교신저자：권순영, 425-707 경기도 안산시 단원구 고잔1동 516  고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
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서     론

   상부소화기도를 중심으로 진행성 국소 파괴의 특징을 보이는 비부비강의 NK/T cell lymphoma는 한국, 중국, 일본과 같은 극동 아시아 국가에서 서구보다 흔하게 발생하며,¹⁾²⁾ Epstein-Barr virus 감염과 많은 연관성이 있는 것으로 알려져 있다.³⁾⁴⁾ 그러나 이 질환은 병변의 괴사가 심하여 생체조직을 통한 분자생물학적 연구를 시행하기 어려워 비부비강의 NK/T cell lymphoma의 발병기전에 대하여는 알려진 것이 적다.
   c-kit 유전자는 tyrosine kinase receptor gene으로 비만세포, 흑색세포, 조혈간세포, interstitial cells of Cajal에서 발현되는 proto-oncogene이다. 이러한 c-kit 유전자 단백이 발현되는 종양으로 mastocytosis, gastrointestinal stromal tumors(GIST), natural killer/T-cell lymphoma, acute myeloid leukemia, myeloproliferative disorder 등이 있으며 이 단백의 발현은 종양의 침윤이나 전이에 관여하고 예후와 관련이 있다고 알려져 있다.⁵⁾⁶⁾
   1996년 Kitayama 등⁷⁾은 c-kit receptor tyrosine kinase의 유전적 변이가 정상 조혈세포의 악성세포전환에 영향을 미치는 것으로 보고 하였다. 따라서 c-kit 유전자의 유전적 다양성이 NK/T cell lymphoma의 발생에도 관련이 있을 것으로 생각되어서 2000년 Hongyo 등¹²⁾은 중국과 일본에서 비부비강 NK/T cell lymphoma의 c-kit 유전자의 유전적 변이를 보고하였으나 c-kit 유전자의 다양성과 NK/ T cell lymphoma와의 관련성은 아직 불확실하다.
   이에 저자들은 본원에서 두경부 영역의 NK/T cell lymphoma로 진단 받은 환자의 표본을 대상으로 PCR-SSCP (polymerase chain reaction-single stand conformational polymorphism) 방법과 sequencing을 통해 한국인에서 c-kit 유전자의 다양성을 알아보고자 하였다. 

대상 및 방법

대  상
   본원에서 1995년 부터 2002년 까지 NK/T cell lymphoma로 진단된 후 항암요법 및 방사선치료를 받은 환자의 표본 중 비교적 상태가 양호한 27예를 대상으로 하였다. 
   조직 검사상 다양한 정도의 괴사가 병변 부위에서 발견되었고, 비정형의 큰 단핵 또는 다핵세포가 미만성으로 침윤하면서 다양한 수의 림프구, 형질세포, 대식세포들이 혼재되어 다형성의 모습을 띠고 있었다. 모든 예는 CD56, CD3, CD79a, CD45RO 등에 대한 면역조직화학적 염색을 시행하여 NK/T cell lymphoma로 진단된 예였다.
   원발병소는 비강 15예, 비인강 6예, 편도 4예, 경구개 2예였다. 남녀의 성별비는 2.4：1로 남자의 빈도가 많았다. 진단당시 연령은 19세부터 87세로 중앙연령은 46세였다.

C-kit 유전자에 대한 PCR-SSCP 방법

파라핀 포매조직에서 DNA추출
   숙련된 병리의사에 의하여 정상주위조직을 제외한 병변이 있는 것으로 생각되는 파라핀 블록의 부위를 골라서 10 um 두께로 4조각씩 박절한 후 eppendorf tube에 넣은 다음 파라핀을 제거하기 위해 xylene 1 ml을 가한 후 56℃에서 5분동안 방치하였다가 13,000 rpm으로 10분간 24℃에서 원심분리를 하였다. 이런 과정을 3회 반복하였다. 무수메탄올 1 ml을 각각 가하고 5분간 방치한 후 10,000 rpm에서 8분간 원심분리하였다. 과정을 3회 반복한 후 알코올을 제거하기 위해 상온에서 완전히 시료를 건조시켰다. High Pure PCR Template Preparation Kit에서, tissue lysis buffer 200 μl과 Proteinase K 40 μl을 가한 후 56℃에서 24시간 방치하였다. binding buffer 200 μl을 가한 후 혼합하여 72℃에서 10분간 방치하고 isopropanol 100 μl과 혼합하였다. 8000 rpm에서 원심분리를 1분간 한 후 collection tube를 교체하였다. Inhibitol Removal Buffer 500 μl을 넣고 8000 rpm에서 1분간 원심분리 시키고 washing buffer 500 μl를 가한 후 원심분리하고 collection tube를 버리고 1.5 ml reaction tube에 filter tube를 끼웠다. 마지막으로 72℃ elution buffer 200 μl를 filter tube에 가한후 1분간 원심분리 하고 microfuge tube에 DNA를 얻어 -20℃에서 보관하여 template DNA로 사용하였다. 

중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction)
   C-kit exon 9, 11, 13, 17에 대해 PCR을 실시하였다. 증폭시킬 각 DNA 2 μl(200~400 ng), primer 각각 1.5 μl, 2 μl dNTP , 2 μl buffer , 0.2 μl Taq polymerase를 가하여 20 μl되게 한 후 PCR thermal cycler(Perkin Elmer 2, 400)을 사용하여 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초간의 반응을 44회 반복하였다(exon11, 17；44 cycle, exon9, 13；40 cycle). 증폭된 PCR 산물을 1.5% agarose gel에서 전기영동으로 확인하였다.
   C-kit, exon 9
      Forward(sense)：5 TTT GGA AAG CTA GTG GTT CA-3
      Reverse(antisense)：5 ATG GTA GAC AGA GCC TAA AC-3
   C-kit, exon 11
      Forward(sense)：5 ATT, ATT, AAA, AGG, TGA, TCT, ATT, TTT, C-3
      Reverse(antisense)：5`ACT, GTT, ATG, TGT, ACC, CAA, AAA, G-3
   C-kit, exon 13 
      Forward(sense)：5 ATT TTG AAA CTG CAC AAA TGG TCC TT-3
      Reverse(antisense)：5 GCA AGA GAG AAC AAC AGT CTG GGT AA-3
   C-kit, exon 17
      Forward(sense)：5 TTC, ACT, CTT, TAC, AAG, TTA, AAA, TG-3
      Reverse(antibody)：5 GGA, CTG, TGA, AGC, AGA, GAA, TG-3`

Single stand conformational polymorphism(SSCP) 및 Sequencing에 의한 유전자 변이조사
   PCR산물을 10 μl를 취해 끓이면서 변성시킨 후, 얼음으로 급히 냉각시킨 다음, 5% glycerol을 포함한 12% polyacrylamide gel에서 250 V로 5시간 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 gel은 10% ETOH로 10분간 고정시켰다. 아래 기술한 은 염색법으로 DNA Single band pattern을 확인하였다.
   먼저 gel을 1% nitric acid에서 3분 담근 다음 증류수를 가해 3분간 세척하고 다시 0.2% silver nitrate 용액(0.2% silver nitrate, 300 μl formaldehyde(37%), 200 ml D.W)을 30분간 반응시킨 후 재빨리 증류수로 세척하였다. 발색용액(6 g sodium carbonate, 120 μl formaldehyde, 200 ml D.W, 100 μl sod. thiosulfate(1%))을 가한 후 band가 뚜렷이 보일 때까지 반응시키고 10% glacial acetic acid로 고정 시켰다. 양성대조군으로 정상인의 혈구세포에서 분리한 DNA를 이용하여 SSCP band 양상을 비교 검토하였고 3730 AB1 applied biosystem에서 sequence를 확인하였다.

결     과

PCR-SSCP 결과
   c-kit 유전자의 유전자 변이 여부를 확인하기 위하여 PCR-SSCP를 시행한 결과 총 27예 중 5예에서 유전자 변이가 관찰되었다. 이 중 3예에서 exon 11, 1예에서 exon 17, 1예에서 exon 9와 exon 11에서 동시에 유전자 변이가 관찰되었다(Fig. 1).

Sequencing 결과
   DNA sequence analysis 결과 exon 11의 유전자 변이를 보였던 2예에서 염기서열의 변이가 관찰되지 않아 NK/T cell lymphoma 27예 중 3예(11%)에서 c-kit gene에 대한 유전자 변이가 확인되었다(Fig. 2, Table 1).
   3예가 각각 exon 9,11,17에서 아미노산의 염기서열 변화를 나타냈다. 
   Exon 11에 변이를 보인 1예에서는 CAA→CGA, TCA→TGA로 GAT→GT, AAA→TA 두 가지 아미노산은 A de-letion되었음을 보여주었다. Nucleotide 염기서열의 변화됨으로 인해 각각 K559→E, V561→Q, N568→D, K592→Q로 아미노산이 변화되었다.
   Exon 17인 경우는 CAC→CTC, CGA→CCA로 염기서열이 바뀌어 T808→S, V793→I로 아미노산이 변화되었고, exon 9의 1예에서는 CGT→TCGT, CAT→CATT, ATG→ATTG로 변화하여 모두 T insertion 양상을 띠었고 TAG→TAGG로 변화되었음을 보여주었다. 이로 인한 아미노산의 변화는 각각 S482→A, V486→I, D495→E, D500→E와 같았다.

고     찰

   말초성 T 세포 림프종은 과거에는 여러가지 명칭으로 혼용되어 사용되어왔다. 1966년 Eichel 등에 의해 다형성 세망증(polymorphic reticulosis)으로 처음 명명되었고, 비강이나 부비동 등의 상기도에 호발하여 진행성이며 파괴적인 괴사를 일으키는 림프구의 종양성 증식질환으로 설명하였다. 여러가지 명칭으로 혼용되어 오다가 모든 질환에서 공통적으로 혈관중심적이고 혈관파괴적인 림프세망세포 들의 침윤을 보이는 병변이 관찰되어, Jaffe 등은 공통적인 조직학적 특징을 살린 "angiocentric immunoproliferative lesions"(AILs)라는 용어를 제안하였고 말초성 T 세포 림프종과 동일한 질병임이 밝혀졌다.^9)10)11)
   유병율은 한국, 중국, 일본 등의 아시아 국가에서 서구국가에 비하여 높고, 정확한 원인은 밝혀져 있지 않으나 최근 분자유전학적으로 종양세포에서 Epstein-Barr virus가 검출됨으로써 이러한 virus 감염이 주요한 병인일 것으로 생각하고 있다.³⁾⁴⁾
   질병 발생시의 평균연령은 북부 중국에서 36.5세, 한국에서 41.0세, 일본에서 61.0세로 보고 되었다.⁸⁾ 이번 연구에서 환자들의 평균연령은 46.0세로 기존의 통계와 큰 차이를 보이지 않았고, 일본에 비해서는 한국과 북부 중국의 발병연령이 낮은 것을 다시 확인할 수 있었다. 극동 지역의 아시아 국가들 간의 이와 같은 발병연령의 차이는 비부비강 NK/T cell lymphoma에 대한 원인 인자의 차이나 감수성의 차이 때문으로 생각되어지고 있으며, 이러한 원인 인자의 차이가 다른 형태의 유전자 변이로 나타날 수 있다고 생각된다.⁸⁾
   림프종은 림프계 세포의 oncogene과 tumor suppressor gene에 영향을 미치는 유전적 병변이 축적되어 형질전환으로 인한 클론증식에 의해 발생하며, 비부비강 NK/T cell lymphoma에서 p53, K-ras, c-kit, β-catenin 등의 유전자의 변이가 관찰되고 있다.⁸⁾
   c-kit proto-oncogene의 단백질 산물은 tyrosine kinase receptor로서¹²⁾ hematopoetic stem cells, mast cells, interstitial cells of Cajal의 분화와 증식에 결정적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다.⁵⁾⁶⁾
   Stem cell factor가 recepter tyrosine kinase(KIT)에 부착되면 intracellular domain에 존재하는 tyrosines이 auto-phosphorylation된다. 이에 따라 KIT이 dimerization 되는 과정을 거쳐 세포분열 과정이 조절된다. 그러나 c-kit 유전자 변이가 일어나면 stem cell factor와 같은 ligand가 부착되지 않은 상태에서 phosphorylation이 일어나고 KIT이 활성화 되어 세포의 과다분열이 발생하게 된다.¹³⁾¹⁴⁾
   비부비강의 NK/T cell lymphoma에서 c-kit gene의 변이는 여러가지 다양한 domain에서 관찰되고 있으나 이러한 변이의 기능적인 결과로 c-kit 유전자 변이가 단백 발현을 일으킨다는 연구 보고는 아직 없는 상태이고, 정상 조직을 제외한 종양에서만 유전자 변이가 관찰되는 것인지에 대한 사실은 아직은 불분명한 상태이다. 이번 실험에서도 유전자 변이가 생긴 예들의 결과가 기존에 보고된 codon 보다 다양한 양상을 나타내었고, 유전자 변이로 인한 발병기전을 유추하기에는 한계가 있었다.
   이러한 c-kit gene의 변이율은 한국에서 11.9%, 북부 중국에서 71.4%, 일본에서 5.5% 등으로 지역적 차이를 보이고 있다.⁸⁾¹²⁾ 본 연구에서 c-kit gene의 유전자 변이율은 11%(3/27)로 일본의 변이율보다 높았고 북부 중국보다 낮았으나, 한국에서의 연구인 11.9%와 큰 차이를 나타내지 않았다.⁸⁾
   Epstein-Barr virus 감염이 NK/T cell lymphoma의 주요한 병인일 것으로 생각되고 있어 Epstein-Barr virus 감염율의 지역적 차이나 인종 및 환경적 차이, 생활습관의 차이가 지역마다 다른 유전자 변이율의 한 원인이 될 것으로 생각된다.
   본 연구에서는 표본의 수가 적고 변이를 관찰할 수 있었던 숫자가 제한되어 해석에 제한점으로 작용할 수 있을 것으로 생각된다. 향후 더 많은 표본과 다양한 oncogene, tumor suppressor gene 변이에 대한 연구를 통하여 NK/T cell lymphoma 병인의 이해를 높일 수 있을 것으로 사료된다.

결     론

   NK/T cell lymphoma 27예를 대상으로 한 c-kit 유전자 변이 검사결과 3예(11%)에서 유전자 변이가 관찰되어 북부 중국의 변이율 보고와는 큰 차이를 보였고 일본과는 유사한 결과를 얻을 수 있었다. 

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