교신저자：동헌종, 135-710 서울 강남구 일원동 50번지  성균관대학교 의과대학 삼성서울병원 이비인후과교실
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서     론

   알레르기 질환의 빈도는 최근 이십 년간 꾸준히 증가하고 있으며 사회가 발전할수록 그 정도가 심해지는 경향을 보이고 있다. 동시에 알레르기 비염의 원인이나 기전, 치료에 대한 관심이 높아지고 있어 알레르기 환자의 병리와 유사한 동물 모델의 필요성이 증가하고 있으며, 마우스, 백서, 토끼, 그리고 기니픽 등 다양한 동물에서 알레르기 모델이 시도되고 있다. 이중 백서(Sprague-Dawley rat)는 동물실험 시 가장 흔히 사용되고 있지만, 알레르기 모델 형성 시 20% 이하에서 알레르기 초기 반응이 관찰되고, 알레르겐 특이 IgE의 발현 또한 낮고, 인간에서 관찰되는 알레르기의 병리와는 일치하지 않은 면이 많아 알레르기 동물모델로는 적절치 못한 면이 있다.¹⁾ 반면 알레르기 천식모델에서 명확한 기도염증과 기관지 과민성을 나타내며 기도과민성 실험에 흔히 사용되는 동물인 Brown-Norway rat은 인간에서의 알레르기와 가장 유사한 알레르기 반응을 나타내며,²⁾³⁾⁴⁾ 감작 시 대부분의 실험동물에서 알레르기 초기 반응의 지표인 알레르겐 특이 IgE의 급격한 상승이 관찰된다.⁵⁾ 더욱이 백서에 비해서 Brown-Norway rat에서는 알레르겐 감작 시 발현하는 Th1 사이토카인인 tumor necrosis factor(TNF) 발현이 더 낮으며, 반면 Th2 사이토카인인 IL-10, IL-13의 생산이 높은 것으로 보고되었다.⁶⁾ 또한 Th1 반응을 억제하는 것으로 알려져 있는 산화질소의 생산은 백서에서 적은 것으로 보고되었다.³⁾⁷⁾
   이러한 특징들로 인하여 최근 알레르기비염의 연구에서도 Brown-Norway rat의 사용이 보고되고 있으나,⁸⁾⁹⁾ 아직 한국에서의 사용보고는 없는 실정이다.
   이에 본 연구에서는 알레르기비염에 적합한 모델을 만들기 위하여 Brown-Norway rat에서 난알부민(ovalbumin)을 이용하여 알레르기 비염모델을 만든 후에 이들 마우스에서 재채기 등의 알레르기 비염증상과 혈청 알레르겐 특이 IgE 수치를 관찰하고, 특히 후기 알레르기 반응에서 관찰되는 비점막의 호산구 침윤 정도를 관찰하였다. 또한 알레르기 비염모델을 형성하는 데 있어 저자에 따라 국소감작의 기간을 다양하게 사용하고 있어, 국소감작의 기간에 따른 알레르기 반응이 최대화되는 시점을 찾아보려 하였다.

재료 및 방법

알레르기비염 모델의 형성
   실험동물로는 생후 3주일된 외견상 건강하고 비공이 깨끗한 27마리의 암컷 Brown-Norway rat을 실험군 18마리와 대조군 9마리로 나누어 실험하였다. 실험군은 각각 6마리씩 1) 1주 동안 난알부민에 대한 국소감작을 시행한 군, 2) 4주 동안 국소감작을 시행한 군, 3) 8주 동안 국소감작을 시행한 군으로 나누어 실험하였으며, 난알부민(chicken egg albumin, grade V, Sigma Chemical Co. Phillipsberg, NY) 1.0 mg과 수산화 알루미늄(Al(OH)₃)겔 4.0 mg을 식염수에 혼합하여 1 ml의 혼합액을 만든 후 후두부에 피하 주사하고 이와 동시에 보조용액(pertussis toxin 50 ng+0.5 ml PBS)을 복강 내 주사하여 전신감작을 시행하였으며, 1주 뒤 같은 방법으로 전신감작을 반복하였다. 2차 전신감작 7일 후부터 매일 15분씩 0.1 gm%의 난알부민 용액을 4.6 μm 이하의 입자크기를 가지는 Pulmo-aide compressor nebulizer(Sunrise medical, NY, USA)를 이용하여 비강 내 국소감작시켰다. 국소감작기간은 실험군에 따라 각각 1주, 4주, 8주간 시행하였다.
   대조군의 쥐에게는 3마리씩 군을 나누어 알레르겐이 섞이지 않은 생리식염수와 PBS를 실험군과 같은 방법으로 주사하고 2주일 후부터 매일 15분씩 동량의 식염수를 각각 1주, 4주, 8주간 분무하였다.

Passive cutaneous anaphylaxis(PCA) 검사
   PCA test는 감작항체(reaginic antibody)생성 유무를 확인하기 위한 체내검사(in vivo test)로서 2차 전신감작 7일 후, 국소감작 전에 실시하여 전신감작유무를 확인하였다.¹⁰⁾ 먼저 백서의 배부에 알레르기 모델 쥐의 혈청을 1：64로 희석시킨 용액을 0.1 ml씩 피내주사하였다. 이후 48시간 동안 기다려 주입혈청의 IgE가 백서의 비반세포에 결합하게 한 후 1 mg의 ovalbumin과 0.1% evans blue를 1 ml의 생리식염수에 섞어 만든 용액을 혈관 내 주사하여 30분이 지난 후 주사부위의 evans blue가 일혈된 부분의 지름을 측정하여 5 mm 이상이면 양성(전신감작되었다)이라고 판정하고 이후 국소감작을 진행하였다.

표본 채취 및 준비
   각 실험군 및 대조군은 국소감작이 끝난 뒤 1주 뒤에 난알부민 분무를 이용하여 국소 알레르겐을 투여하였으며, 24시간 후 표본채취를 시행하였다. 사용한 시약 중 특별한 언급이 없는 것은 모두 Sigma Chemical Co.(Saint Louise, MO, USA)의 제품을 사용하였다.
   Ketamine(40 mg/kg)과 xylazine(5 mg/kg)의 혼합액을 복강 내 주사하여 마취한 후 흉곽을 절개하고 난알부민 특이 IgE 항체 농도 측정을 위하여 좌심실을 천자하여 혈액 1~2 ml를 채취하고 식염수를 400~500 ml가량 관류시킨 후 Bouin씨 고정액(100 ml 당 Picric acid 75 ml, 40% formalin 25 ml, Glacial acetic acid 5 ml) 500~600 ml을 이용한 심장 내 관주를 실시하였다. 이후 단두기를 이용하여 경부를 절단한 후 Bouin씨 고정액에 보관하였다. 10% EDTA 용액에 2주간 침전시켜 탈회시키고 흐르는 물에 충분히 수세하였다. 파라핀고정을 하기 전에 조직표본을 일정한 부위에서 얻어서 비교의 객관성을 가질 수 있도록 제 1 경구개능(first palatal ridge)에서 관상면(coronal plane)으로 절개하였다. 조직을 알코올 탈수과정, 크실렌 치환 과정 등 일련의 과정을 거쳐 포매하였다.

알레르겐 투여 후 유발된 알레르기 증상의 비교
   표본채취 하루 전 국소자극 후 15분간 쥐의 재채기 숫자를 기록하여 각 실험군의 결과를 서로 비교하였다.

난알부민 특이 IgE 항체 농도 측정
   각 실험군의 쥐에서 채취한 혈액을 원심분리를 통해 적혈구는 버리고 혈청을 획득하였다. 난알부민 특이 IgE 항체 농도는 다음과 같이 ELISA 방법을 사용하여 측정하였다.
   Bicarbonated coating buffer(pH 9.6)에 2 μg/ml의 mouse anti-rat IgE를 섞은 capture antibody를 immunoplate에 100 μl/well씩 넣은 다음 4℃에서 하루동안 유치(incubation)시켰다. 이후 0.05% Tween-20을 함유한 PBS washing buffer로 3회 씻어낸 다음 비특이적인 항원항체 결합을 방지하기 위하여 blocking buffer(0.05% Tween-20 and 1% BSA in PBS)를 200 μl/well씩 투입하여 상온에서 2시간 동안 유치시켰다. 다시 plate를 PBS-Tween 버퍼 용액으로 3번 씻어낸 다음 blocking buffer에 희석된(1：10) 실험 혈청을 100 μl/well씩 넣고 4℃에서 하루동안 유치(incubation)시킨 다음 PBS-Tween washing buffer를 이용하여 6번 씻어내었다. 이후 난알부민을 Biotin-X-NHS kit(Calbiochem, San Diego, CA)를 이용하여 biotinylation 시킨 biotinylated OVA(1.5 μg/ml)를 well당 100 μl씩 넣어주고 실온에서 2시간 유치시킨 다음 PBS-Tween washing buffer를 이용하여 6번 씻어낸 후 1：10,000으로 희석된 avidin-peroxidase를 well당 100 μl씩 넣고 1시간 동안 유치시켰다. 다시 PBS-Tween washing buffer를 이용하여 6번 씻어낸 후 peroxidase substrate을 100 μl/well씩 넣고 암실에 30분간 두고 발색반응이 끝나면 stopping solution을 50 μl/well씩 넣어 반응을 정지시켰다. 알레르기 비염 유발을 하지 않은 Brown-Norway rat의 혈청을 cut-off value로 설정하였으며, Spectrophotometer(THERMOMAX, Molecular devices, Sunnyvale, CA)를 사용하여 450 nm에서 반정량적인 optical density(OD₄₅₀)값을 구하였다.

Hematoxylin-eosin 염색 및 표본 관찰
   통상의 방법으로 hematoxylin 용액에 3~5분간 염색한 뒤 1% 염산 알코올과 암모니아에 순서대로 침적한 후 eosin 용액으로 1~2분간 감별염색을 하였다. 그 후 알코올로 탈수하고 카볼크실렌(carbol-xylene)과 크실렌에 통과시킨 뒤 봉입하였다.
   일정한 부위에서 관찰하기 위해 비중격의 하방에서 호산구 침윤을 관찰하였으며, 광학현미경으로 한 시야당 호산구 침윤정도를 두 군데에서 관찰하여(×400) 그 평균을 구하였다.

통계 처리
   실험군과 대조군 사이의 재채기 횟수와 ovalbumin-specific IgE, 호산구 침윤의 정도를 비교하기 위하여 SPSS version 7.5 프로그램(SPSS Inc., Chicago, IL)을 이용하여 Wilcoxon rank sum test를 사용하였으며, 국소감작기간에 따른 난알부민 특이 IgE 수치와 호산구 침윤의 차이를 알아보기 위하여 Kruskal-Wallis test를 사용하였으며, Bonferroni correction 사후다중비교를 이용하여 군간의 차이를 확인하였다. 유의수준은 모든 경우에서 5%를 기준으로 하였다.

결     과

   전신감작 여부을 확인하기 위해 국소감작을 시행하기 전에 실시한 PCA 검사에서 알레르기 유발군에서는 1주, 4주, 8주 군에서는 모두 양성 반응이 관찰되어 전신감작이 이루어진 것을 알 수 있었다. 반면 대조군에서는 양성 반응이 관찰되지 않았다(Fig. 1).
   난 알부민 항원 분무 후 15분간 측정한 재채기 수인 증상 점수는 1주간 국소감작군에서 6.5±2.9회로 대조군의 1.0±0.95회에 비하여 통계적으로 의미있게 증가하였으며(p=0.024, Fig. 2), 4주간 국소감작군에서는 3.2±2.1회로 대조군의 0.3±0.6회에 비하여 의미있게 증가하였고(p=0.024, Fig. 2), 8주간 국소감작군에서는 7.4±3.2회로 대조군의 0.67±0.6회에 비하여 역시 의미있게 증가하였다(p=0.036, Fig. 2).
   난 알부민 특이 IgE 항체의 경우에도 대조군에 비하여 유의한 차이를 관찰할 수 있었다. 1주간 국소감작을 시행한 실험군의 경우 450 nm에서의 OD(optical density) 수치(OD₄₅₀)가 1.75±0.72, 4주간 국소감작군은 1.73±0.30, 8주간 국소감작군은 0.98±0.79로 대조군의 0.00±0.00에 비하여 1주간 국소감작군과(p=0.002)와 4주간 국소감작군(p=0.002), 8주간 국소감작군(p=0.002) 모두에서 대조군과 유의한 차이가 관찰되었다. 국소감작기간에 따른 실험군 간의 난알부민 특이 IgE의 차이를 확인하기 위한 Kruskal-Wallis test에서는 통계적으로 유의한 차이는 관찰되지 않았으나(p=0.086), 8주군에서 이전군보다 특이 IgE 수치가 감소하는 양상을 보였다(Fig. 3).
   다음으로 국소감작의 기간에 따른 알레르기 쥐의 실험군과 대조군의 호산구 침윤 정도의 변화를 대조군과 비교하였다. 400배 광학현미경 한 시야 당 점막 내에 침윤된 호산구의 수는 1주간 국소감작군에서는 실험군이 11.8±12.1개로 대조군 5±4.2개와 비교하여 증가한 양상이 관찰되었으나 통계적으로 유의한 차이가 관찰되지는 않았다(p=0.334). 4주와 8주 국소감작군에서는 각각 108.8±77.0개와 54.4±8.05개로 대조군의 11.2±8.7개와 16.0±8.2개에 비하여 호산구의 수가 유의하게 증가하였다(4주, p=0.006；8주, p=0.006). 국소감작기간에 따른 호산구 침윤의 차이를 확인하기 위한 Kruskal-Wallis test에서도 유의한 차이가 관찰되었으며(p=0.008), 사후다중비교에서 1주간 국소감작군과 4주간 국소감작군 사이에 유의한 차이가 관찰되었다(p=0.015). 4주간 국소감작군과 8주간 국소감작군 사이의 호산수 침윤은 통계적으로 유의한 차이는 없었으나, 국소감작 4주까지는 호산구의 증가를 보였으며 8주간 국소감작을 시행한 군에서는 오히려 호산구 침윤이 줄어드는 것을 관찰할 수 있었다(Figs. 4 and 5, Table 1).

고     찰

   사회가 근대화되고 생활주변에서 접할 수 있는 화학물질 및 알레르겐이 급속도로 증가함에 따라 알레르기 질환의 빈도도 증가하는 추세에 있어 최근 이에 대한 연구가 많이 이루어지고 있다. 따라서 동물모델에서 이를 실험하기 위한 적절한 모델이 필요한 시점이며 여러 연구자들에 의해 많은 동물 및 감작방법이 연구되고 있다. 따라서 본 실험에서는 알레르기 유발실험에 가장 적합한 것으로 알려져 있는 Brown-Norway rat에서 알레르기 비염모델을 만들고자 시도해보았다. Brown-Norway rat은 알레르기 초기반응의 발현이 적은 백서(Spague-Dawley rat)와 달리 알레르겐에 감작된 쥐에서 노력성호흡이나 천명(wheezing)까지 관찰되어 기관지 과민증에 가장 적합한 모델로 여러 실험에서 사용되어 왔다.³⁾ 또한 Brown-Norway rat은 Wistar rat이나 Wag, Hooded Lister 등 다른 종류의 rat에 비하여 월등한 IgE 반응을 일으킨다.¹¹⁾¹²⁾ 또한 Singh 등¹³⁾의 실험에 의하면 Brown-Norway rat은 백서에 비해 기관지폐포 세척 시 호산구증가가 유의하게 차이가 나며, Th2 사이토카인인 IL-13의 증가가 백서보다 뛰어난 반면, Th1 사이토카인인 IFN-γ의 증가는 백서에 비해 낮은 것으로 보고되었다. 알레르기 비염 모델을 만들기 위한 본 실험에서도 난알부민 특이 IgE의 증가 외에도 호산구의 비점막내 침윤이 확연하게 관찰되어 인체에서의 알레르기반응과 유사한 알레르기비염 모델임을 알 수 있었다. 또한 여러 쥐에서 실험적으로 알레르기를 유발시킨 후 알레르겐 특이 IgE의 상승이 유지되는 기간을 측정한 Holt 등¹²⁾의 실험에서 30일 이상 지속되지 않는 Wag rat이나 Lou/M rat과 달리 60일 이상 알레르기 초기 반응이 지속되는 것으로 알려져 있으며, 본 실험에서도 8주간 국소감작을 시행하였을 때에도 높은 알레르겐 특이 IgE 수치 및 호산구 침윤을 관찰할 수 있어 특히 장기간의 알레르기 상태 유지가 필요한 실험적 치료모델 등을 만드는 데 유리하리라 생각된다.
   본 실험에서는 알레르기를 유발시키기 위하여 이전의 다른 실험을 참고하여 수산화알루미늄겔과 pertussis toxin을 감작보조제로 사용하였으며, 주사장소로 두부의 피하층과 복강 내 주사를 선택하였다.^1)3)14) Pertussis toxin과 수산화알루미늄 겔은 알레르기 모델을 감작시키기 위한 보조제로 사용되고 있으며, 보조제로 흔히 사용되는 물질 중 하나인 complete Freund adjuvant(CFA)에 비하여 선택적으로 IgE 반응을 상승시키는 효과가 뛰어나며, 수 주 이상 알레르겐 자극이 이어지면 발생하는 면역관용(tolerance induction)을 막아줄 수 있다.¹²⁾ 이 중 pertussis toxin은 그 subunit인 S2, S3의 lectin domain이 selectin의 lectin domain과 유사성을 지니고 있어¹⁵⁾ 혈관투과성을 증가시키며, 특히 호중구에 의한 부종은 억제하면서 비반세포에 의한 부종에는 영향을 미치지 않아 알레르기 반응을 증강시키는 것으로 보고되었다.¹⁶⁾¹⁷⁾
   또한 감작 및 보조제 투입의 장소로서 본 실험에서는 두부의 피하층과 복강을 선택하였다. 이는 두부는 천경림프절로 배출되고, 복강은 흉선곁 림프절이나 후종격동 림프절로 배출되는데, 이 림프 조직들이 알레르기 비염모델에서 면역관용이 일어나는 장소가 되는 것으로 알려져 있어¹⁸⁾ 이 부위에 알레르겐 및 감작보조제를 투여하여 알레르기 모델에서 흔히 발생하는 면역관용의 발생을 최대한 억제하려 하였기 때문이다.
   다음으로 이 실험에서 관찰하고자 한 점은 국소감작기간에 따른 초기 및 후기 알레르기 반응의 변화이다. 알레르기 비염모델에서 국소감작의 기간 또한 연구자에 따라 다양하나 본 실험에서는 초기 알레르기 반응의 지표로 생각해 볼 수 있는 알레르겐 특이 IgE의 경우 1주 및 4주, 8주간 국소감작군에서 모두 대조군에 비해 유의한 차이를 관찰할 수 있어 8주까지도 알레르기 초기 반응이 잘 유지되는 것을 알 수 있었다. 반면, 후기 알레르기 반응의 지표로 생각해볼 수 있는 호산구 침윤은 4, 8주간 국소감작군에서 대조군에 비해 호산구 침윤이 유의하게 증가하여, 후기반응까지 포함하는 적절한 알레르기 비염모델을 형성하기 위해서는 최소한 4주 정도의 국소감작이 필요하리라 생각된다. 또한 통계적으로 유의한 차이는 없었지만 8주간 국소감작군이 4주간 국소감작군에 비해 난알부민 특이 IgE 수치와 호산구 침윤이 감소하는 것을 관찰되어, 면역관용이 시작되지 않나 의심이 되었다. 실제로 Elwood 등¹⁹⁾의 실험에 따르면 3주 이상 국소감작을 시행한 경우에서 알레르겐에 대한 기도반응 및 염증세포 침윤이 뛰어났으며, Holt 등¹²⁾도 알레르기 모델에 계속적인 알레르겐 자극을 가할 경우 다른 보조제를 사용하지 않은 쥐에서 약 6주 뒤에는 알레르기 반응이 떨어졌다고 보고한 것과 어느 정도 일치한다고 볼 수 있다. 이러한 면역관용이 일어나는 원인으로서 Waserman 등⁵⁾은 IgG의 상승과 밀접한 역상관관계(inverse correlation)이 있다고 보고하였으며, 이에는 물론 쥐의 종과 같은 유전적인 소인이 가장 중요하지만 pertussis toxin과 같은 보조제를 사용하거나 흡입하는 알레르겐의 농도를 낮춤으로써 면역관용의 발생을 어느 정도 막을 수 있다고 알려져 있다. 그러나, 이러한 경우에도 4주째의 알레르기 반응에 비해서는 그 정도가 약해진다.¹²⁾ 본 실험에서도 알레르겐 자극에 고반응군(high-responder)인 Brown-Norway rat에서 수산화알루미늄 겔과 pertussis toxin을 보조제로서 사용하고, 또한 국소 알레르겐 자극의 농도를 0.1%로 낮춤으로써 4주군에 비해 떨어지기는 하지만 8주간 국소감작군에서도 의미있는 알레르기 상태를 유지할 수 있었으리라 생각된다.

결     론

   본 연구에서는 Brown-Norway rat에 난알부민을 이용한 전신 및 국소감작을 시행함으로써 초기 및 후기 알레르기비염의 병리를 관찰할 수 있는 모델을 제작할 수 있었다. Brown-Norway rat은 일반적으로 알레르기 반응에 있어 흔히 사용되는 백서에 비해 여러가지 면에서 우수하다고 알려져 있어 향후 알레르기비염 동물실험을 시행할 때 인체에서의 알레르기 반응과 가장 유사한 실험모델이 될 수 있으며, 또한 이 국소감작의 기간은 4~8주 정도 시행하는 것이 알레르기비염모델 형성에 가장 효과적이라고 생각된다.

1. Olivenstein R, Renzi PM, Yang JP, Rossi P, Laberge S, Waserman S, et al. Depletion of OX-8 lymphocytes from the blood and airways using monoclonal antibodies enhances the late airway response in rats. J Clin Invest 1993;92:1477-82.

2. Bellofiore S, Martin JG. Antigen challenge of sensitized rats increases airway responsiveness to methacholine. J Appl Physiol 1988;65:1642-6.

3. Careau E, Sirois J, Bissonnette EY. Characterization of lung hyper-responsiveness, inflammation, and alveolar macrophage mediator production in allergy resistant and susceptible rats. Am J Respir Cell Mol Biol 2002;26:579-86.

4. Renzi PM, Olivenstein R, Martin JG. Inflammatory cell populations in the airways and parenchyma after antigen challenge in the rat. Am Rev Respir Dis 1993;147:967-74.

5. Waserman S, Olivenstein R, Renzi P, Xu LJ, Martin JG. The relationship between late asthmatic responses and antigen-specific immunoglobulin. J Allergy Clin Immunol 1992;90:661-9.

6. Sirois J, Bissonnette EY. Alveolar macrophages of allergic resistant and susceptible strains of rats show distinct cytokine profiles. Clin Exp Immunol 2001;126:9-15.

7. Mills CD, Kincaid K, Alt JM, Heilman MJ, Hill AM. M-1/M-2 macrophages and the Th1/Th2 paradigm. J Immunol 2000;164:6166-73.

8. Steerenberg PA, Dormans JA, van Doorn CC, Middendorp S, Vos JG, van Loveren H. A pollen model in the rat for testing adjuvant activity of air pollution components. Inhal Toxicol 1999;11:1109-22.

9. Szelenyi I, Marx D, Jahn W. Animal models of allergic rhinitis. Arzneimittelforschung 2000;50:1037-42.

10. Durland WF Jr, Lane AP, Durland KW, Smith TL, Johnson KL, Prazma J, et al. Nitric oxide is a mediator of the late-phase response in an animal model of nasal allergy. Otolaryngol Head Neck Surg 2000;122:706-11.

11. Knippels LM, Penninks AH, van Meeteren M, Houben GF. Humoral and cellular immune responses in different rat strains on oral exposure to ovalbumin. Food Chem Toxicol 1999;37:881-8.

12. Holt PG, Britten D, Sedgwick JD. Suppression of IgE responses by antigen inhalation: Studies on the role of genetic and environmental factors. Immunology 1987;60:97-102.

13. Singh P, Daniels M, Winsett DW, Richards J, Doerfler D, Hatch G, et al. Phenotypic comparison of allergic airway responses to house dust mite in three rat strains. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2003;284:L588-98.

14. Watanabe A, Mishima H, Renzi PM, Xu LJ, Hamid Q, Martin JG. Transfer of allergic airway responses with antigen-primed CD4+ but not CD8+ T cells in brown Norway rats. J Clin Invest 1995;96:1303-10.

15. Saukkonen K, Burnette WN, Mar VL, Masure HR, Tuomanen EI. Pertussis toxin has eukaryotic-like carbohydrate recognition domains. Proc Natl Acad Sci U S A 1992;89:118-22.

16. Brito GA, Souza MH, Melo-Filho AA, Hewlett EL, Lima AA, Flores CA, et al. Role of pertussis toxin A subunit in neutrophil migration and vascular permeability. Infect Immun 1997;65:1114-8.

17. Thomazzi SM, Souza MH, Melo-Filho AA, Hewlett EL, Lima AA, Ribeiro RA. Pertussis toxin from Bordetella pertussis blocks neutrophil migration and neutrophil-dependent edema in response to inflammation. Braz J Med Biol Res 1995;28:120-4.

18. Sedgwick JD, Holt PG. Induction of IgE-secreting cells and IgE isotype-specific suppressor T cells in the respiratory lymph nodes of rats in response to antigen inhalation. Cell Immunol 1985;94:182-94.

19. Elwood W, Lotvall JO, Barnes PJ, Chung KF. Characterization of allergen-induced bronchial hyperresponsiveness and airway inflammation in actively sensitized brown-Norway rats. J Allergy Clin Immunol 1991;88:951-60.