교신저자：박동준, 220-701 강원도 원주시 일산동 162번지  연세대학교 원주의과대학 이비인후-두경부외과학교실
교신저자：전화：(033) 741-0642 · 전송：(033) 732-8287 · E-mail：rhico@wonju.yonsei.ac.kr

서     론

   골수유래 중배엽성 줄기세포(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, MSCs)는 연골, 뼈, 근육, 건, 그리고 지방세포로 분화가 가능한 줄기세포이며 다양한 동물 모델에서 분리 배양되었다.¹⁾ 골수줄기세포는 초기에는 중배엽성 조직으로의 분화만 가능하다고(multipotent stem cells) 생각되었으나, 최근에는 모든 배엽의 조직으로 분화가 가능한(pluripotent stem cells) 것으로 알려져 태아줄기세포에 비해 윤리적 측면에서 전혀 위축됨이 없이 사용될 수 있다. 또한 줄기세포라는 특성에 의해 비교적 많은 계대배양이 가능하고 노령에서 채취한 세포도 그 증식력이 떨어지지 않는다는 연구결과가 있어 성체세포 사용보다 많은 장점이 있다.¹⁾
   이비인후과 영역의 수술에서 종양이나 외상, 또는 미용목적으로 임플란트(implants)가 사용되고 있으나 거부반응이나 조직적합성의 문제로 현재까지 이상적인 재료는 없는 실정이다. 자가 조직의 이식은 이론적으로 가장 이상적인 방법이지만 시술의 복잡성과 공여부의 제한이 문제점으로 대두되어 왔고, 이를 극복하기 위해 작은 자가 조직을 채취 후 삼차원 배양 등의 인위적인 방법으로 크게 만들어 이를 다시 이식재료로 사용하려는 조직공학이라는 학문이 빠르게 발전되고 있다.
   조직공학의 개념은 조직에서(예를 들어 뼈나, 연골 등) 세포만 분리한 뒤 이를 생체 내에서 서서히 분해되는 다공성 주형(porous scaffold)이나 젤에 넣어 장기간 시험관적 배양, 혹은 생체 내로의 이식을 통해 세포들이 조직으로 변화되고 생체 재료는 흡수되면서 새로운 형태의 뼈나 연골을 만드는 기술이다.²⁾³⁾ 최근까지 이러한 방법으로 뼈와 연골 이외에도 건(tendon), 간, 췌장 등 많은 종류의 세포들이 연구되고 있다.⁴⁾⁵⁾ 그러나 이러한 조직들도 이미 성숙된 세포인 관계로 제한된 계대 배양(subculture)만이 가능하여 충분한 양의 세포 수를 얻기에는 무리가 따른다.
   앞서 언급한대로 새로운 조직을 만들기 위해 세포를 가두어두는 주형이나 젤이 필요한데 이 세포 전달물(vehicle)의 발전이 조직공학에 필수 요건이다. 이는 생적합(biocompatible)해야 하고, 생분해성(biodegradable)이어야 하며 영양소와 노폐물의 확산이 용이해야 한다. 이러한 조건을 갖고 있는 물질 중에 PLGA 라는 합성물질이 많이 사용되고 있다.⁶⁾
   따라서 본 연구의 목적은 자가 간엽줄기세포를 추출 및 배양하고 필요한 조직을 대체할 수 있는 정도의 세포를 배양하여 이를 골화 세포로 분화 시킨 후 다공성 PLGA 고분자 화합물에 적재하여 이를 시험관내에서와 성견의 상악동내 골막하에서 신생골을 생성시켜 봄으로써 이를 인체내에 임상적 적용이 가능한 골 형성 임플란트 제품을 만드는데 기초 자료로 이용하는 데에 있다.

재료 및 방법

골수유래 중배엽성 줄기세포(MSCs)의 분리 및 배양
   2주 이상 동일조건의 사육실에서 사육된 몸무게 15 kg의 성견에 Xylazine hydrochloride(2 mg/kg), Ketamine (10 mg/kg)혼합액을 근주하여 전신마취한 후 이들의 장골에서 10 ml의 골수를 채취하였다. MSCs의 분리 및 배양은 Kadiyala의 방법을 사용하였다.⁷⁾ 기초 배지로 high-glucose DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 에 15% FBS, 25 unit/ml penicillin, 25 ug/ml streptomycin, 200 mL L-glutamine(이상 BioWhittaker, MD, USA) 등을 첨가하였고 골분화 유도배지로는 기초배지에 0.1 uM dexamethasone(1 mM stock in 100% ethanol), 0.05 mM ascorbic acid-2-phosphate 그리고 10 mM β-glycerophosphate(Sigma, MO, USA) 등 세 가지를 첨가하여 사용하였다.
   세포들은 75 cm² 세포배양용 플라스크에 넣어 5% CO₂ 조건에서 2~3일 간격으로 배양액을 교환 공급하였다. 세포들이 합류를 이루면 트립신으로 계대배양을 하였고 2~3차에 걸친 계대배양후의 세포들을 사용하였다.

역전사 연쇄중합반응(RT-PCR)을 통한 Octeocalcin mRNA의 확인
   Osteocalcin은 osteoblast의 활성도와 비례하여 생성되는 싸이토카인 이므로 골분화를 유도한 MSCs의 Osteocalcin mRNA를 반 정량적으로 비교하였다.
   100 mm tissue culture dish에서 1주째와 3주째 골분화 배지로 배양된 MSCs를 각각 채취하고 대조군으로는 3주간 기초배지만으로 배양한 세포를 사용하였고 guanidium thiocynate-phenol-chloform 추출방법으로 전체 RNA를 분리 하였다. 이어 cDNA를 합성하고 역전사를 시행하였으며, osteocalcin에 대한 시발체(primer)는 이미 발표된 osteocalcin cDNA 염기서열을 토대로 sense primer；5'-ATGAGAGCCCTCACACTCCTC-3'와 antisense primer；5'-GCCGTAGAAGCGCCGATAGGC-3'을 사용하여 294 bp의 기대크기로 제작 하였다. houskeeping gene은 702 bp의 GAPDH를 사용하였고 기간별로 생성된 osteocalcin mRNA band의 양을 반 정량적으로 비교하였다.

PLGA 다공성 폴리머에서 골수유래 중배엽성 줄기세포의 골분화(osteogenic differentiation) 유도 및 조직학적 검사
   생적합하고 생체내에서 흡수되는 직경 1 cm 두께 4 mm의 다공성 PLGA foam(pore size 200~500 μm, 이노메디칼)을 반으로 자른 후 준비된 골수유래 줄기세포 10×106개를 300 μm의 기초배지(basal medium)에 담아 마이크로 피펫으로 50 μl씩 소량으로 나누어 다공체위에 뿌려준다. 세포가 이 scaffold에 잘 붙게 하기 위해 2시간 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에 배양 후 이를 6-well 배양기로 옮기고 골분화 유도 배지 3 ml으로 갈아준다. 이틀 간격으로 3주간 배양액을 교체해 주었으며 대조군으로는 기초배지만 배양액을 사용하였고 0, 1, 3주 간격으로 H&E 및 Von Kossa 염색을 시행하여 세포의 부착 상태와 골화를 확인하였다.

세포-PLGA 복합체의 잡견 상악동 골막하 이식 및 골화(ossification)의 확인
   이식 부위는 상악동내의 골점막하(submucoperiosteal) 부위로 정하였는데, 이유는 견치와(canine fossa)로의 접근이 용이하고, 일정한 공간을 유지할 수 있으며, 이비인후과에서 자주 치료하는 질환인 상악동-구강 누공(oroantral fistula)의 치료나, 치과영역에서 sinus floor augmentation시 적용할 수 있는 부위이기 때문이었다.
   6마리의 성견을 사용하였다. Xylazine hydrochloride(2 mg/kg), Ketamine(10 mg/kg)혼합액을 근주하여 전신마취한 성견의 견치와 부위를 소독 후, 상악동 전벽을 제거 하였으며, 이때 상악동 점막에 손상이 되지 않도록 주의한다. 거상기(elevator)로 상악동 점막을 제 1 대구치까지 거상 후 대구치 바로 위쪽, 점막하 공간에 2주간 PLGA 다공성 폴리머에서 골분화를 유도한 세포-폴리머 복합체를 이식한다. 항상 좌측의 상악에는 실험군(골분화를 유도한 세포와 PLGA 혼합체, n=6)을, 우측에는 세포를 넣지 않은 PLGA 임플란트(n=3)나, 골분화를 유도하지 않은 세포가 포함된 PLGA 임플란트(n=3)를 대조군으로 삽입 하였으며, 4, 8주 후에 동물을 희생시키고, 조직을 채취하였다. 채취한 조직은 육안적 검사와 H&E 염색을 시행하여 골의 유도를 확인하였다.

결     과

   모든 성견에서 MSCs의 채취가 가능하였고, 배양 후 2~3주 내에 75 cm2 배양 flask에서 합류를 이루어 계대배양이 가능하였다. 인간의 MSCs와 비교 하였을 때 보다 더 균일한 모양을 하고 있었고, 크기는 작으나, 조금 더 긴 섬유아세포 모양을 하고 있었다.
   1, 3주간 배양된 MSCs에서 생성된 osteocalcin mRNA는 house keeping gene인 GAPDH band의 크기가 동일한 조건하에서 시간이 경과할수록 band의 크기가 증가하며, 3주째 명확한 차이를 보여 최소 2주 이상의 골분화를 유도해야 실제적으로 사용할 수 있음을 시사하였다(Fig. 1).
   다공성 PLGA implant에 이식된 MSC는 위에서 세포를 뿌려 주는 정적인 방법(static method)로도 각 pore 내로 골고루 분산되어 전체적으로 균일한 세포의 분포를 보임이 H&E 염색으로 확인되었으며, 3주째 높은 밀도로 분포되어 있는 것으로 보아 implant 내에서 세포의 증식이 일어남을 시사 하였다. 또한 골세포의 미네랄화(mineralization)는 Von Kossa 염색의 정도로 확인하였는데, 3주째에 가장 진하게 염색되는 것으로 보아 골분화 배지에서는 in vitro 상태에서도 시간이 경과할수록 미네랄화가 진행됨을 보여주었으나 기초배지만 사용한 경우는 매우 미미한 정도의 염색만 보였고 기간에 따른 차이도 보이지 않았다(Fig. 2).
   개 상악동내에서 대조군 즉, PLGA만 이식한 경우 1달째에 이미 흔적도 없이 흡수되어 버렸고 골분화 유도배지를 사용하지 않은 세포를 사용한 implant는 1달째엔 약간의 변형된 흔적은 남아있으나 2달째에는 모두 흡수되었다(Fig. 3). 실험군에서의 골화는 1달째에서도 보이기 시작하며, 2달째엔 손으로 만져보아 단단한 정도의 골화가 유도됨을 알 수 있었다. 이러한 골화는 6마리의 모든 개에서 관찰되었으나 생성된 골의 모양은 implnat 삽입시와는 달리 약간의 변형이 있었다. H&E 염색상 implant 내부엔 골화세포 주위로 신생골들이 군데군데 생성되는 모습이었으며, 대식세포 등 염증세포의 빈도는 매우 적었다. 신생골의 빈도나 면적은 1달째보다 2달째에 더욱 증가 하였다(Fig. 4).

고     찰

   조직공학적으로 인공골은 만드는 방법에는 1) 사용한 세포의 기원, 2) 세포 운반체, 3) 골의 발생 장소 등에 따라 여러 가지로 나눌 수 있다.
   사용한 세포의 종류에 따라 나누어보면, 골이나 골막 등에서 얻은 골화세포를 직접 채취해 골로 성장시키는 경우⁸⁾와 줄기세포를 채취해 이를 골화세포로 분화시킨 후 다시 골로 성장시키는 방법이며, 이때 줄기세포는 그 기원에 따라 지방세포,⁹⁾ 태아줄기세포,¹⁰⁾ 골수유래줄기세포로¹¹⁾ 분류할 수 있다. 직접 채취한 골화세포의 경우 이미 분화가 진행된 상태이므로, 특별한 처치나 조건 없이도 골화가 잘 일어나며 줄기세포의 경우 여러 종류의 성장인자가 필요한데 그 중 중요한 것이 beta-glycerophosphate, dexamethasone, ascorbic acid이다.¹²⁾ 이 인자들이 골화를 발생시키는데 어느 기간까지 필요한지에 대해선 이견이 있으나, 대략 2주 이상으로 알려져 있고 본 연구에서도 1~3주 사이에 osteocalcin의 증가로 보아 기존연구자¹²⁾들의 결과와 대략 일치하였다. 또한 3주간 분화시킨 세포를 생체내에 이식시(성장인자의 공급이 없어져도) 퇴행되거나 골화의 진행이 정지하지 않고 골화가 유지되는 것을 확인하였다. 최근에 연구되고 있는 방법들 중에 골분화를 유도하지 않은 naive 상태의 줄기세포와 성장인자를 천천히 방출하는(sustained release) 세포주형(틀, scaffold)을 함께 생체내에 이식해 조직을 유도하려는 시도가 있는데, 골의 경우 본 연구 결과로 보면 최소 2주만 방출시키는 DDS(drug delivery system)만 있으면 충분히 골조직의 생성이 가능함을 알게 되었다.
   앞서 언급한대로 세포의 운반체에는 생적합(biocompatible) 하고 생분해되는(bioabsorbable) polymer 등이 사용되는데, 그 재료에는 alginate, chitosan, polylactic acid, hydroxyapatite, 그리고 PLGA 등 여러 가지가 있고 그 형태도 연구목적에 따라 고형의 scaffold나, injectable한 경우 등으로 만들어 사용하기도 한다. 그 중 이번에 사용된 PLGA 만이 유일하게 미 FDA에 인체에 이식할 수 있는 물질로 공인을 받았기에 본 연구도 이를 사용하였다.
   골을 생성시키는 장소 또한 연구목적에 따라 중요하다. 그간 이루어졌던 연구를 보면, 주로 뼈의 결손 부위에 주위 뼈세포의 유입을 유도하거나 재생을 촉진(osteoconductive)시키는 목적으로 줄기세포를 사용한 경우와 전혀 뼈의 존재가 없는 피하조직이나 장간막 등에서 오직 줄기세포만으로 뼈를 생성시키는(ectopic bone formation) 연구 등¹³⁾¹⁴⁾이 있었다. 후자의 경우, 이식한 줄기세포만으로 뼈를 만들어야 하므로, 더욱 확실한 골화가 많은 세포에서 이루어져야함은 물론이다. 본 연구는 계획한 대로 개를 이용한 전임상 실험에서 자가 골수줄기 세포와 PLGA폴리머를 이용하여 생체내 ectopic bone formation에 성공하였다. 이는 그간 실험실내에서 현미경하에서나 관찰이 가능한 골 형성에 성공하였던 국내외 연구와는 달리 손으로 만져보아도 뼈와 같은 경도의 조직 생성으로서 본 연구자의 국내외 논문탐색 결과 최초인 것으로 생각된다.
   본 연구의 경우, 뼈의 결손은 없었으나, 점막하 골막사이의 공간이므로, 완전한 신생골의 형성인지, 상악골에서 유입된 뼈세포인지 구분이 가능한 실험은 아니었으나, 골화를 유도시키지 않은 MSCs를 사용했을 때엔 모두 완전히 흡수되는 것으로 보아, 골분화로 유도되어 이식된 줄기세포가 신생골로 변화되었음을 간접적으로 시사한다.
   그간 임상적으로 이용되던 대부분의 골 생성에 사용된 인공뼈 생성 재료는 수술이나 외상후 의 골결손 부위 주위에서 자가골의 발생을 전도 시키는 재료이나, 본 연구의 경우 신체의 다른 부위에서 채취한 자가 골수줄기 세포에서 직접적으로 골을 생성시킨(osteo-induction) 경우이므로 그 의의가 다르다. 즉 신체 재생력이 약해진 노인 환자나, 당뇨 등 면역력이 저하된 경우 또는 방사선 치료 등으로 기존의 인공뼈 생성재료를 사용해서 그 결과가 좋지 않은 경우에도 시험관에서 골수줄기세포를 여러 성장인자로 활성화 시킨 후 골의 재생에 사용할 수 있을 것으로 기대되기 때문이다.
   본 연구의 목적은 자가줄기세포를 이용한 골대체용 임플란트를 개발하기 위함이다. 따라서 이상의 결과로 상악동내에 골 결손을 초래할 수 있는 외상이나 재건수술시 응용의 가능성을 보여주고 있으며, 특히 상악동의 기저부 골벽이 약해 치과용 임플란트 삽입이 용이하지 않을 경우 뼈의 보강재로 치과영역의 사용이 가능할 수도 있음은 물론 안면윤곽이나, 기타 성형 임플란트로의 가능성을 제시한다고 할 수 있다.

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