교신저자：윤용주, 561-756 전북 전주시 덕진구 금암동 634-18  전북대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
교신저자：전화：(063) 250-1980 · 전송：(063) 250-1986 · E-mail：yjyoon@chonbuk.ac.kr

서     론

   오래전부터 점막의 섬모정화운동 및 피부를 포함한 기계적 방어기전이 연구되어 왔으며 최근에는 화학적 방어기전에 대한 관심이 증가되고 있다. 피부도 점막과 마찬가지로 매우 복잡하게 구성된 방어망군을 형성하고 있다. 그 중 화학적 방어망은 호흡기의 점막에서 생성, 분비되는 각종 항균단백(lysozyme, lactoferrin)과 폡티드(β-defensin, LL-37) 그리고 항단백분해효소들(secretory leukoprotease inhibitors, α1-antitrypsin)이 대표적인 항균 요소들로서 장액세포에서 생성, 분비되어 균주로부터 일차방어의 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려져 있다.^1,2,3) 정상 외이도피부는 pH 6 정도의 산성보호막이 존재하고 있어 균을 억제하며 지속적인 탈피와 귀지의 움직임으로 자연세척능력을 갖추고 있다.^4,5)
   호흡기 점막의 각종 항균 요소들의 생성과 유리에 관한 보고에서 점액샘보다 장액샘의 역할이 매우 중요한 것으로 알려져 있지만⁶⁾ 외이도 피부에 풍부하게 존재하는 샘 조직인 기름샘과 귀지샘(한샘)에서 이러한 항균작용과 관련한 연구가 매우 적어 먼저 중요면역세포와의 상호 관련성을 알기 위해 외이도의 연골부 피부에 풍부하게 존재하는 샘 세포와 비만세포의 분포의 특성을 알기 위해 본 실험을 하게 되었다.

재료 및 방법

조직표본 제작 
   만성중이염 환자의(5명) 외이도 성형술 중 얻은(본 연구는 헬싱키 선언에 근거하여 전북대학병원 윤리위원회 승인 하에 실시되었음) 연골부 피부조직을 수술현미경 하에서 미세 조작하여 4% paraformaldehyde에 24시간 침전 고정한 뒤 0.1 M phosphate buffered saline(PBS)에 몇 차례 세척하여 alcohol과 xylene의 처리를 거쳐 파라핀 포매를 하여 4 μm 두께의 절편을 만들어 면역조직화학적 염색에 이용하였다.

면역조직화학법(Avidin-Biotin complex method)
   Poly L-lysine으로 도포된 슬라이드 위에 부착된 절편을 xylene으로 탈 파라핀한 후 내인성 과산화효소의 반응을 피하기 위해 3% H₂O₂에 반응시켰다. Tryptase와 chymase의 면역 국소화는 avidin-biotin immunoperoxidase(ABC)법을 사용하였는데 간기하면 다음과 같다. 특이면역조직 화학반응을 시행하기 위하여 먼저 제1차 항체인 mouse monoclonal tryptase and chymase antibodies(Novocastra Laboratories Ltd, England)들을 PBS에 1：150으로 희석하여 각 절편당 100 ul씩 떨어뜨려 주위로 번지지 않는 것을 확인한 뒤 4℃에서 48시간 동안 반응시켰다. 그리고 PBS에 30분씩 3차례 세척한 후 제2차 항체로서 biotinylated goat anti-mouse immunoglobulin(Dakopatts AB, Hagersten, Sweden)을 1：500으로 PBS에 희석시켜 4℃에서 24시간 적용시켰다. 다시 PBS로 30분간 3번 세척한 후 avidin biotin comlplex(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)를 1：200으로 희석하여 30분 동안 반응시켰다. 조직절편은 기질액에 0.03% diaminobenzidine tetrahydrochloride(Sigma Co, St Louis, MO, USA)을 용해시켜 흡지에 여과시킨 후 H₂O₂를 0.01%가 되도록 한 용액에 5분간 반응시킨 후 gelatin으로 처리된 슬라이드에 얹어 대조염색은 Meyer's hematoxylin으로 1분간 반응시켰고 음성대조군은 위 과정 중 일차 항체대신 인산완충용액을 사용하였다. 실온에서 건조시킨 다음 봉입하여 광학현미경으로 관찰하였다.

결     과

   비만세포의 대부분은 고유층 즉 진피층에서 발견되었으며 진피층 중에서도 외편평상피 직하부에 접근되어 일련 관찰되었으며(Fig. 1), 특히 귀지샘 주위에서 많은 비만세포가 관찰되었다(Fig. 2). 전반적으로 귀지샘 주변의 비만세포는 기름샘에 비하여 밀도가 높고 분명하게 관찰되었다(Fig. 2). 상피층에서는 비만세포가 관찰되지 않았으며 기저막에서도 또한 보이지 않았다(Fig. 1).
   상피 직하강에서는 가장 저명하게 비만세포들이 관찰되었고 샘 조직의 표층에서도 적은 수의 비만세포가 나타났다. 샘 조직의 비만세포는 주로 샘 조직 사이의 간질에서 비교적 많이 관찰되었다(Fig. 3). 

고     찰

   정상의 외이도 피부는 산성보호막과 귀지에 포함된 항균작용 물질이 존재하고 있어 균을 억제하며 또한 지속적인 탈피와 귀지의 움직임으로 자연세척능력을 갖추고 있어 외이도 피부를 병균의 침범으로부터 막아주어 보호하고 있다.
   신체를 주위 환경으로부터 방어하는 기능은 근본적으로 피부의 두 조직, 즉 상피와 결합조직에 의한다. 진피는 피부의 아래쪽에 있는 내층으로서 모낭, 혈관과 샘을 포함한다. 외이도의 연골부의 피부는 많은 기름샘(sebaceous gland)과 땀샘의 변형인 귀지샘(ceruminous gland)을 포함하고 있다. 그 중 기름샘은 피부표면 가까이에서 모낭과 연결되어 기름샘이 마치 포도송이처럼 모낭벽에 붙어 있으며 피지(sebum)를 분비하는데 기름샘에서 분비되는 피부지질은 지방 50%, 왁스 20%, 지방산 5% 등으로 되어 있고, 약산성으로서 항균작용을 하기도 하며 피부를 보호하는 역할을 한다. 귀지샘은 코일형의 밑 부분과 관상형의 관으로 되어 있으며, 관은 땀구멍이 있는 피부표면에 닿아 있으며 단백질을 많이 함유하며 중요한 항균물질들을 배출한다. 일반적으로 외이도 피부에서 샘 조직 중 귀지샘은 기름샘보다 넓은 면적을 차지하고 있다. 호흡기 점막의 연구에서 밝혀졌듯이 기도점막의 샘 중 점액샘보다 장액샘이 차지하는 면적의 우세가 항균효과에 밀접하게 관련된다고 알려져 있는데⁷⁾ 과연 외이도 피부에서도 일차적인 생화학적 방어세포로서 귀지샘 세포가 그 역할을 하고 있는지에 많은 관심을 갖게 한다. 
   감염으로부터 해부학적 방어막을 이루는 피부와 점막을 보호하는 면역계는 크게 비 특이적 요소와 특이적 요소로 구분할 수 있다. 비 특이 면역에 해당하는 입양면역(innate immunity, 자연면역)은 모든 병원체에 대해서 반응할 수 있는, 질병으로부터 개체를 보호하는 면역기능이다. 감염되거나 병균에 노출되었을 때 일차방어는 대개 입양면역에 의해 우선 저지된다. 방어기능은 기계해부학적, 생리생화학적 그리고 탐식에 의해 일어난다. 기계해부학적 방어막으로서는 기도점막의 점액섬모 정화계와 마찬가지로 피부의 각화를 동반한 외측 이동현상과 피부 샘에서 분비되는 물질에 의해 피부 표면이 pH 5 정도의 약산성을 유지함으로써 병원체의 성장을 효과적으로 막아주게 된다. 피부와 점막에서 분비되는 항균성 펩티드와 단백은 조직 속에서 내재하면서 면역체계의 한 부분을 구성하고 있으며 여러 미생물의 조직침투를 방어하는 기능을 수행하는데 분비샘에서 주로 배출된 lysozyme, lactoferrin, 분비형 IgA, antimi crobial peptide(defensin, LL-37)와 같은 잘 알려진 항균물질 그리고 α1-antitrypsin과 secretor leukoprotease inhibibitor 등의 항 단백분해효소들을 포함하고 있다.^8,9,10,11) 따라서 이런 항균물질들이 미생물 감염 시 숙주에 대한 화학적 방어 작용을 하게 되며 비 특이 면역의 중요한 부분을 차지한다. 외이도 피부의 진피층의 심부에 훨씬 많이 존재하는 풍부한 귀지샘에서 이러한 능동적인 항균요소들의 생성이 일어나있고 있음이 시사되어 생화학적 방어의 중요한 부분으로서 높은 관심을 불러일으키고 있다.
   비만세포는 외부로부터 자극물질과의 접촉부위인 피부, 호흡기 소화기, 림프관 그리고 혈관 주변에 많이 존재한다. 비만세포는 2종류로 나뉘는데 tryptase만 포함하는 점막비만세포(MCT)는 주로 폐포벽과 소장의 점막에서, tryptase와 chymase를 모두 포함하는 결합조직 비만세포(MCTC)는 피부의 각화 편평상피의 외층직하의 결합조직층에 분포되어 있는 것으로 알려져 있다.^12,13) 이과 영역에서 비만세포의 분포에 대한 연구는 많지 않았다. 중이에서 Poulsen¹⁴⁾ 이 비만세포가 중이강과 이관의 점막하에 분포한다고 처음 보고한 이후 인간과 실험동물 등에서 중이강의 결합조직층에서 비만세포가 존재함을 미세조직학적 연구로 증명하였다.¹⁵⁾ 고막에서는 스웨덴의 Hellstrom 등¹⁶⁾이 삼출성 중이염에 병인에 관련하여 비만세포에 대한 연구를 하였다. 이관과 고막에서 비만세포의 정확한 역할이 제시되지 못하고 있지만 항상 각종항원으로 부터 면역적으로 방어할 수 있어야 하기 때문에 이곳들에서 비만세포의 존재와 역할의 증명은 매우 중요할 것으로 사려 된다. 
   비만세포의 과립에 heparin, histamine, proteolytic enzyme 그리고 serotonin을 포함하여 약리학적으로 강력한 많은 물질을 생성, 유리하여 생리적 그리고 면역 기능의 조절을 할 수 있기 때문에 생물학적으로 능동적인 기능을 하고 있을 것으로 고려되고 있다. 한편 비만세포와 신경이 서로 작용한다는 상당한 증거와 함께 다양한 신경전달매개물질이 비만세포로부터 유리될 수 있다고 보고되고 있다. 이러한 신경전달물질들로서는 SP, VIP, somatostatin, neurotensin 그리고 endorphin과 같은 것들이 있다.^17,18) 개의 기도의 장액샘에서 비만세포의 chymase는 가장 강력한 분비촉진물질(secretagogue)로 알려져 있으며 땀샘(이구샘)에 주로 존재하는 항균펩티드의 분포의 특성과 연관하여 볼 때 비만세포의 조절 가능성이 시사된다. 한편 항균펩티드(defensin, LL-37)가 비만세포에서 histamine을 유리시키는 것으로 보고되고 있는데,¹⁹⁾ 이러한 항균펩티드와 단백들은 비만세포의 분비제로서 작용하며 비만세포의 생리적 조절에 영향을 미친다. 흥미롭게도 조직에서 비만세포의 분포의 특색은 작은 혈관이나 림프관주위에 존재할 뿐만 아니라 신경이나 샘 조직에서도 관찰된다. 본 실험에서도 진피층 깊게 분포하고 있는 귀지샘 근처에서 많은 비만세포가 관찰되었다. 
   결론적으로 인간의 정상 외이도 피부에서 비만세포(tryptase, chymase)의 존재와 분포를 알기 위해 immunoperoxidase technique(avidin-biotin complex method) 법을 이용하여 본 연구를 시행하여 비만세포의 귀지샘과 기름샘에서 분포의 특성을 찾아 분석하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 비만세포는 정상외이도 피부에서 많이 관찰되었으며 기름샘보다 귀지샘 주변에서 훨씬 더 많이 분포하였다. 따라서 정상외이도의 샘 조직에서 비만세포의 분포의 특성상 귀지샘과 비만세포의 상호작용의 가능성과 귀지샘이 즉각적 방어(instant immunity)에 깊게 관련될 것으로 시사된다.

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