교신저자：박성국, 614-735 부산광역시 부산진구 개금동 633-165  인제대학교 의과대학 부산백병원 이비인후-두경부외과학교실
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서     론

   비용은 성장하는 양성종물로, 비용의 형성과 성장에 대한 여러 가지 기전들이 제시되고 있지만 그 병인에 대해서 아직 명확하게 밝혀진 것이 없다. 하지만 국소적 맥관형성과 간질 유출 등의 혈관 재형성이 비용의 성장과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.¹⁾ 
   비용의 성장에 중요한 맥관 형성은 저산소 환경에서 시작되며 전사요소인 hypoxia inducible factor-1α(HIF-1α)의 활성을 통해 다양한 유전자를 유도함으로 이루어진다.²⁾ HIF-1은 HIF-1α와 HIF-1β로 구성되며³⁾ HIF-1α와 HIF-1β 모두 세포 내에서 발현되나 정상 산소 분압내에서 HIF-1α는 산재되고 분해된다.⁴⁾ 저산소 환경에서는 HIF-1α의 분해 경로가 차단되어 HIF-1α는 안정화되고 핵내로 이동함으로써 HIF-1의 발현에 중요한 역할을 하며 대부분의 세포에서 측정할 수 없는 수준의 HIF-1 단백질을 유지시킨다.⁵⁾ 
   비용의 치료는 약물적 치료와 외과적 치료로 대별될 수 있다. 약물적 치료 중 스테로이드는 비용의 증상과 징후를 경감시키기 위해 가장 널리 사용되는 약물로써 비염 증상을 감소시키고, 비호흡을 개선시키며, 비용의 크기와 재발을 경감 시키나 대부분 치료의 효과는 일시적이다. Nucera 등⁶⁾은 비특이적 cyclooxygenase 억제제인 lysine acetylsalicylate의 비내 치료가 효과적으로 비용의 재발을 억제할 수 있으며, 생체외 실험에서 비용과 정상 피부 양측에서 비특이적 항증식 효과와 섬유아세포의 성장에 용량의존적인 효과를 가진다고 보고하였다.
   대부분의 비스테로이드성 항염증 약물들은 Cyclooxygenase(COX)-1과 COX-2를 억제하여 장기간 복용시 장간, 신장과 혈소판 기능의 유지에 필요한 COX-1 유도 prostaglandins의 합성을 억제하는것으로 알려져 있어 사용시 환자 치료에 한계가 있으나,⁷⁾ 선택적 COX-2 억제제는 염증성 COX-2를 억제하여 점막 방어와 연관된 하부위장관의 prostaglandin을 감소시키지 않으므로 비스테로이드성 항염증 약물들의 사용과 연관되어 나타나는 심각한 부작용을 유발하지는 않는 것으로 알려져 있다.⁸⁾ 또한 COX-2를 내재한 유전자의 발현은 저산소증에 의해 조절될수 있다.⁹⁾ 이에 저자들은 비용환자에서 선택적 COX-2 억제제가 비용에서 발현되는 HIF-1α에 어떤 영향을 미치는지 알아보고자 하였다.

대상 및 방법

환자 선택 
   비용을 동반한 만성 부비동염 환자 중 비알레르기 증상이 없고 Multiple allergen stimulation test(MAST)상 음성, 천식 및 아스피린 과민증의 과거력이 없는 환자 7명을 대상으로 하였다. 첫 번째 비용 조직 검사 전 이들 모두는 최소 4주간 국소적 또는 전신적 스테로이드, 비스테로이드성 항염증성 약물, 항히스타민제 및 마크로라이드계 항생제를 복용하지 않았다. 첫번째 비용조직 채취 후 모든 환자들은 선택적 cyclooxygenase 억제제(celebrex^®, 100 mg, twice daily)를 7일간 복용하였으며, 복용 직후 두번째 조직검사를 시행하였다. 채취된 모든 비용 조직은 eppendorf tube에 넣은 후 실험실에서 즉시 RNA를 분리하였으며, 일부는 면역조직화학적 검사를 위해 10% 포르말린에 저장하였다.

RNA 분리 
   채취된 비용 조직 50~100 μg에 TRI reagent(Molecular Research Center, OH, USA) 1 mL을 가하고 Tissue-Tearor(BioSpec Products, Racine, WI, USA)를 이용하여 미세하게 분쇄한 후 시약제조회사에서 제공하는 방법에 따라 total RNA를 분리하였으며, 분리된 RNA는 80 units/ml의 RNasin(Promega, San Luis Obispo, CA, USA)이 들어있는 핵산분해효소 불포함 정제수 50~100 μL에 용해시켰다. RNA의 농도는 spectrophotometer를 이용하여 260 nm에서 흡광도를 측정함으로써 결정하였고, 1% agarose gel에서 전기영동하여 RNA의 손상여부를 확인하였다. 

준정량적 역전사-중합효소연쇄반응 
   Total RNA 1 μg을 first strand cDNA 합성에 사용하였다. 먼저, RNA에 random hexamer 100 pmoles(Amersham pharmacia biotech, Uppsala, Sweden)을 가하여 70℃에서 3분간 가열한 후 얼음으로 옮겨 2분간 급속히 냉각함으로써 annealing시키고 AMV reverse transcriptase(Promega, San Luis Obispo, CA, USA) 2 units, Rnasin (Promega, San Luis Obispo, CA, USA) 4 units, 5X 반응버퍼 4 μL, dNTP(각각 2.5 mM) 4 μL와 핵산분해효소 불포함 정제수를 가하여 최종부피 20 μL를 맞춘 후 42℃에서 90분간 반응시켰다. 역전사반응 산물(cDNA)은 PCR 실험에 사용될 때까지 -20℃에서 보관하였다. HIF-1α 유전자발현을 정량화하기 위해 Ambion사의 QuantumRNA 18S internal standard kit(Classic II)(Ambion Inc., Austin, TX, USA)를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. HIF-1α 유전자를 증폭하기 위해 5'-TGGAC TCTGA TCATC TGACC-3'(sense)과 5'-CTCAA GTTGC TGGTC ATCAG-3'(antisense) primer 쌍을 사용하였고 증폭된 DNA의 길이는 434 bp였다. 또한 HIF-1α와 18S rRNA의 PCR에 최적인 18S rRNA primers대 competimers의 비율로 2대 8의 비율을 적용하였으며, PCR은 역전사반응 산물 2 μL를 template로 사용하여 각 Primer당 10 pmol, 각 dNTP 당 0.2 mM, Taq DNA polymerase(Promega, San Luis Obispo, CA, USA) 1 unit, PCR buffer, 18S rRNA primer와 competimer가 포함된 총 부피 20 μL로 수행하여, 18S rRNA로부터 324 bp fragment가 증폭되었다. 반응액을 94℃에서 5분간 pre-denaturation한 후, 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초의 반응을 20회 반복하였으며 최종적으로 72℃에서 5분간 post-extension하였다. 5 μL의 PCR 산물은 8% polyacrylamide gel에서 전기영동한 후 ethidium bromide로 염색하였으며, 염색된 RNA band의 양은 Gel-Doc 2000(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)과 Quantity One software, version 4.3.1(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 정량화하였으며, HIF-1α의 발현정도의 결과는 HIF-1α로부터 증폭된 band의 양을 18S rRNA band의 양으로 나눈 수치로 나타내었다.

Tissue Microarray 제조 및 면역조직화학염색 
   생검된 조직을 PBS로 10배 희석한 formalin에 담가 24시간동안 고정한 후 통상적인 과정을 통하여 탈수 후 파라핀 블록을 제조하였다. Manual Tissue Arrayer MTA-1(Beecher Instruments, Sun Prairie, WI, USA)를 이용하여 tissue microarray를 제조하였다. 제조 과정은 각 파라핀 블록으로부터 지름 0.6 mm의 2~3개의 원통 모양으로 조직절편을 찍어낸 후 비어있는 새로운 파라핀 블록에 격자 모양으로 조직절편을 심었다. 각 TMA 블록을 5 μm 두께로 깎아내어 silane이 도포된 유리 슬라이드에 부착시켰으며 탈파라핀 과정과 재세척 후, 각 절편들은 10 mM citrate buffer(pH 6.0)에서 전자레인지에서 10분간 가열 후 PBS에서 3% 과산화수소수를 첨가하여 10분간 처리하였다. DAKO LSAB^® System Blocking Solution(DAKO Corp., Caripinteria, CA, USA)을 가하여 실온에서 30분간 반응시킨 후 각 절편들은 Antibody Diluent(DAKO Corp., Caripinteria, CA, USA)에 1：200 희석된 mouse anti-HIF-1α monoclonal antibody(Novus-Biologicals, Gilbert, AZ, USA)에 14℃에서 하룻밤동안 반응시켰다. 조직들은 hematoxylin (Muto Pure Chemicals, Tokyo, Japan)으로 counterstaining하였다. HIF-1α 단백질의 발현은, 발현의 분포(전체 세포 중 특정 단백질을 발현하는 세포의 비율)를 0(none), 1(<25%), 2(25~50%), 3(>50%)으로 판정하고, 발현의 강도를 1(정상상피세포와 비교하여 발현 강도가 유사하거나 낮은 경우), 2(약간 높은 경우), 3(매우 높은 경우)으로 판정한 후, 분포와 강도를 곱한 값(9점 만점)으로 평가하였다. 

통계학적 처리 
   통계학적 검증은 SAS(release 8.1) 통계 패키지를 이용하여 Student T-test를 시행하였다. 결과는 평균±표준편차로 표시하였고 통계학적인 유의성은 p값이 0.05 미만인 경우로 하였다.

결     과

HIF-1α mRNA의 발현 
   선택적 COX-2 억제제로 치료 받기 전 환자의 비용조직과 치료받은 후의 비용 조직 모두에서 18S rRNA는 PCR에 양성이었고 모든 비용 조직에서 HIF-1α도 발현되었다. RT-PCR에서 HIF-1α mRNA의 발현은 선택적 COX-2 억제제로 치료 받기 전의 환자의 비용에서는 1.14±0.39, 선택적 COX-2 억제제로 치료 받은 후의 비용에서는 1.12±0.39로 HIF-1α mRNA의 발현은 두 군간 유의한 차이를 보이지 않았다(Fig. 1, p>0.05).

HIF-1α의 면역 조직화학 분석 
   모든 비용 조직에서 HIF-1α 염색은 대부분 가중층원주상피세포의 핵에서 발현되었으며, 림프구와 조직구 등의 염증세포와 혈관 내피세포에서는 간질에서 발현되었다. 대부분의 경우 HIF-1α의 세포내 염색부위는 세포의 핵이지만, 가끔씩 조직구의 세포질에서도 발현되었다(Fig. 2). HIF-1α의 발현은 선택적 COX-2 억제제로 치료받기 전의 환자의 비용에서 2.71±1.25, 선택적 COX-2 억제제로 치료받은 후의 환자의 비용에서 3.00±1.73로, HIF-1α 단백질의 발현은 두 군간 유의한 차이를 보이지 않았다(Fig. 3, p>0.05).

고     찰

   비스테로이드성 항염증 약물들은 arachidonic acid를 prostagladins, thromboxanes, prostacyclin으로 변환하는 cyclooxygenase 효소들을 차단한다. 아스피린과 비스테로이드성 항염증 약물들은 eosinophilic rhinosinusitis, nasal polyposis, aspirin sensitivity, asthma를 특징으로 하는 아스피린 감수성 천식이 있는 경우에는 피해야 하나 선택적 COX-2 억제제는 내성이 있어 안전하게 사용할 수 있다.¹⁰⁾
   COX 효소는 두개의 clone을 가지고 있으며, 그 중 하나인 COX-1은 조직항상성의 유지에 중요하게 작용하며, 다른 하나인 COX-2는 병적인 합병증을 야기하는 prostagladins 합성에 관여하고 있다.¹¹⁾ Yun 등¹²⁾은 COX-2의 발현양이 정상 비점막과 비교할 때 비알레르기성 비용종에서 많았다고 보고하였으며, Liu 등¹³⁾은 COX-2가 혈관확장을 촉진시키고 비용의 섬유아세포들에서 사이토카인 유도 interleukin-6 유전자의 발현율을 높임으로써 비용을 성장시킨다고 하였다.
   COX-2를 포함한 유전자의 발현은 저산소증에 의해 조절될 수 있으며, 이러한 저산소증은 맥관형성을 조절함으로 혈관 내피세포의 분열유발 능력을 변화시킨다.⁹⁾ 또한 저산소증은 혈관생성 자극 이외에 세포 성장과 혈관 재형성을 억제하는 항분열유발 요인(nitirc oxide, prostacyclin)들의 방출을 제한한다.¹⁴⁾ 저산소 환경은 HIF-1이라고 불리는 전사 요소를 활성화하며,¹⁵⁾ HIF-1의 β-아단위의 단백질 수준은 일정한데 반해 α-아단위의 단백질 수준은 산소 농도에 많은 영향을 받아 정상 산소 분압 하에서는 ubiquitin-proteasome 경로를 통해 급속히 파괴되나 낮은 산소 분압 하에서는 매우 증가된다.¹⁶⁾ 따라서 저산소증은 핵 내에 급격한 HIF-1α의 축적을 유발하며 vascular endothelial growth factor(VEGF)와 여러 목표 유전자의 전사활성을 일으킨다.¹⁷⁾
   HIF-1α와 선택적 COX-2 억제제의 관계에 대하여 Jone 등¹⁸⁾은 비선택적 비스테로이드성 항염증약물과 선택적 COX-2 억제제가 저산소증에 의한 맥관형성과 HIF-1α의 축적 및 VEGF와 Flt-1의 발현을 억제한다고 보고 하였으며, 또한 생체외 실험에서 비스테로이드성 항염증약물들은 위장간의 미세혈관 내피세포들의 von Hippel-Lindau(VHL) 종양 억제 유전자의 발현을 증가시킴으로 인해 VEGF와 Flt-1의 발현을 억제함으로써 내피세포에서 저산소증 유도 맥관형성을 억제하고 그 결과 HIF-1α의 저하와 편재를 야기한다고 주장하였다. 반면 Ito 등¹⁹⁾은 위장간의 표면 상피세포에서 HIF-1α의 발현 정도가 corpus나 antrum 모두에서 비스테로이드성 항염증 약물들을 복용하지 않은 환자에 비해 비스테로이드성 항염증 약물들을 복용한 환자에게 통계학적으로 높게 발현된다고 하였다. 또한 Palayoor 등²⁰⁾은 전립선 암 세포에서 비스테로이드성 항염증 약물들이 HIF-1α의 양을 감소시키나 선택적 COX-2 억제제는 HIF-1α를 억제하지 않는다고 보고하였다. 
   비스테로이드성 항염증 약물들이 미세분자 농도에서는 prostaglandin 생성을 억제하나 그 이상의 농도가 되어야 세포 독성이나 전사요소의 억제 등을 일으킬 수 있으며, 생체외 실험에서 선택적 COX-2 억제제는 prostaglandin 의존성 요소와 prostaglandin 비의존성 요소를 가진다고 알려져 있다. 본 연구에서는 선택적 COX-2 억제제를 투여하기 전의 환자의 비용과 투여한 후의 환자의 비용 사이에 HIF-1α mRNA와 단백질의 발현에 유의한 차이가 나타나지 않았다.¹⁸⁾ 이는 본 연구에서 사용한 선택적 COX-2 억제제의 용량이 비용에서 HIFs의 억제에 필요한 농도에 미치지 못했을 가능성과 HIFs와 HIF 조절 유전자의 억제에 COX-2 억제보다 더 큰 영향을 미치는 요소가 있을 수 있다는 것을 시사한다. 따라서 향후 선택적 COX-2 억제제의 약물용량에 따른 HIFs의 억제 여부 및 비스테로이드성 항염증 약물들의 HIFs와 HIF 조절 유전자의 억제에 대해서는 더많은 연구가 이루어져야 할 것이다. 

결     론

   선택적 COX-2 억제제는 비용 조직에서 발현된 HIF-1α을 억제하지 못하였으나, 비용 환자에서 선택적 COX-2 억제제의 효과를 알기 위해 더 많은 연구가 필요할 것으로 사료된다. 

1. Coste A, Brugel L, Maitre B, Boussat S, Papon JF, Wingerstmann L, et al. Inflammatory cells as well as epithelial cells in nasal polyps express vascular endothelial growth factor. Eur Respir J 2000;15: 367-72.

2. Ten VS, Pinsky DJ. Endothelial response to hypoxia: Physiologic adaptation and pathologic dysfunction. Curr Opin Crit Care 2002;8: 242-50.

3. Wang GL, Jiang BH, Rue EA, Semenza GL. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O₂ tension. Proc Natl Acad Sci USA 1995;92:5510-4.

4. Wang GL, Semeza GL. Purification and characterization of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem 1995;270:1230-7.

5. Kallio PJ, Wilson WJ, O'Brien S, Makino Y, Poellinger L. Regulation of the hypoxia-inducible transcription factor 1alpha by the ubiquitin-proteasome pathway. J Biol Chem 1999;274:6519-25.

6. Nucera E, Schiavino D, Milani A, Del Ninno M, Misuraca C, Buonomo A, et al. Effects of lysine-acetylsalicylate (LAS) treatment in nasal polyposis: To controlled long term prospective follow up studies. Thorax 2000;55:S75-8.

7. Tenenbaum J. The epidemiology of nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Can J Gastroenterol 1999;13:119-22.

8. Leahy KM, Ornberg RL, Wang Y, Zweifel BS, Koki AT, Masferrer JL. Cyclooxygenase-2 inhibition by celecoxib reduces proliferation and induces apoptosis in angiogenic endothelial cells in vivo. Cancer Res 2002;62:625-31.

9. Patriarca G, Belloi P, Nuccra E, Schiavino D, Papa G, Schinco G, et al. Intranasal treatment with lysine acetylsalicylate in patients with nasal polyposis. Ann Allergy 1991;67:588-92.

10. Szezeklik A, Stevenson DD. Aspirin-induced asthma: Advances in pathogenesis, diagnosis, and management. J Allergy Clin Immunol 2003;111:913-21.

11. Seibert K, Zhang Y, Leahy K, Hauser S, Masferrer J, Perkins W, et al. Pharmacological and biochemical demonstration of the role of cyclooxygenase 2 in inflammation and pain. Proc Natl Acad Sci USA 1994; 91:12013-7.

12. Yun CB, Lee BH, Jang TJ. Expression of glucocorticoid receptors and cyclooxygenase-2 in nasal polyps from nonallergic patients. Ann Otol Rhinol Laryngol 2002;111:61-7.

13. Liu CN, Hong CY, Shun CT, Hsiao TY, Wang CC, Wang TS, et al. Inducible cyclooxygenase and interleukin 6 gene expression in nasal polyp fibroblasts. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 2002;128: 945-51.

14. Jeffery TK, Wanstall JC. Comparison of pulmonary vascular function and structure in early and established hypoxic pulmonary hypertension in rats. Can J Physiol Pharmacol 2001;79:227-37.

15. Semenza GL. Hypoxia-inducible factor 1: Master regulator of O₂ homeostasis. Curr Opin Genet Dev 1998;8:588-94.

16. Salceda S, Caro J. Hypoxia-inducible factor 1alpha(HIF-1alpha) protein is rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome system under normoxic conditions. Its stabilization by hypoxia dependents on redox-induced changes. J Biol Chem 1997;272:22642-7.

17. Semenza GL. HIF-1 and human disease: One highly involved factor. Genes Dev 2000;14:1983-91.

18. Jones MK, Szabo IL, Kawanaka H, Husain SS, Tarnawski AS. Von Hippel-Lindau tumor suppressor and HIF-1alpha: New targets of NSAID inhibition of hypoxia-induced angiogenesis. FASEB J 2002; 16:264-6.

19. Ito M, Tanaka S, Kim S, Kuwai T, Matsutani N, Kamada T, et al. The specific expression of hypoxia inducible factor-1alpha in human gastric mucosa induced by nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Aliment Pharmacol Ther 2003;18:90-8.

20. Palayoor ST, Tofilon PJ, Coleman CN. Ibuprofen-mediated reduction of hypoxia-inducible factors HIF-1alpha and HIF-2alpha in prostate cancer cells. Clin Cancer Res 2003;9:3150-7.