빛이 물질에 충동하는 경우 입사된 단색광과 다른 새로운 빛이 비탄성적으로 산란되는 것을 의미한다. 라만산란은 분자구조에 특이적(molecular-specific)인 파장이 출현하기 때문에 비생물학 분야에서 분자의 구조와 특성을 밝히는 진동분광학(vibrational spectroscopy)이란 학문의 독자적인 영역을 구축하고 있다. 진동운동을 하고 있는 분자에 단색광의 입사광을 비추면 그 분자가 가지는 진동자들이 입사광의 에너지를 자신이 진동하는 에너지 만큼 흡수, 방출, 또는 아무 변화없이 그대로 통과시켜 입사광의 에너지와 다른 3가지 형태의 빛을 내놓게 되는데 이것이 라만 산란이다(Fig. 2A). 분자가 외부로부터 입사된 빛에너지(V₀)에서 일정 에너지(V₁)를 흡수하는 stokes scattering(V₀-V₁), 이미 들떠 있던 분자들로부터 에너지를 얻어서 더 높은 진동수를 가지는 anti-stokes scattering(V₀+ V₁), 그리고 입사광과 동일한 에너지를 내는 Rayleigh scat-tering이 기본 산란 현상이다(Fig. 2B). 이 세가지 산란 중 라만 분광법에서 가장 많이 사용하는 분야는 stokes scattering이다. stokes scattering의 세기는 진동에너지 준위가 zero(V=0)인 상태에 존재하는 분자들의 수에 비례하게 되는데 실내온도에서 대부분의 분자들은 대부분 zero 상태에 존재하게 되므로 stokes 밴드의 크기를 추적하면 zero 상태 분자들 수의 증감을 알 수 있게 된다. 입사광으로 유발된 에너지 크기(V₁)변화를 직접 측정할 수는 없지만, 새롭게 산란되는 빛이 Rayleigh scattering과 비교해 얼마만큼 에너지를 얻었는지 혹은 잃었는지를 관찰하므로써 V₁ 측정이 가능하다. 라만분광은 산란된 빛이 Rayleigh scattering에 대해 얼마만큼 이동(shift)되었는가를 라만이동(Raman shift)으로 표시하며, 라만이동은 분자의 진동 주파수에 해당한다. 따라서 라만분광을 이용해서 물질을 분석하는 경우 stokes 밴드의 위치에서는 특정 분자 구조의 진동 주파수를, 밴드의 크기(상대적 강도)에서는 분자들의 양을 측정할 수 있기 때문에 라만분광을 얻음으로써 물질의 특성과 분자구조를 규명할 수 있는 것이다(Fig. 3, Table 3).
   의학 분야에서 라만 분광법은 조직의 화학 구조와 분자 구조에 대한 특이적인 정보를 거의 실시간으로 제공할 수 있으며 비침습적으로 반복하여 시행할 수 있는 장점이 있다. 뿐만 아니라 라만분광기는 fiberoptic probe 형태로 검사가 가능하기 때문에 이러한 라만 분광기를 내시경에 부착하여 암을 진단하려는 시도도 있다. 이 경우 일반적인 내시경으로 진단할 수 없는 점막하 종양의 정보를 얻을 수 있다.¹⁰⁾
   암조직과 주변 정상조직을 구별하기 위한 라만 분광법의 분석하는 성분에는 호르몬, 효소, 면역 글로부린, 단백질, 핵산과 세포막 등이 있다. 이러한 구성 물질에 대한 상대적 강도(intensity)와 비율을 이용하여 암을 진단하고자 하는 것이다.
   Frank 등⁴⁾은 유방암에서 Near-IR 라만 분광법을 이용하여 정상 유방조직과 암조직을 감별하고자 하는 연구를 처음으로 시행하였다. Hawi 등⁵⁾은 정상 간, 간경화, 간암 조직에서 라만 분광법을 시행하여 라만분광 파장 1182 cm^-1/ 1156 cm^-1 정점의 강도 비율에 차이가 있는 것을 발견하였다. 이러한 차이는 phenylalanine, tyrosine 등의 단백질을 의미하는 라만분광 파장 1182 cm^-1의 정점 강도 차이라고 하였다. 정상 자궁, 염증, 전암 조직(precancerous tissue)을 비교한 연구에서 라만분광 파장 1070 cm^-1, 1656 cm^-1을 이용하는 경우 전암 조직과 염증 또는 정상조직과의 구별이 가능하였다고 보고하였다.²⁾ Boustany 등⁷⁾은 라만 분광법을 이용하여 아미노산과 핵산의 비율에 의해 정상 대장 조직과 대장암 조직을 구별하고자 하였다.
   그러나 Gniadecka 등⁶⁾은 피부의 양성조직과 암조직에서 라만 분광법을 시행하여 939 cm^-1, 1004 cm^-1, 1080 cm^-1, 1161 cm^-1, 1247 cm^-1, 1271 cm^-1, 1309 cm^-1, 1451 cm^-1, 2942 cm^-1, 2852 cm^-1 등에서 정점 강도를 비교한 연구에서 피부암은 일부의 양성 피부질환과는 감별이 가능하였지만 독특한 암의 정점은 발견하지 못하였다고 하였다.
   Wu 등⁹⁾은 Fourier transform infrared fiberoptic technique을 이용하여 구강암과 구강내 정상조직을 비교하였다. 정상조직에서는 C=O, C-H가 강한 결합을 나타내었으나, 암조직에서는 N-H, O-H가 강하게 결합하고 C=O결합은 상대적으로 약하다고 하였다. 1745 cm^-1의 강도와 amide Ⅱ band를 의미하는 1550 cm^-1 강도의 상대적인 값을 비교하는 것이 암조직과 정상조직을 구분하는데 중요하다고 하였다. 즉 I₁₇₄₅/I₁₅₅₀이 1 이상이면 정상, 1 이하면 악성일 가능성이 많다고 하였다. 지방성분이 암세포에서는 감소한다는 것이다. 이러한 것은 암세포의 특징이 계속적인 분화이므로 에너지원으로 지방을 많이 소모하여 조직 내에 지방성분이 적다는 것을 의미한다고 하였다.
   Stone 등⁸⁾은 교원질과 핵산(DNA)의 CH₃CH₂ wagging mode를 의미하는 정점인 1336 cm^-1과 단백질의 2차 구조 특히 α-나선구조를 반영하는 amide Ⅲ의 정점인 1250 cm^-1의 비율로서 후두암을 진단하고자 하였다. 이러한 1336 cm^-1과 1250 cm^-1의 강도 비율을 이용하는 경우 후두 정상조직에 대한 예상 민감도(prediction sensitivity)는 82.7%라고 하였고, 암의 예상 민감도는 91.7%라고 하였다. 그리고 라만분광을 기초로 한 후두암의 변화는 단백질이 α-나선구조에서 무작위 구조(random coil conformation)로의 변화와 핵산기의 C-H stretching bend의 변화라고 설명하였다. 본 연구에서는 라만파장 1003 cm^-1, 1240 cm^-1, 1335 cm^-1, 1446 cm^-1, 1655 cm^-1 중에서 후두 암조직과 주변 정상조직의 감별에 가장 의미가 있었던 파장은 1446 cm^-1이었다. 1446 cm^-1은 단백질과 지질의 CH₂ bending mode를 의미하는 것으로 이러한 부분에서 정상조직에 비해 암조직에서 큰 변화가 있었다는 것을 의미한다. 1335 cm^-1는 교원질과 핵산 CH₃CH₂ wagging mode을 의미하는 파장으로 암조직에서 주변 정상조직에 비해 교원질과 핵산의 구조가 변화했음을 나타낸다. 1240 cm^-1은 단백질의 2차 구조 특히 α-나선구조를 반영하는 것으로 정상조직에 비해 암조직에서 단백질의 구조 중 α-나선구조의 감소를 나타내며, 이것은 단백질의 β-병풍구조 혹은 무작위 구조 비율이 증가한 것을 의미한다. 1655 cm^-1은 단백질의 C= O stretching mode을 의미하는 파장으로 역시 α-나선구조를 반영하는 파장이다. 주변 정상조직에 비해 암조직에서 라만 1240 cm^-1과 1655 cm^-1 파장 감소는 단백질 α-나선구조의 감소와 β-병풍구조 혹은 무작위 구조 증가를 의미한다. 이러한 소견은 Stone 등⁸⁾의 연구와 일치하는 결과이다. 그러나 Stone 등이 후두암과 정상조직의 감별에 유용하다고 하였던 라만파장 1336 cm^-1와 1250 cm^-1의 강도 비율은 의미가 없었다.
   정상세포가 악성종양으로 이행하는 과정에서는 여러 가지 단백질 발현 유전자의 기능 이상이 발생한다. 이러한 이상은 단백질의 합성을 과도하게 증가시키거나 감소시키기도 하고 혹은 비정상적인 구조의 물질의 생성을 유도한다. 그러므로 암조직과 정상조직의 단백질, 지질, 핵산의 변화는 종양 발생을 이해하는데 유용한 단서를 제공하며, 이런 물질의 변화를 이용하여 진단에 응용할 수 있다. 조직 검사로 채취한 조직에서 시행한 라만 분광법의 in vitro 결과와 미래에 적용될 내시경에 부착하여 시행한 in vivo 결과와의 차이에 대한 추가적인 연구가 필요하다. 라만 분광법은 분자생물학적 측면에서 단백질, 지질과 핵산의 변화를 이용하여 암조직과 정상조직을 구별하는데 도움이 될 것으로 생각한다. 

결     론

   라만 분광법을 이용하여 후두암과 주변 정상조직 사이의 생화학 물질의 구조적 측면에서 차이점이 있는 것을 확인 할 수 있었다. 결론적으로 라만 분광법의 발달은 향후 비침습적인 진단기술로서 암의 조기 진단, 수술 중 절제연의 결정과 반복적인 조직검사를 피할 수 있는 유용한 방법으로 사료되었다. 

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