교신저자：정종우, 138-736 서울 송파구 풍납동 388-1  울산대학교 의과대학 서울아산병원 이비인후과학교실
교신저자：전화：(02) 3010-3718 · 전송：(02) 489-2773 · E-mail：jwchung@amc.seoul.kr

서     론

   조직 내 산소농도의 조절기전의 조절 인자 중 하나로 확인된 것이 transcriptional activator HIF-1이다.¹⁾ HIF-1은 hypoxia-inducible genes인 vascular endothelial growth factor, erythropoietin, glucose transporter-1의 조절에 반드시 필요한 중요한 단백질이다.¹⁾ HIF-1은 HIF-1α와 anhydrocarbon receptor nuclear translocator(ARNT)로 이루어져 있으며 HIF-1α 부분이 활성화되는 것은 세포의 산소 농도에 의해 조절된다.²⁾ 산소 농도가 정상인 상태에서 HIF-1α는 짧은 수명의 단백질로 ubiquitin-proteosome system에 의해 분해된다.³⁾ 그러나 조직이 산소 부족 상태일 때는 HIF-1α는 안정화되어 조직 내에 축적된다.⁴⁾
   소음 환경하에서 와우조직의 저산소증의 원인은 조직 내 산소 소비량의 증가와 와우조직 내 림프액의 산소추출량의 증가로 추측된다.⁵⁾ 흰쥐가 30분 이상 106 dB HL의 소음에 노출되었을 때 외림프액 내의 산소 분할 포화도가 감소하는 사실을 관찰하였는데 이 또한 소음 환경에서 와우 조직의 저산소증의 한 예이다.⁶⁾ 흰쥐의 내이에서도 과다한 소음자극으로 인해 영구적인 청력소실이 발생하였을 때 HIF-1α가 코티기관, 혈관조, 나선 신경절에서 발현되는 것을 확인할 수 있었다.⁷⁾ HIF-1α의 활성화는 순응 반응을 활성화하여 glucose transport와 해당작용을 이용하여 허혈성 조직의 생존을 돕는다. 또한 조직의 저산소증과 일산화탄소의 흡입 그리고 CoCl₂의 복강 내 주입은 erythropoietin gene의 발현증가를 유도하는 것으로 알려져 있다.⁸⁾ CoCl₂는 heme ring의 철분을 대신하는 방법으로 산소 농도의 감지를 방해하고 이로 인해 산소 결합이 일어나지 않게 되어 결국 지속적인 저산소증을 유발하여 HIF-1 DNA binding activity를 유도하는 것으로 알려져 있다.³⁾ 이같이 CoCl₂와 desferrioxamine은 HIF-1α의 발현을 유도하며 허혈성 자극 24시간 전 쥐에 주입하였을 때에는 뇌경색으로부터 세포를 보호하는 역할을 유도해냈다.⁹⁾ 
   본 연구에서는 이를 참고로 흰쥐에 일정한 소음을 반복적으로 주어 소음성 난청을 유발하였고 뇌경색의 경우와 유사하게 CoCl₂를 전처리하여 HIF-1α를 유도하였을 때 소음에 대한 반응을 관찰하였다. 이를 통하여 HIF-1α 유도체인 CoCl₂의 청력 보호 효과에 대해 알아보았다.

대상 및 방법

대 상

실험동물
   실험동물로는 청성뇌간반응(Auditory brainstem response；ABR)에서 정상 청력을 보인 8주된 흰쥐(BALB/c, 바이오 제노믹스)를 사용하였다.

실험기기
   소음을 주기 위해 외부 소음과 차단도 되고 방음이 가능한 방음실을 사용하였다. 각각 8 Ω의 입, 출력을 가지는 스피커(300-10,000 Hz；290-8L, Altec Lansing, Oklahoma City, Oklahoma, USA)와 증폭기(R-399, INTER M, Seoul, Korea)를 직접 연결하여 사용하였다. 증폭기를 방음실의 좌측 코너에 위치시킨 후 그 위에 스피커를 설치한 다음 horn이 45° 각도로 놓이게 하였다. 조직 탈수, 투명, 침투 과정을 처리하기 위해 사용한 자동화 침투 기기는 CITEL 2000(Thermo Shandon Co. Waltham, MA, USA)을 사용하였다.

실험방법

실험동물의 마취
   실험동물의 마취는 ketamine hydrochloride(30 mg/kg)와 xylene(2 mg/kg)을 복강 내 주사로 유도하였으며, 필요시 상기 용량의 반을 추가로 주사하였다.

청력 역치의 측정
   청성뇌간반응은 Traveler Express(Bio-logic Systems Co., Mundelein, IN, USA)를 사용하여 검사하였다. 자극음은 초당 13회의 교대상 클릭을 105 dB SPL의 강도부터 10 dB씩 낮추면서 측정하였고, 파형이 불분명하게 나오는 음의 강도에 도달하면 5 dB씩 조절하면서 청력 역치를 측정하였다. 청력 역치는 wave I을 기준으로 측정하였다. 클릭음의 주파수 여과기 조절은 100~3,000 Hz로 하였고, 총 자극음의 횟수는 1,024회로 하였다.

소음성 난청의 유발
   모든 흰쥐를 120 dB SPL의 광대역 백색잡음에 하루에 3시간씩 3일간 노출시켰다. 소음은 Cool Edit 1.52 소프트웨어를 이용하여 컴퓨터를 통해 발생하였으며 방음실 내에 발생되는 소음을 방음실의 중앙부와 각각의 모서리에서 sound level meter(B&K, Denmark)로 측정하여 모두 120 dB SPL 이상임을 확인하였다. 또한 어떤 한 마리의 흰쥐에게만 집중적으로 소음에 노출되는 것을 피하기 위해 임의로 흰쥐들을 두 그룹으로 나누어 배치시킨 후 매일 무작위로 순환시켰다. 

CoCl₂의 처치
   CoCl₂를 60 mg/kg 용량으로 복강 내 주사한 후 주사 직후(n=3), 10분(n=3), 30분(n=3), 1시간(n=3), 1시간 30분(n=3), 2시간(n=3), 3시간(n=3) 후의 발현을 확인하였다. 2시간 후부터 코티기관, 혈관조, 나선 신경절에 고루 발현되는 것을 확인하였고 3시간 후와의 차이는 없었으며 흰쥐의 청력을 측정하여 청력 변화가 없는 것을 확인하였다 (Fig. 1). 이를 토대로 CoCl₂를 60 mg/kg 용량으로 복강 내 주사한 후 2시간 후부터 120 dB SPL 이상의 광대역 백색잡음에 하루에 3시간씩 3일간 소음에 노출시킨 쥐 6마리와 대조군으로 CoCl₂의 용매로 사용되는 증류수만을 복강 내 주사한 뒤 3일간 소음을 준 쥐 3마리의 청력을 소음 노출 전과 1(소음을 준 첫 날), 2, 3(소음을 준 마지막 날), 5, 9일 후 측정하였다. 모두 같은 쥐에서 시간에 따라 청력을 측정한 후 마지막 날에 와우를 얻어 외유모세포와 내유모세포의 수를 비교하였다.

조직 고정
   청력측정이 된 흰쥐 94마리 중 소음에 1(n=12), 2(n=12), 3(n=12) , 5(n=12)일간 노출시킨 흰쥐에서 각각 4마리씩 소음 노출이 끝난 1일, 1주일, 1개월째 와우 조직을 얻어 HIF-1α의 발현 양상을 보기 위한 실험에 사용하였다. 와우 조직은 2.5% glutaraldehyde, 2% paraformaldehyde, 4% formalin을 인산기 완충용액에 넣어 만든 고정액에서 3일간 보관하였다. 그 후 탈 석회화를 위해 10% ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)용액에 5일간 보관하였고, 그 후 자동 침투기를 이용해 탈수 과정 투명 침투과정을 거친 후 와우축 중심부 방향으로 파라핀으로 포매하였다. 포매된 조직은 5 μm로 조직을 박절하여 실험에 이용하였다.

Phalloidin 염색
   Phalloidin 염색은 먼저 CoCl₂ 전 처치한 후 3일 동안 소음 노출을 시킨 실험군에서 분리한 와우 8개와 증류수를 투여한 후 비교한 대조군에서 분리한 와우 4개를 고정된 상태를 확인한 후 현미경하에서 와우 바깥쪽에 있는 뼈를 제거한 후 조직을 분리하였다. 그 후 Fluorescein isothiocyanate(FITC) phalloidin 1.0 μg/ml와 1시간 동안 4℃ 암실에서 반응시키고 phosphate buffer saline(PBS)로 5분씩 세 번 세척한 후 봉합한 뒤 형광 현미경으로 관찰하였다. 와우의 유모세포를 일렬로 배열하여 첨단부부터 기저부까지 부위를 8개의 구역으로 나누어 관찰하였다. 전체 세포 수에서 염색된 세포수의 비율을 구하여 생존율을 계산하였다.

면역 조직 화학 및 형광 염색
   면역 염색의 과정은 실온에서 하였다. 박절된 조직을 xylene에 넣어서 탈 파라핀 과정을 거친 후 고농도 알코올에서 저농도 알코올로 가며 함수 과정을 거쳤다. 내인성 peroxidase의 활성을 억제하기 위해 methanol에 희석된 3% H2O₂ 용액에 5분간 반응시켰다. 그 후 PBS로 수세한 후 avidine-biotin-peroxidase complex(Vector, Burlingame CA , USA) 방법에 따라 면역 염색을 실시하였다. 비특이적인 반응을 차단하기 위해 biotin이 표지된 혈장에 30분간 반응을 시켰다. 그 후 1차 항체 HIF-1α(Lab Vision Co., Fremont, CA. USA, country)는 1：100 희석하여 4℃에서 12시간 이상을 반응시켰다. PBS용액에 수세한 후 biotin이 표지된 2차 항체를 30분간 반응시켰다. PBS용액에 수세한 후 avidin과 biotin 표지된 HRP 용액을 가해 30분간 실온에 반응시켰다. 발색 물질로는 3'3-diaminobenzidine tetra chloride(Thermo Shandon Co., Pittsburgh, USA)로 7분 동안 반응을 시켰다. 조직 구조 및 세포의 동정을 살피기 위해 hemotoxylene(Sigma, St. Louis, USA)을 이용하여 대조염색을 하였는데 30초 미만의 아주 짧은 시간 동안 반응을 시켰다. 수세 후 탈수 과정과 투명 과정을 거처 지용성 봉입제를 이용해 봉입 후 광학현미경으로 관찰하였다. 
   면역 형광 염색을 위해서는 PBS 용액에 수세한 후 2차 항체인 fluorescent anti-mouse IgG(Vector, Burlingame CA , USA)를 1：100으로 희석하여 실온에서 30분간 반응하였다. 반응 후 빛을 차단한 후 PBS 용액에 수세를 하였다. 그 후 수용성 봉입제(Biomeda Co., Foster City, CA. USA)를 이용해 봉입 후 형광 현미경과 공초점 현미경으로 관찰하였다. 

통계처리
   통계학적인 분석은 Sigma plot 2001(SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA)를 사용하였으며, 대조군과 실험군 사이의 청력 차이가 있는지 여부를 보기 위해서 student's t-test를 시행하였다.

결     과

소음 노출 후 HIF-1α의 발현 
   소음에 노출시킨 와우 조직 모두에서 HIF-1α의 발현이 와우의 코티기와 나선신경절, 그리고 나선인대에서 고르게 나타났으며 소음에 노출시킨 후 3일째 증가되었고 5일째도 계속 증가 소견을 보였다(Fig. 2).

CoCl₂ 전 처치군의 HIF-1α의 발현 
   HIF-1α의 유도를 촉진하는 CoCl₂를 복강 내 주입하고 나서 2시간 후에 HIF-1α의 발현을 기저부와 중간부위에서 확인하였다(Fig. 3). HIF－1α의 유도를 촉진하는 CoCl₂ 전 처치군에서 소음 노출 3일 후의 HIF－1α의 발현 또한 와우의 코티기와 나선신경절, 그리고 나선인대에서 고르게 나타났다.

CoCl₂ 전 처치군의 청력 역치의 변화
   CoCl₂를 60 mg/kg 용량으로 복강 내 주사한 후 2시간 후부터 120 dB SPL 이상의 광대역 백색잡음에 하루에 3시간씩 3일간 소음에 노출시킨 쥐 6마리와, 대조군으로 CoCl₂의 용매로 사용되는 증류수만을 복강 내 주사한 뒤 소음을 준 쥐 3마리의 청력을 소음 노출 직전과 1(소음을 준 첫 날), 2, 3(소음을 준 마지막 날), 5, 9일 후 측정하였다. CoCl₂를 미리 주사하여 소음에 3일간 노출시킨 경우 3일째까지의 청력은 55±4.9 dB HL로 증류수만을 투여하였던 비교군 (55±5.0 dB HL)과 비교하여 차이가 없었다. 그러나 소음 노출이 끝난 4일째부터는 청력이 점차 회복되어 소음 대조군은 10일 후 77±7.6 dB HL의 고도 난청이 되었으나 CoCl₂ 전 처치군은 37±5.2 dB HL의 경도 난청이 남아 통계적으로 유의한 차이를 보였다(p<0.01, Fig. 4). 

CoCl₂ 전 처치군의 유모세포의 정량적 변화 
   CoCl₂ 전 처치한 후 3일 동안 소음 노출을 시킨 후 7일(실험 10일째)이 경과된 군의 유모세포를 관찰하였을 때, 가장 외측의 외유모세포가 가장 많이 손상되었고, 내측의 외유모세포는 상대적으로 손상이 적었으며, 내유모세포는 거의 손상되지 않았다(p<0.01). 세포의 생존율은 외유모세포의 외측에서 내측으로 갈수록 86.9%, 86.8%, 87.3%로 증가하였고, 내유모세포는 97.8%였다. 외유모세포 간의 생존율은 통계적인 차이를 보이지 않았으나 내유모세포와 비교하였을 때에는 의미 있는 차이를 보였다. 구간별로 분석하였을때는 기저부 제2구간이 가장 많이 손상되어, 외유모세포에서는 생존율이 77.5%, 77.7%, 77.7%였고, 내유모세포는 93.5%였다. 이 경우에도 외유모세포간의 생존율은 통계적인 차이를 보이지 않았으나 내유모세포와 비교하였을 때에는 의미 있는 차이를 보였다. 중간부위인 제4구간이 그 다음으로 손상되는 것을 알 수 있었다. 대조군에 증류수를 투여하였던 대조군은 외유모세포와 내유모세포의 세포소실이 더 많아서 고도의 청력 저하가 일어나는 것에 대한 설명을 할 수 있었다. 통계는 two-way ANOVA test를 사용하였다(Fig. 5).

고     찰

   본 연구를 통하여 CoCl₂의 전 처치에 의해 소음성 난청의 청력 손실이 어느 정도 예방됨을 관찰하였다. 이러한 예방의 기전은 두 가지로 나누어 볼 수 있는데, 하나는 HIF－1α의 발현에 의하여 소음에 의한 독성작용을 차단하여 생길 수 있으며, 또 다른 하나는 Cobalt에 의한 직접적인 효과에 의해 생길 수 있겠다.
   흰쥐에 소음 자극을 주었을 때 내이조직 내의 HIF－1α가 발현되며, 이는 조직 내의 저산소증의 증거라고 볼 수 있다. HIF－1α는 저산소증 상황에서 필요한 여러 가지 물질들을 유도해 내어 조직을 보호하는 것으로 알려져 있다.⁹⁾ HIF－1 중 HIF－1α는 활성 부분으로, 와우 내에서는 감각유모세포와 Deiters cell, pillar cell에서의 일차적인 발현이 알려져 있다. 그 외 소량의 HIF－1α가 외측벽 조직이나, spiral gan-glion, 와우신경조직에서도 보인다.⁷⁾ 그러므로 HIF－1α를 저산소증이 생기기 이전에 미리 유발시키면 조직의 손상을 예방할 수 있는 가능성이 있다. 
   HIF는 저산소 상태에서 활성화되어 허혈성 뇌 손상 시 Reactive oxygen stress(ROS)　등에 의한 손상을 예방하는 효과가 있다고 보고되었다. 실지로 뇌조직의 저산소증 때 CoCl₂ 전 처치에 의한 뇌조직의 보호 효과가 보고되었고, 이는 HIF－1α의 발현에 의하는 것으로 추측되고 있다.⁸⁾ 이와는 반대로 전 처치가 없었을 경우, HIF는 오히려 조직의 저산소증에 의한 신경세포의 소멸을 촉진시킬 수도 있겠다는 보고도 있다.^10,11) 또한 연령에 따라 HIF－1α의 활성화가 손상되어 고령의 대상인 경우 어른의 심장조직에 가해진 허혈성 자극 시 HIF－1α와 vascular endothelial growth factor mRNA의 발현은 유도되나 이로 인한 혈관반응은 경색을 예방하는 데에는 불충분한 경우가 많다는 견해도 있다.¹⁾ 
   본 연구에서도 CoCl₂를 주입하여 HIF－1α를 미리 유도한 뒤, 소음에 노출시켜 보았다. 이를 비교군인 증류수만을 주입하고 소음에 노출시킨 쥐의 청력과 비교하였을 때, CoCl₂ 전 처치군은 소음을 주기 시작한 3일과 4일 사이부터 청력이 호전되는 것을 알 수 있었다. 미리 전 처치한 실험군에서도 3일까지는 청력 감소가 진행하고 있음을 알 수 있는데 그 정도는 3일째부터 감소하기 시작하였다. 아마도 이는 노출되고 있는 동안 세포 내 외유모세포의 파괴 같은 직접적인 물리적 반응에 의해 관찰되는 현상이라 생각된다. 와우 내 유모세포를 부위별로 정량화하여 관찰하였을 때, 외유모세포는 소음군 즉 대조군에서 가장 많이 파괴되어 숫적으로 감소하였고, 다음으로 CoCl₂군, 정상군 순으로 관찰되었다. CoCl₂군은 정상군과 유사하게 거의 모든 세포가 보존됨을 알 수 있었다. 실험군과 대조군의 n수가 적다고 생각할 수 있겠으나 두 군 간의 차이는 예외 없이 뚜렷하였다. 이 결과로 미루어 보아 HIF－1α의 발현을 소음 자극 이전에 미리 유도하였던 CoCl₂군에서 영구적 난청의 발생을 방지할 수 있었다는 것은 HIF－1α의 세포 보호 작용에 대한 하나의 증거로 생각할 수 있겠다. 
   임상적으로는 cobalt chloride나 desferrioxamine 등의 HIF－1α 유도제를 소음 환경에 지속적으로 노출되는 환자들에게 적용하여 난청을 예방하고자 하는 시도를 생각해 볼 수 있겠으나 환자에게 부작용 없이 내이에 HIF－1α가 발현되도록 유도제를 도입하는 방법부터 투여해야 하는 용량이나 횟수 및 기간 등에 대한 연구가 반드시 선행되어야 할 것이다.
   그러나 HIF－1α의 내이 보호 작용에 대한 정확한 기전은 아직 알려져 있지 않은 상태로 cobalt chloride와 HIF－1α가 서로 같은 대사 기전을 공유하면서 cobalt chloride만 소음성 난청 예방 효과를 가지고 있는 경우를 완전히 배제 할 수 없겠다. 이런 경우 HIF－1α를 유도하는 다른 물질들도 같은 결과를 유추하는지 알아보는 추가적인 연구가 필요할 것을 생각되며 또한 HIF－1α의 발현 시기 또한 어떠한 영향을 미치는지 알기 위해 HIF－1α의 유도시기를 소음 노출 전뿐만 아니라 소음 노출 도중과 후, 시간별로 발생되는 난청의 정도를 연구하는 것도 추가적으로 필요할 것으로 생각된다.

결     론

   CoCl₂로 HIF－1α를 미리 유도하면, 3일의 지속적인 소음에도 불구하고 청력이 일시적으로 감소하였다가 경도한 난청 정도로 회복되는 것을 알 수 있었다. 이때 와우 내 유모세포는 대부분 보존되었으며 조직의 저산소증으로 인하여 발생할 수 있는 소음성 난청의 경우 cobalt chloride에 의하여 세포 손상이 방지되고 청력 역치가 보존됨을 확인할 수 있었다. 그러므로 HIF－1α가 세포 손상을 방지하여 진행적인 난청을 방지하는 데 일부분 역할을 담당하고 있을 가능성이 있다. 앞으로 이러한 작용기전에 대한 연구가 소음에 의한 청력 저하의 기전을 이해하고 소음성 난청을 예방하는 데 도움이 될 수 있을 것이다.

1. Semenza GL. Hypoxia-inducible factor 1: Oxygen homeostasis and disease pathophysiology. Trends Mol Med 2001;7(8):345-50.

2. Wang GL, Jiang BH, Rue EA, Semenza GL. Hypoxia-inducible factor-1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O₂ tension. Proc Natl Acad Sci USA 1995;92(12):5510-4.

3. Kallio PJ, Pongratz I, Gradin K, McGuire J, Poellinger L. Activation of hypoxia-inducible factor 1α: Posttranslational regulation and conformational change by recruitment of the ARNT transcription factor. Proc Natl Acad Sci USA 1997;94(11):5667-72.

4. Huang LE, Gu J, Schau M, Bunn HF. Regulation of hypoxia-inducible factor 1α is mediated by an O₂-dependent degradation domain via the ubiquitin-proteasome pathway. Proc Natl Acad Sci USA 1998;95(14):7987-92.

5. Lamm K, Arnold W. Noise-induced cochlear hypoxia is intensity dependent, correlates with hearing loss and precedes reduction of cochlear blood flow. Audiol Neurootol 1996;1(3):148-60. 

6. Semenza GL. Regulation of mammalian O₂ homeostasis by hypoxiainducible factor 1. Annu Rev Cell Dev Biol 1999;15:551-78.

7. Chung JW, Kang HH, Shin JE, Kim JU. Accumulation of hypoxiainducible factor-1a in mouse inner ear by noise stimulation. Neuroreport 2004;15(15):2353-6.

8. Todorov V, Gess B, Godecke A, Wagner C, Schrader J, Kurtz A. Endogenous nitric oxide attenuates erythropoietin Gene Expression in vivo. Pflugers Arch-Eur J Physiol 2000;439(4):445-8.

9. Bergeron M, Gidday JM, Yu AY, Semenza GL, Ferriero DM, Sharp FR. Role of hypoxia-inducible factor-1 in hypoxia-induced ische-mic tolerance in neonatal rat brain. Ann Neurol 2000;48(3):285-96.

10. Carmeliet P, Dor Y, Herbert JM, Fukumura D, Brusselmans K, Dewerchin M, et al. Role of HIF-1 alpha in hypoxia-mediated apoptosis, cell proliferation, and tumour angiogenesis. Nature 1998;394 (6692):485-90.

11. Halterman MW, Miller CC, Federoff HJ. Hypoxia-inducible factor-1 alpha mediates hypoxia-induced delayed neuronal death that involoves p53. J Neurosci 1999;19(16):6818-24.