교신저자：이흥만, 152-703 서울 구로구 구로동 80번지  고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
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서     론

   구강과 타액선은 구강내의 여러가지 생물학적, 화학 및 기계적인 자극에 노출되어있지만, 타액에 의한 단순한 세척에서부터 복잡한 숙주 방어기전에 이르는 광범위한 보호작용에 의하여 외부의 여러 자극으로부터 보호를 받고있다. 표면활성제(surfactant)는 지질 성분과 단백 성분으로 구성되며, 단백 성분 중 표면활성제 단백-A(이하 SP-A로 약함)는 collectin이라고 불리는 교원성 숙주방어 lectin군에 속해있다. SP-A는 기도 상피세포에서 생산되어 기도를 덮고 있는 분비물에 존재하며, 여러 가지 미생물이 흡입되면 미생물의 표면구조물과 결합하고, 자연면역반응(innate immune response)을 조절함으로써 병원성 미생물에 대한 일차 방어선을 형성한다.¹⁾ 기도에서의 숙주반응에 대한 SP-A의 기능은 SP-A 유전자적중생쥐(knock-out mice)를 이용한 연구를 통해 밝혀졌으며, SP-A 유전자적중생쥐는 일반 생쥐보다 세균이나 바이러스에 의한 감염에 대한 감수성이 증가되어 있다.²⁾ 또한 SP-A는 자연면역반응뿐만 아니라 적응성 면역반응(adaptive immune response)에도 관여한다.³⁾
   지금까지 여러 장기에서 SP-A발현이 보고되어 있지만, 만성 타액선염에서의 발현에 대한 보고는 없었다. 따라서 저자들은 타액선의 염증반응이 있는 경우에서 SP-A 발현이 정상적인 타액선과는 차이가 있을 것이라는 가정하에 정상과 만성 타액선염 조직에서 SP-A mRNA의 발현을 역전사-중합효소반응 방법으로 비교 관찰하고, SP-A 단백 발현을 면역조직화학적 염색으로 관찰하고자 하였다.

재료 및 방법

검체의 채취
   반복적으로 이하선의 동통을 호소하여 만성이하선염을 진단 받고 보존적 치료에 실패하여 이하선 적출술을 시행 받은 환자 10명(남자 5명, 여자 5명, 평균 연령 32.4세)의 이하선 조직과 이하선 종양으로 수술 받은 환자 10명(남자 5명, 여자 5명, 평균 연령 37.3세)의 종양이 없는 이하선 조직을 채취하였으며, 일부 조직은 역전사-중합효소연쇄반응을 위해 즉시 -70℃의 냉동고에 보관하였고 나머지 타액선 조직은 면역조직화학적 염색을 위하여 4% paraformaldehyde 용액(pH 7.4)으로 고정한 뒤 파라핀에 포매하였다. 양성 대조군으로는 폐조직을 같은 방법으로 준비하였다.

리보핵산(RNA) 추출
   채취된 조직 표본은 1 ml의 TRIzol reagent(Gibco BRL, Tuscon, AZ) 내에서 균질화시켜 리보핵산을 추출하였고 공기중에서 건조시킨 뒤 diethylpyrocarbonate가 처리된 용액에 담가둔 후 얼음에 보관하여 -70℃의 냉동고에 보관하였다. RNA의 일부분은 RNAse-free RQI DNAse(Promega, Madson, WI)로 처리하였다. RNA의 농도는 분광광도계를 사용하여 측정하였고, RNA의 통합성은 포름알데하이드를 포함하고 있는 아가로즈 젤에서 전기영동을 시행하여 검사하였다.

역전사-중합효소연쇄반응
   각 검체의 총 RNA는 20 ul의 2.5 U의 Moloney murine leukemia virus(M-MLV) 역전사 효소(Gibco BRL, Tuscon, AZ)와 50 pM random hexanucleotide의 혼합물 20 ul를 사용하여 42℃에서 60분 동안 반응시켜 cDNA로 역전사하였다. SP-A의 RNA를 증폭시키기 위해 사용된 SP-A의 순방향 시발체는 5'-GGA AGC CCT GGT ATC CCC GG-3'이며, 역방향 시발체는 5'-TAA TGG TAT CAA AGT TGA CTG-3'이다. 중합효소연쇄반응은 94℃에서 45초, 55℃에서 30초 72℃에서 1분간 시행하는 것을 주기로 약 35회 증폭한 후 마지막으로 72℃에서 약 7분간 연장반응을 시행하였다. SP-A의 중합효소연쇄반응 산물의 길이는 376 bp이었다. 반응의 특이도를 판정하기 위하여 RNA를 제외시키거나, 또는 RNA는 포함되었지만 역전사-중합효소를 제외한 것을 음성 대조군으로 사용하였으며, 양성대조군은 인간의 폐조직을 사용하였다. RNA의 정량적 분석을 위해 아가로즈 겔에서의 각각의 중합효소반응물의 띠의 강도를 NIH Image software(National Institutes of Health, Bethesda, MD)로 측정하여 GAPDH(순방향 시발체 5'-GTG GAT ATT GTT GCC ATC AAT GAC C-3', 역방향 시발체 5'-GCC CCA GCC TTC ATG GTG GT-3')와 비교하여 분석하였다.

면역조직화학적 염색
   포매한 조직은 5 μm 두께의 절편으로 만들어 자일렌으로 파라핀을 제거한 후 100%와 75% 알코올로 순차적으로 재수화(rehydration)하였다. 내인성 과산화효소 활성을 억제시키기 위하여 3% methalol/H2O2로 처리하였으며 1：100으로 희석시킨 다크론성 SP-A(Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA)항체로 4℃에서 24시간 동안 처리하고, Vectastatin Elite ABC kit(Vector Lab, Inc, Burlingame, CA)에 1시간 동안 반응시킨 후 3, 3'-diaminobenzidine(Sigma, St. Louis, MO)을 이용하여 발색시켰다. 음성 대조군은 일차항체 대신에 인산완충용액 혹은 비면역혈청을 사용하였다.

통계학적 분석
   자료는 SPSS(SPSS Inc., Chicago)를 이용하여 mean±SEM으로 나타내고 두 집단간의 정량적인 비교는 Mann-Whitney U 검사로 시행하였으며, p<0.05를 통계적으로 유의성이 있는 것으로 하였다.

결     과

역전사-중합효소연쇄반응
   역전사-중합효소연쇄반응 검사에서는 타액선에서 SP-A mRNA가 전사되는 것이 관찰되었다. 만성 타액선염 조직에서 추출된 역전사-중합효소연쇄반응 산물들은 예상된 372 bp의 크기를 가지고 있었으며, 같은 크기의 산물이 양성 대조군에서 발현되었다(Fig. 1). 또한 SP-A mRNA의 발현량은 정상조직보다 만성타액선염의 조직에서 유의하게 증가하였다(p<0.05, Fig. 2).

면역조직화학적 염색
   타액선 조직에서 SP-A 단백의 분포를 확인하기 위하여 면역조직화학적 염색을 시행하였다. 면역 양성 세포는 갈색으로 염색되었다. 각 조직의 SP-A에 대한 면역 양성 정도는 실험군과 대조군에 대한 정보가 없는 두 명의 독립적인 연구자들에 의해 염색 되지 않음(-), 약한 염색(+), 명확한 염색(++), 강한 염색(+++)으로 점수화 되어(++) 이상을 면역염색 양성으로 판정하였다. SP-A 단백은 만성 타액선염과 정상 타액선의 관세포에서 발현되었지만, 소포세포에서는 발현되지 않았다. 또한 만성 타액선염의 관세포가 정상 타액선에서보다 더 강하게 면역염색에 양성 소견을 보였다(Fig. 3). SP-A 항체의 특이도를 확인하기 위해 시행한 음성 대조군에서는 SP-A 단백이 발현되지 않았다.

고     찰

   본 연구에서는 정상 타액선조직과 만성타액선염 조직에서 SP-A mRNA와 단백의 발현을 관찰하여 역전사-중합효소연쇄반응에서 만성타액선염 조직의 SP-A mRNA 발현량이 정상 조직에서보다 증가되어 타액선의 염증반응에서 SP-A 발현이 증가됨을 관찰하였으며, 면역조직화학적 검사에서는 SP-A 단백이 타액선의 관세포에서 발현되었다.
   병원체에 대한 숙주 반응의 구성요소로 알려진 SP-A는 미생물의 세포 표면과 상호작용하여 대식세포, 단핵구, 호중구의 세균과 바이러스에 대한 포식작용 및 호중구의 이동을 증가시킴으로써 면역세포의 기능을 조절한다.¹⁾ SP-A는 수지상세포(dendritic cell)의 분화와 화학주성을 조절함으로써 자연 면역과 적응성 면역을 연결하고,⁴⁾ 바이러스에 부착하여 중화시킨다.⁵⁾ SP-A는 인간면역결핍바이러스 감염환자에서 Mycobacterium tuberculosis가 폐포 대식세포에 쉽게 부착시키며, 일부는 진균과 결합한다.⁶⁾⁷⁾
   병원체에 대한 숙주반응을 조절하는 국소 생산 인자는 초기 숙주반응에서 중대한 역할을 한다. SP-A는 처음에는 폐 계면활성제의 구성요소로 알려졌지만 폐조직 이외의 위장관과 젖샘을 덮고 있는 상피세포,⁸⁾ 상악동, 이관,⁹⁾ 전립선, 흉선과¹⁰⁾ 윤활막¹¹⁾ 등에서 발현되며, Luo 등¹²⁾은 타액선관에서 SP-A의 면역반응을 보고하였다. 본 연구에서는 SP-A 단백이 타액선의 관상피세포에서 관찰되었으며 이러한 결과는 타액선에서 SP-A mRNA의 발현은 확인하였으나, SP-A 단백의 면역반응은 검출하지 못한 Madsen 등¹³⁾의 관찰과는 대조적이나, 이러한 결과의 차이는 두 연구에서의 면역조직화학염색의 민감도의 차이에서 기인한 것으로 생각된다.
   폐조직에서 collectin은 병원체에 대한 숙주 방어기전으로 중요한 역할을 하며,¹⁾ 폐조직과 유사하게 외부 환경과 점막이 직접 접하는 이관,¹⁴⁾ 부비동,¹⁵⁾ 및 질(vagina)¹⁶⁾ 등의 기관에서도 SP-A는 비슷한 역할을 하고, 다양한 미생물과 직접 접하는 점막 표면에 분포하는 SP-A는 점막의 자연 면역방어의 일부분을 담당할 것이라고 생각된다. 본 연구에서는 만성 타액선염환자 타액선 점막에서 SP-A mRNA가 상향조절되었으며 숙주와 세균 사이의 접촉면에서 SP-A가 발현되는 것은 외부의 세균에 대항하기 위한 최적의 장소로, 구강의 감염이 타액선으로 전파되는 것을 막는데 도움이 될 수 있다.
   Sugahara 등¹⁷⁾은 백서를 대상으로 한 실험에서 지질단백질을 기관내로 주입하면 SP-A mRNA가 발현되고 SP-A 단백의 발현이 유의하게 증가되는 것을 관찰하였고, Cheng 등¹⁸⁾은 SP-A와 SP-D의 발현이 경증의 안정된 천식 환자의 기도상피에서 증가한다고 보고하였다. 이러한 결과는 염증이 있는 만성 타액선염이 있는 타액선의 상피세포에서 SP-A의 발현이 증가된 본 연구의 결과와 일치한다. 그러나 SP-A 발현량의 감소가 중증의 세균과 바이러스에 의한 폐렴에서 관찰되었고¹⁹⁾ SP-A의 기능적인 감소가 성인의 호흡곤란증후군에서 보고되는²⁰⁾ 등 감염질환에서 SP-A의 발현이 감소하는 경우가 보고되었다. 이러한 결과는 SP-A발현이 감소된 개체는 감염에 쉽게 이환된다는 것을 암시한다. 따라서 추후에 SP-A발현량의 변화가 조직내 염증이 원인인지 아니면 결과인지의 여부에 대하여는 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
SP-A는 숙주의 면역 반응에 관여한다고 알려져 있고, 본 연구에서 만성 타액선염이 있을 때 SP-A가 증가된 것은 타액선에서도 SP-A가 숙주 방어기전에 기여할 수 있다는 것을 시사한다. 따라서 만성 타액선염에서의 SP-A에 대한 연구는 이 질환에 대한 새로운 치료법의 개발에 도움을 줄 수 있으리라 생각되며 SP-A 발현량의 변화와 타액선 질환과의 관계에 대한 접근은 앞으로 추가적인 연구가 필요하다.

결     론

   SP-A는 인간 타액선에서 발현되며, 만성 타액선염 환자의 타액선에서는 SP-A mRNA발현량이 유의하게 증가하였다. 따라서 폐에서와 마찬가지로 타액선에서도 SP-A가 외부 세균의 침입에 대하여 방어 작용을 하는 것으로 생각된다.

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