교신저자：강성호, 380-704 충북 충주시 교현2동 620-5  건국대학교 의과대학 이비인후과학교실
교신저자：전화：(043) 840-8280 · 전송：(043) 843-6165 · E-mail：kkdin@kku.ac.kr

서     론

   중이와 이관의 점막상피는 섬모세포와 혼합성 분비세포로 이루어져 있으며 이들에 의해 만들어지는 점액층과 섬모주위액은 항상 일정하게 유지된다. 섬모주위액의 정확한 성분은 잘 알려져 있지 않지만 장액성 분비성분과 세포 자체에서 나오는 단백질이라고 생각되어진다. 이 용액들이 일정한 점도를 유지하기 위해서는 수분의 양이 정확하게 조절되어야 하므로 이것이 어떻게 이루어지는지 알기 위해서는 수분 배출과 관련된 점막의 상피조직세포의 단백질 발현 유무 및 종류를 탐색해 보아야 할 필요가 있다.
   최근에 호흡상피에서도 수분 통로 단백(water channel protein-aquaporin；AQP)들이 발견되었는데 이것은 동식물과 세균에서 세포막을 통한 수분의 이동을 촉진시키는 특별한 통로를 구성하는 세포막의 단백질 중의 하나이다. 현재까지 포유류에서는 AQP0에서 11까지 12종류의 AQP 아형이 발견되었다.¹⁾²⁾ 각각의 AQP는 조직 특이적으로 분포할 뿐만 아니라 세포 내에서도 상피세포의 첨부 및 기저측부 등 그 분포위치가 다르며, 삼투압 농도를 이용한 수분 이동을 담당한다.³⁾ 아직은 호흡기 점막상피에서 각각 다른 AQP의 아형들이 어떤 역할을 하는지 확실히 밝혀지지는 않았지만 상피세포와 분비조직에서 관찰되어지는 AQP의 다양성은 이관과 중이의 정상 생리뿐 아니라 병태생리와도 밀접한 관계가 있는 것으로 생각되어진다.
   본 연구에서는 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction, RT-PCR)과 Western blot 그리고 면역조직화학염색을 통해 백서의 이관 내에서 AQP이 어떤 세포에서 발현되는지 그리고 세포 내에서는 어떤 위치에 분포하는지 알아보고자 하였다. 만일 이관 내에서 여러 가지 아형의 AQP가 발견된다면 과거 AQP에 대한 연구를 통해 밝혀진 결과를 토대로 수분과 이온, 그리고 화학물질에 대한 다양한 이동 능력을 추정할 수 있을 것이다. 나아가 특정한 AQP의 변형과 이관 개방증, 이관염, 삼출성 중이염 그리고 중이 내의 진주종 같은 병적 상태와의 관련성을 밝힐 수 있는 기초 연구가 될 수 있다고 생각된다.

대상 및 방법

역전사 중합효소 연쇄반응
   체중이 200 내지 300 g 정도 되는 Wister-Kyoto 계의 백서 5마리를 ketamine과 xylazine을 복강 내로 주사하여 마취시킨 후, 신장과 악하선, 그리고 폐의 말단부를 적출하고 수술 현미경 하에서 이관과 중이 조직을 채취하였다. 세포 내의 RNA는 TRIzol(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용한 acid guanidine thiocyanate-phenol-chloroform 추출 방법을 통하여 분리하고 SuperScript II-kit(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 역전사하여 complementary DNA(cDNA)를 얻었다.
   PCR은 MJ PTC-200 Peltier cycler 내에서 cDNA를 각각 95℃에서 15분간 변성시킨 후, 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 그리고 72℃에서 1분으로 35 cycle을 시행하였다. 사용한 primer와 sequence number 및 product size는 다음과 같다(Table 1). 반응 후 산물은 1.5% agarose gel을 이용해 분리하였고 ethidium bromide를 이용하여 염색한 후 촬영하였다.

Western blot
   정상 성인 백서 5마리의 이관과 중이 점막, 폐부조직을 분리하여 완충용액(Cell Signaling Technology, Beverly, MA)으로 처리하고 electrical homogenizer를 이용하여 균질화시킨 후 Beckman J6-MI 원심분리기를 이용하여 4℃에서 30분간 4,000×g의 속도로 처리하였다. 상층액을 수거하여 4℃에서 1시간 동안 20,000×g의 속도로 원심분리한 후 다시 상층액을 수집하여 단백질 농도를 Non-interfering Protein Assay kit(Bio-Rad, Hercules, CA)를 이용하여 측정하였다.
   총 membrane protein(20 μg/each lane)들을 Tricine sample buffer(200 mM Tris-HCl, pH 6.8, 40% glycerol, 2% SDS, 0.04% Coomassie Blue G-250)에 용해시키고 5분간 열처리한 후, 10% Tricine gel(2.6% Bis-Acrylamide, pH 8.3, Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용한 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (Miniprorean II apparatus；Bio-Rad, Herculus, CA)를 이용하여 분리하였다. 분리된 단백질은 electroblotter를 사용하여 0℃에서 2시간 동안 polyvinylidene difluoride(PVDF) membrane(0.2 μm, Bio-Rad, Herculus, CA)에 옮겼으며 상온에서 5% skim milk가 포함된 1×Tris-buffered saline과 0.05% Tween 20의 용액으로 blocking하였다. 이후 상온에서 AQP1, 4, 및 5(Chemicon, Temecula, CA)에 대한 polyclonal antibody를 첨가하여 하룻밤을 반응시켰고, TBST(50 mM Tris-HCl[pH 7.4], 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20)와 0.5%의 blocking solution으로 세척한 후 50 mU/ml anti-rabbit IgG horseradish peroxidase(HRP)-conjugated secondary antibody와 biotinylated protein marker(Cell Signaling Technology, Beverly, MA)를 첨가하여 상온에서 1시간 동안 incubation 시킨 후 TBST로 4회 세척하였고 enhanced chemiluminescence(SuperSignal, Pierce)를 붙인 후 사진(Hyperfilm, Amersham Pharmacia Biotech, England)으로 관찰하였다.

면역조직화학염색
   성인 백서 5마리의 조직을 심관류법으로 고정시킨 후 4℃에서 다시 24시간을 재고정한 후 4% paraformaldehyde(pH 7.4)가 함유된 7% EDTA(ethylenediamine tetraacetic acid) 용액에 담그고, 5일간 매 시간마다 신선한 용액으로 바꾸어가면서 하루에 5시간씩 microwave로 처리하는 microwave decalcification 방법을 이용하여 탈석회화시켰다. 이 조직을 파라핀 속에 고정하여 6 μm 간격으로 박편하여 파라핀을 제거한 후 항원 복구(antigen retrieval)는 37℃에서 10분간 citrate buffer에서 시행하였다. 내인성 peroxidase의 활성을 차단하기 위해 각 절편은 상온에서 1% H₂O₂용액으로 30분간 처리하였다. 이것을 다시 PBS로 세척하고 37℃에서 1% bovine serum albumin을 20분간 전처리한 후 AQP1(1：1000), AQP4(1：250), 및 AQP5(1：50)에 대한 일차항체로 4℃에서 10시간 동안 처리하였다. 그 후 PBS로 다시 세척하고 상온에서 30분간 EnVision+(Dako, Carpinteria, CA)으로 처리한 후, 0.05% 3, 3 p-diaminobenzidine으로 incubation하였고 Mayer's hematoxylin으로 대조염색한 후 관찰하였다. 이 실험에서는 각각의 장기에서 적어도 3개 이상의 표본을 채취하여 처리하였고, 음성 대조군으로 일차항체 대신 rabbit preimmune serum을 사용하였다.

결     과

이관과 중이 조직에서의 AQP mRNA들의 발현
   역전사 중합효소 연쇄반응을 이용하여 각 조직에서의 AQP 1, 2, 4, 5, 및 7의 mRNA의 발현을 검사하였다(Fig. 1). 물을 음성 대조로 하여 이관과 중이, 폐, 신장과 타액선 조직에서 각각의 AQP 아형을 검출해 보았을 때, AQP1은 152 bp에서 이관, 중이, 폐, 신장, 타액선 등에서 검출되었고, AQP2는 198 bp에서 신장에서만 검출되었다. AQP4 및 5는 AQP1과 유사하게 각각 202 bp, 210 bp에서 이관, 중이, 폐, 신장 타액선에서 관찰되었으며 AQP7은 457 bp로 신장에서만 관찰되었다. 모든 AQP의 아형들은 음성 대조군인 물에는 모두 음성을 보였다. 요약해보면 이관과 중이 상피에서는 AQP1, 4, 및 5가 발현되었으나 AQP2와 7은 신장에서만 양성인 결과를 얻을 수 있었다.

Western blot 분석
   Western blot으로 이관과 중이, 폐부조직에서의 anti-AQP 항체의 특이성과 반응성을 검사하였다. 이관 및 폐부조직에서는 사용한 5마리 모두에서 anti-AQP1 항체가 28 kDa에서 검출되었고, anti-AQP4는 31 kDa에서, 그리고 anti-AQP5는 26 kDa에서 검출되었다(Fig. 2). 또한 중이 조직에서는 anti-AQP1과 anti-AQP4 항체는 모두에서 검출되었으나, anti-AQP5는 전혀 검출되지 않았다. 부수적으로 28~30 kDa 이상의 위치에서 검출된 것은 각 AQP의 homo-oligomeric complex로 생각되었다.

면역조직화학염색
   Purified antibody와의 친화성을 이용한 면역조직화학염색으로 이관에서의 AQP1, 4, 5의 세포내 분포를 검사하였다(Fig. 3). AQP1은 저배율에서 보면 상피점막하 조직에서 발견되었는데 이를 고배율로 관찰해보면 섬유아세포에 염색이 된 것을 알 수 있었다. AQP4는 저배율에서 보면 주로 상피 조직에 염색됨을 볼 수 있었으며 고배율에서 보면 세포 첨부를 제외한 기저측부에 진하게 반응이 이루어졌음을 볼 수 있었다. AQP5는 저배율 현미경 소견에서는 위 두 AQP보다 심부 조직에서 관찰되었고, 고배율 소견에서는 주로 장액 분비세포의 첨부에서 보이지만 점액선 조직이나 상피세포의 배상 세포에서는 관찰되지 않았다. 이 결과를 도표로 요약하면 Fig. 4와 같다.

고     찰

   이관은 중이강과 비인두를 연결하는 관으로 양측 입구부는 약 8.5 mm 높이이고 가운데가 약 3.5 mm 정도로 좁아져서 협부를 형성하고 있는 기관으로 중이와 대기압 사이의 압력조절과, 비인두부로부터의 들어오는 음향압력과 분비액으로부터의 보호, 그리고 중이 내에서 만들어지는 불필요한 물질들을 배설하는 역할을 한다.⁴⁾
   Mulder 등⁵⁾의 연구에 의하면 백서의 이관은 비인두부에서 고실강까지의 거리가 약 4 mm이며, 구성 세포 중 단층 편평상피가 많고 비인두부 쪽으로 가면서 점차 중층 편평상피가 된다는 것과, 장액성 반월세포(serous demilunes)가 뚜렷하지 않다는 것이 인간의 이관과 차이가 있을 뿐, 나머지는 인간의 이관과 거의 똑같은 구조를 하고 있다고 하였다. 이관의 협부는 Sudo 등⁶⁾이 보고한 이관의 3차원적 구조 분석으로 볼 때 연골부에서 골부로 바뀌는 이행부에 존재하며, 가장 좁다는 특성 때문에 폐색이 잘 일어나는 지점으로 삼출성 중이염의 발생에 중요한 지점이 될 것이다. 즉 이 부위에서 수분 불균형이 발생하여 약간의 부종이 일어나면 이관은 막히게 되고 그 결과로 삼출성 중이염이 발생할 것으로 예측되며, 앞으로 이 부위에 대한 병리학적, 세포조직학적 연구는 좀 더 진행해야 할 과제 중의 하나라고 사료된다.
   AQP에 대한 연구는 1986년 Benga 등이 인간 적혈구막에서 35~60 kDa의 분자량을 가진 수분 통로를 처음으로 확인하면서 시작되었다.⁷⁾ 그 후 1988년 Agre 등이 인간 적혈구에서 28 kDa의 non-glycosylated component와 35~60 kDa의 넓은 band를 가진 glycosylated component를 가진 내막 단백(internal membrane protein)을 발견하였고,⁸⁾ 이것을 1991년 CHIP28(CHannel forming Integral Protein28)이라 명명하였다.⁹⁾ Agre 등은 연구를 계속 진행함에 따라 이것이 수분의 이동을 조절하는 것이 아니라 그 자체가 수분의 이동 통로가 됨을 알게 되었고 마침내 1993년 CHIP28을 aquaporin 1이라고 명명하였다.¹⁰⁾ 이 후에 AQP1과 비슷한 isomer들이 계속 보고 되면서 현재까지 포유류에서는 10개의 아형이 보고되었다.^1)2)3)4)
   AQP1은 적혈구 이외에도 신장의 근위요세관, 혈관 내피세포 등에 존재하며,⁸⁾¹¹⁾ AQP1 내의 수분통로에는 수분 친화성 부위가 군데군데 있고, 이 부위 이외에는 수분 비친화성을 가지므로 수분의 이동은 마치 신경 섬유가 전기자극을 전달하는 것처럼 도약전도(saltatory conduction)의 형태로 이루어진다. AQP1에서의 수분 이동 속도는 약 3×10⁹ water molecule/subunit/sec로 현재까지 밝혀진 세포막에 존재하는 통로 중에 제일 빠른 것으로 생각된다.¹²⁾ AQP1의 결함이 있는 경우에는 대부분 무증상이지만, 실험적으로는 신장의 농축능력 장애나 모세기관지에서의 수분 투과력이 떨어지는 결과가 증명되었고, 만일 체내 수분 결핍이나 수분과다 시에는 임상적 증상이 나타나기도 한다.¹²⁾
   AQP2는 신장의 집합관(collecting duct)에 존재하여 세포내 소포(intracellular vesicle)로부터 첨부 세포막으로 수분을 전달하는 작용을 하고 vasopressin에 의해 조절되어진다.¹³⁾ AQP2의 결핍으로 요붕증(diabetes inspidus)이나 야뇨증이 발생하며, 이와는 반대로 울혈성 심부전(congestive heart failure)이나 임신 시에는 그 농도가 증가하게 된다.⁴⁾
   AQP3은 신장의 collecting duct의 기저측부 세포막에 존재하여 수분과 함께 urea나 glycerol 같은 작은 비이온성 물질의 이동 통로로 작용한다. 그 밖에 소화관과 눈의 각막에도 존재한다.¹⁴⁾ 수은과 비친화적인 수분통로로 알려진 AQP4는 주로 뇌에 존재하며 일부는 안구, 폐, 그리고 위장관 조직에 분포한다고 알려졌다.¹⁵⁾ AQP5는 타액선에서 관찰되었으며 그 밖에 누선이나 폐, 기관지에 존재한다고 알려졌다.¹⁶⁾
이처럼 다양한 조직에 다양한 종류의 AQP가 분포하고 있어서 항상 일정한 양의 수분이 유지되고 있으며, 수분의 이동은 주로 상피세포의 기저막에 존재하는 Na⁺, K⁺-ATPase에 의한 Na⁺의 배출과 Na⁺ channel을 통한 Na⁺의 유입에 의해 발생한 삼투압 차이에 의해 조절되는 것으로 알려져 있다.¹⁷⁾
   위에서 살펴 보았듯이 각각의 AQP는 수분 이동 능력과 조절 기전도 다르고 결핍이나 과다 시에 나타나는 병리학적 소견도 달라진다. 본 연구에서 이관과 중이에서 AQP1, 4, 및 5가 검출되었으며 그 존재 위치도 각각 다르게 나타난 것은 이관내 세포들에 있어서 수분의 이동이 복잡하게 이루어지고 있음을 암시하며 이 중 어떠한 아형이 돌연변이를 일으키거나, 기능이나 개체 수의 변화가 생긴다면 다양한 이관내 병변이 발생할 것이다. 물론 이관 부종이나 개폐 이상 같은 병적인 상태는 해부학적 구조이상이나, 바이러스나 세균의 산물, lysozyme, lactoferrin, alpha-1 antitrypsin 같은 효소, 알레르기 반응에 의한 산물 등 여러 가지 요인이 복합적으로 작용해서 발생할 것이지만, 어떤 AQP의 이상이 병변을 일으키는지, 그리고 다른 병인들과의 관련성은 앞으로 좀 더 연구해야 할 과제라고 사료된다.
   Western blot의 결과를 보면 중이 조직에서의 AQP5만이 검출되지 않았는데 이는 antibody의 sensitivity 때문인지 미량으로 존재하여 검출되지 않았는지는 더 연구가 필요하다고 본다.
   본 연구에서 면역조직화학법을 사용했을 때, AQP5가 장액선세포의 첨부에서 주로 관찰되고 점액선 세포에서는 발견되지 않은 것은 장액선이 효소단백질을 포함하는 수분이 풍부한 액을 분비하는 반면에 점액선 세포는 주로 mucin을 만들어내므로, 이런 결과는 AQP5가 장액선에서 세포간 통로 쪽으로 수분이 풍부한 용액(장액)을 분비하는데 관여할 것이라는 추론을 가능하게 한다. 이 결과는 AQP5가 누선의 acini 세포의 첨부와 장액성의 타액선에서 분비통로로 향한 미세섬모에서 관찰되었다는 Funaki 등¹⁸⁾과 Nielsen 등¹⁹⁾의 결과와 일치한다. 또한 본 연구에서는 면역조직화학염색을 통해 AQP1이 이관과는 기저막으로 분리된 섬유아세포에서 확인되었는데, Minami 등²⁰⁾은 AQP1이 섬유아세포와 모세혈관 내피세포에서 관찰되었다고 보고한 것으로 보아 AQP1이 혈액과 조직 사이의 수분 이동에 관여할 것으로 생각되어진다.
   또한 Minami 등²⁰⁾은 백서에서 AQP4와 5의 중이내 관찰을 보고하였는데, AQP4는 점막세포의 기저측부에서 관찰되었고, AQP5는 점막세포의 첨부에서 분포한다고 보고하였다. 섬모세포에서 AQP4, 5가 함께 검출된 것은 중이강 내의 수분 항상성 유지에 섬모세포가 결정적인 역할을 하고 있음을 시사하고 있다고 하였다. 본 연구에서 AQP4는 섬모상피세포의 기저측부에서 관찰되었지만, Minami 등의 결과와는 다르게 AQP5가 장액선 세포의 첨부에서 관찰된 점은 앞으로 연구를 통해 좀 더 분석해 보아야 할 것이다.

결     론

   AQP1과 AQP4 그리고 AQP5가 백서의 이관에서 관찰되었다. AQP1은 이관의 상피하조직의 섬유아세포에서, AQP4는 섬모상피의 기저측부에서, 그리고 AQP5는 장액선 세포의 첨부에서 각각 관찰되었으며 상피 내의 goblet 세포에서는 관찰되지 않았다. 이와 같이 이관 내에서 AQP 아형들의 다양한 특징적인 분포형태는 이관의 수분 및 물질 이동을 담당하는 특정 부분이 있음을 보여주는 것이다. 이런 부분들에 의해 섬모주위액의 항상성이 유지되고 세포는 정상적인 기능을 수행하는 것으로 사료된다. 앞으로 본 연구를 기초로 하여 다양한 중이와 이관의 질환에 대해 각각의 AQP의 개체수와 가능의 변화를 좀 더 연구한다면 이들 질환의 치료에 큰 도움이 될 수 있으리라 사료된다.

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