교신저자：노종렬, 301-721 대전광역시 중구 대사동 640  충남대학교 의과대학 이비인후과학교실
교신저자：전화：(042) 220-7698 · 전송：(042) 253-4059 · E-mail：happyfam@paran.com
^*저자 현 소속：울산의대 서울아산병원 이비인후과

서     론

   Epstein-Barr virus(EBV)는 B림프구에 감염되는 헤르페스 바이러스의 일종으로 우리나라를 비롯한 동아시아권과 중남미권에서 EBV관련 질환이 기타 지역보다 현저히 빈발하는 것으로 보고된다.¹⁾ EBV는 전염성 단핵구증 및 Burkitt 씨 림프종, 비인두암종, 호즈킨 림프종,²⁾ 비강 자연살해세포(natural killer, NK)/T 세포 림프종, 구강의 모반 백반³⁾ 및 림프상피종양 암종⁴⁾ 등의 유발에 관여하는 것으로 잘 알려져 있다. 또한, 비인강암을 제외한 두경부 영역의 암과 EBV와의 관계에 대한 연구가 보고되고 있지만, EBV 유행지역인 우리나라에서 두경부암과 EBV와의 관련성을 보고한 논문은 드물다. 저자들은 두경부암으로 초진된 72예를 대상으로 EBV in situ hybridization(ISH), late membrane protein-1(LMP-1)과 bcl-2에 대한 면역조직화학적 방법을 이용하여 EBV와 두경부 암과의 관련성을 규명하고자 하였다.

대상 및 방법

대  상
   2003년 8월부터 2005년 1월까지 본원에서 두경부 종양으로 진단된 초진 환자 72명을 대상으로 하였다.

방  법
   혈액을 채취하여 EBV에 대한 EA-D/R, VCA IgG/IgM을 측정하였고, 종양 조직에서 EBV ISH과 p53, LMP-1, bcl-2에 대한 면역조직화학염색을 시행하였다. 위 결과를 TNM 병기, 병리, 흡연등과의 연관성을 살펴보았다.

EBV in situ hybridization
   두경부암 파라핀 블록에서 4 μm 두께로 박절한 조직을 슬라이드에 올려놓고 탈파라핀과 재함수 과정을 거친 뒤 proteinase K(Sigma, St. Louis, MO, USA)로 37℃ 항온조에서 30분간 처리한 후 다시 3분간 2번씩 수세하여 에탄올로 탈수하였다. 다음 probed hybridization solution을 조직에 올려 커버 슬라이드를 덮은 채 37℃에서 2시간 처리한 후 TBS(Tris bufferd saline) 완충액으로 세척하였다. 검출은 EBV probe ISH Kit(Novocastra, Newcastle, UK)를 사용하였다. 먼저 1：100으로 희석된 rabbit F(ab') anti-FITC/AP 150 μl로 30분간 반응시킨 후 TBS 완충액으로 세척한 뒤 substrate buffer에 담그고 희석된 enzyme substrate(BCIP/NBT)와 1000배 농축된 Levamisole hydrochloride와 함께 overnight 처리하였다. 5분간 수세한 후 10초 동안 Mayer's haematoxylin으로 대비 염색하였다. 판독은 광학현미경 하에서 전체 두경부 암세포의 30%이상에서 핵 내부에 중등도이상으로 염색될 경우 양성으로 하였다.

p53, LMP-1, bcl-2에 대한 면역조직화학염색
   파라핀 포매 조직에서 절편을 얻은 후 탈파라핀 과정을 거친 뒤 알코올에 재함수하여 증류수로 세척하였다. 조직 슬라이드를 p53에 대한 일차항체(Dako, Glostrup, Denmark)를 1：70의 비율로, LMP-1 일차 항체(Dako)를 1：150의 비율로, bcl-2 일차항체(Dako)를 1：100의 비율로 희석하여 작용시킨 후 PBS로 세척하고 peroxidase-labelled streptavidin 항가토 생쥐 면역글로불린을 반응시켜 PBS에 세척한 뒤 DAB(3,3 diaminobenzidine tetrahydrochloride)를 이용하여 발색하였다. 각각 세포 내에 갈색으로 염색된 것으로 양성으로 하였다.

통계 검증
   원발 병소의 병기, 병리, 위치, 흡연에 따른 EBV ISH 양성률을 Fisher's Exact test을 이용하여 비교하였다. 또한 LMP-1과 bcl-2 면역조직화학염색의 양성률과 EBV ISH 양성률과의 연관성을 Fisher's Exact test을 이용하여 알아보고자 하였다. 유의수준은 p<0.05으로 하였다.

결     과

두경부 암에서 EBV ISH 양성도
   환자들의 평균연령은 59세(분포 22~80세)였고, 성별은 남녀 비가 58：14로 남자가 많았다. 연령 및 성별은 EBV ISH 양성률과 연관성이 없었다. 또한 흡연 및 음주여부도 통계학적 연관성이 없었다. 또한 72명 모두에서 VCA IgG 양성, VCA IgM 음성, EA-D 음성이었다.
   EBV ISH 결과 주로 종양세포의 핵 내부에서 흑갈색으로 염색되었으며, 염색 정도는 대부분 중등도 이상으로 진하게 염색되었다(Fig. 1). 각 원발부위로는 비인두암 10예 중 3예(30%), 비강 NK/T 세포 림프종 7예 중 5예(71%), 타액선 5예 중 림프상피암종 1예(20%)였다. 임상적 병기에 따른 EBV의 검출률은 비인두암의 경우 WHO type II은 5예 중 1예(20%), III형은 4예 중 2예(50%)에서 양성을 보였다. 비강 NK/T 세포 림프종 환자의 경우 병기 I형 3예 모두와 II형 2예 중 1예(50%), IV형 2예 중 1예에서 양성을 보였으나 통계학적 의의는 없었다(Table 1). 병리학적으로 분류하였을 경우 편평상피세포암종의 6%와 림프종의 31%, 타액선 암종의 1.6%에서 EBV ISH에 양성반응을 보였다(Table 2).

두경부 종양에서 EBV ISH 양성과 p53, LMP-1, bcl-2와의 관계
   72명의 두경부 암 조직의 면역조직화학염색 중 p53에는 26예(36%), LMP-1에는 6예(8%), bcl-2에는 13예(18%)에서 양성이었다. p53 양성과 EBV ISH 양성과 통계학적 유의성은 없었다(p=0.197). LMP-1은 EBV ISH에 양성인 환자의 조직 9예 중 4예(45%), EBV ISH 음성인 환자의 조직 63 중 2예(3%)에서 양성으로 두 군 사이에 통계학적으로 유의한 차이가 있었다(p<0.001). bcl-2은 EBV ISH 양성인 조직 9예 중 5예, 음성인 조직 63예 중 8예에서 양성으로 두 군 사이에 통계학적으로 유의한 차이가 있었다(p=0.002)(Table 3).

고     찰

   EBV는 비인두암 이외의 두경부암에서 0~68.2%정도로 검출된다고 알려져 있다.⁵⁾ 특히 구강암^6,7,8,9)이나 구인두암,¹⁰⁾ 후두암^11,12)과 연관성이 있다고 보고되고 있으나 EBV 양성률의 차이나 상반된 결과도 보고되고 있으며, 특히 EBV 유행지역인 우리나라에서의 연구는 두경부 종양 중 후두암¹³⁾과 두경부 림프종¹⁴⁾를 대상으로 한 연구이외에는 없었다.
   EBV의 검출방법으로는 Southern blot hybridization, ISH법과 중합효소연쇄반응(PCR)법 등이 있다. 그 외 EBV의 존재를 확인하는 방법으로는 항체를 이용한 면역조직화학적 염색법, 혈청 내의 EBV 항원에 대한 항체를 검출하는 방법, 전자현미경을 이용한 세포 내 봉입체나 viron을 확인하는 방법 등이 있다. 이중 ISH법은 감염된 세포의 조직 내 위치 및 세포 내 감염부위를 알 수 있어 특이성이 높으나 각 세포에서 viron genome이 많이 있어야 검출이 가능하기 때문에 민감도가 떨어지는 단점이 있다. 이에 비해 중합효소 연쇄반응법은 미량의 virus DNA sequence도 검출할 수가 있어 민감도가 높은 장점이 있으나 조직의 분쇄로 인해 특이성이 낮다는 단점이 있다. 본 연구에서는 두경부암 조직내의 EBV 감염여부를 알아보기 위해 특이성이 높은 EBV ISH를 이용하여 조직내의 EBV RNA를 검출하였다. 국외의 경우 Kobayashi 등⁷⁾은 Frozen EBV DNA Southern blot과 mRNA EBV ISH(EBER 1)를 이용하여 구강암 46예 중 7예(15.2%)에서 EBV 양성을 보고하였으며, Gan 등¹⁵⁾은 PCR을 이용하여 구강암 환자에서 66%의 검출률을 보고하기도 하였다. 두경부 암 조직을 대상으로 PCR을 이용한 연구에서 Jeng 등¹⁶⁾은 하인두암과 후두암은 각 3예 중 2예, 구인두암은 3예 중 1예에서 EBV를 검출하였고, Tyan 등¹⁷⁾은 하인두암 12예 중 8예(66%), 후두암 10예 중 6예(60%), 타액선 암은 모든 예(100%) 그리고 구강암은 9예 중 4예(43.4%)에서 검출하여 높은 검출율로서 EBV 감염과의 관련성을 보고하였다.
   그러나 우리나라에서는 Min 등¹²⁾이 후두암 조직에서 ISH방법을 이용하여 약 18%의 검출률을 보고하였으며, Park 등¹⁴⁾은 PCR을 이용하여 두경부 림프종 환자에서 57.7%의 EBV DNA 검출률을 보고한 연구이외에 다른 부위의 암을 대상으로 한 연구는 없다. 본 연구에서는 비인두암 및 NK/T세포 림프종, 이하선 림프상피암종에서만 양성을 보여 전체 두경부암 환자 72명 중 9명의 환자(12%)에서 양성이었다. 비유행지역에서 시행한 Goldenberg 등⁹⁾은 비인두암을 제외한 두경부 상피세포암종에서는 약 1% 정도의 EBV 검출률을 보여 본 연구에서는 비인두암을 제외한 두경부 상피세포암종에서 EBV가 검출되지 않아 비유행지역과 차이가 없었다. 이는 타연구의 결과와는 달리 구강암이나 구인두암, 후두암 등에서는 양성을 보이지 않았다. 또한 병리학적으로는 편평상피세포암종의 6%와 림프종의 31%, 타액선암종의 1.6%에서 EBV ISH에 양성반응을 보였다(Table 2). 이러한 결과의 차이는 EBV의 역학적 차이점도 있겠지만, 특이성은 높으나 민감도가 낮은 ISH법을 이용하였기 때문으로 생각된다. PCR과 ISH의 민감도 차이로 볼 때 PCR의 경우 실제 EBV DNA가 없음에도 양성반응을 보이는 가양성 가능성도 고려하여야 할 것으로 생각된다. 또한 문헌 및 연구 지역에 따라 차이가 있지만, 종양이 없는 정상 구강, 인두, 편도에서도 45%정도까지 양성으로 나타난다고 보고된 문헌도 있기 때문에 이도 고려해보아야 할 것이다.¹⁸⁾
   EBV 감염과 악성 종양과의 관련성에 대한 여러 연구들은 EBV의 유전자 산물인 6개의 핵항원(EBNA 1, 2a, 3a, 3b, 3c, 5)과 2개의 latent membrane protein(LMP-1, 2)이 종양의 병인 기전에 관여한다고 보고하고 있다.¹⁹⁾ EBV는 주로 림프계 세포를 공격하는 것으로 알려져 있으며, 감염 후 림프구와 상피세포에서 발현되는 EBV 잠복성 유전자 산물인 LMP-1은 세포 표면의 표현형과 상피세포의 분화반응에 변화를 초래하여 악성 형질 전환의 기전에 관여하고, 원종양 유전자인 bcl-2의 발현을 유발하고 세포고사를 억제하여 종양의 발생에 관여한다고 알려져 있다.²⁰⁾ 본 연구에서도 EBV ISH 양성 조직에서 통계학적으로 유의하게 LMP-1과 bcl-2의 면역화학조직염색이 양성인 경우가 많았으며, 비인두암의 경우 EBV ISH 양성 조직의 66%, 100%에서 각각 LMP-1과 bcl-2에 양성을 보였으나 NK-T 세포 림프종의 경우 각각 20%, 이하선 림프상피암종의 경우는 0%에서 LMP-1과 bcl-2에 양성 반응을 보였다. 이러한 결과는 표본수는 적어 확정된 결론을 내리기는 어려우나 비인두암에서 종양의 병인 기전에 LMP-1과 bcl-2가 관여함을 시사하는 것으로 생각된다.
   EBV 감염이 두경부 악성 종양의 병인에 기여하는 것으로 생각되는 EBV가 직접 암의 유발요인으로 작용했는지 여부와 위치에 따라 차이가 있는 지에 대한 지속적인 연구가 더 필요한 것으로 사료된다.

결     론

   우리나라 두경부 암 환자 72명을 대상으로 종양 조직에서 EBV ISH 결과 비인두암 10예 중 3예(30%), 비강 NK/T 세포 림프종 7예 중 5예(71%), 이하선 4예 중 림프상피암종 1예(25%)에서 EBV에 양성이었으며 그 이외 부위의 암조직에는 EBV가 검출되지 않았다. 이들 EBV ISH 양성인 종양조직에서 EBV ISH 음성인 종양에서 보다 LMP-1과 bcl-2가 높게 검출되어 이 두 가지 분자생물학적 표지자가 EBV의 발암 기전을 이해하는데 도움이 될 것으로 생각된다.

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