교신저자：나기상, 301-721 대전광역시 중구 대사동 640  충남대학교 의과대학 이비인후과학교실
교신저자：전화：(042) 220-7698 · 전송：(042) 253-4059 · E-mail：ksrha@cnu.ac.kr

서     론

   알레르기 비염, 기관지 천식과 같은 알레르기 기도질환은 면역학적 기전에 의한 과민반응의 결과로 상기도와 하기도에 발생한 염증성 질환이다. 비만세포, 호중구, 림프구, 호산구 등 다양한 염증세포와 이들에서 분비되는 히스타민, 류코트리엔, 혈소판 활성인자(platelet activating factor) 등의 매개물질, TNF-α, IL-4, IL-5, IL-12, IL-13 등의 사이토카인, ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1 등의 접착분자, RANTES, eotaxin, MCP-3 등의 케모카인이 복합적으로 작용하여 발병하는 것으로 알려져 있다.^1,2)
   IL-18은 1995년 Okamura 등⁷⁾에 의해 IFN-γ의 생성을 유도하는 물질로 처음 보고되었으며, IL-12와 함께 IFN-γ의 분비를 유도하여 궁극적으로 Th1 반응을 항진시키고 숙주면역에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 왔다.그러나 IL-18 단독으로 호산구의 침윤과 같은 알레르기 염증반응을 증가시키는 작용, 즉, Th2 반응도 항진시킬 수 있다는 연구 결과도 보고되어 있어 IL-18의 면역학적 양면성과 그 기전에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다.^8,9,10,11) 
   본 연구에서는 난알부민 감작을 이용한 마우스 기도 알레르기 모델에서 IL-18의 복강 및 비강 내 투여가 각기 알레르기 반응에 미치는 영향을 기관지폐포세정액 내의 사이토카인 정량분석 그리고 기도점막의 조직학적 검사를 통해 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

실험 동물 및 실험군
   무병상태로 사육된 6주령의 암컷 BALB/c 마우스 32마리를 사용하였다. 음성대조군(A군), 기도 알레르기를 유발한 양성대조군(B군), 유발단계에서 복강 내에 IL-18을 투여한 알레르기군(C군), 유발단계에서 비강 내로 IL-18을 투여한 알레르기군(D군)으로 나눈 다음 각각 8마리씩 배정하였다. 모든 실험은 본원 동물실험위원회의 동의를 거쳐 시행하였고 가능한 인도적인 방법으로 모든 동물 실험을 진행하였다. 

난알부민 감작을 이용한 기도 알레르기 유도, 비강 내 유발검사 
   난알부민(ovalbumin；chicken egg albumin grade V, Sigma Chemical Co. Phillipsberg, NY) 10 μg과 aluminum hydroxide {Al(OH)₃} gel 1.5 mg을 0.5 ml 생리식염수에 혼합하여 난알부민 혼합액을 만들었다. 이 혼합액 0.1 ml를 실험시작일에 B, C, D군의 복강 내에 주사하고, 5일째와 21일째에 한 번씩 더 주사하여 전신감작을 유도하였다. A군에서는 혼합액 대신 동량의 phosphate buffered solution(PBS)을 복강 내에 주사하였다. 마지막 복강 내 주사 1주일 후, 즉, 실험 28일째부터 B, C, D군을 아크릴상자에 넣고 1 gm% 난알부민용액을 분무기(PulmoAide^®, DeVillbiss, Somerset, PA)를 이용하여 1일 1회 20분씩 5일간 분무하여 국소감작을 유도하였다. A군은 난알부민용액 대신 PBS를 분무하였다. 이러한 방법으로 기도 알레르기를 유도한 후 국소감작 종료 후 7일째에 PBS를 비공에 주입한 A군을 제외한 실험군의 비공에 난알부민 200 μg을 주입하여 유발검사를 시행하였다(Table 1).

IL-18 용액의 제작 및 투여
   Lyophilized recombinant mouse IL-18(R&D systems, Minneapolis, MN)에 100 μl 생리식염수를 혼합하여 IL-18 용액을 준비하였다. C군은 유발검사 24시간 전, 4시간 전, 그리고 유발검사 20시간 후에 IL-18 1 μg을 복강 내에 주사하였고 D군은 유발검사 4시간 전, 유발 직전, 그리고 유발검사 20시간 후에 IL-18 0.5 μg을 비강 내로 점적하였다(Table 1).^3,6,15) A, B군은 IL-18 대신 PBS를 각각 비강 및 복강에 주입하였다.

기관지폐포세정액의 사이토카인 정량분석
   유발검사 48시간 후 ketamine HCl(250 mg/kg)을 마우스 복강 내로 주사하여 마취하였다. 2~3번째 기관륜 사이에 기관절개술을 실시한 후 25 gauge 정맥카테터를 기관절개구에 넣은 후 1ml PBS 용액을 천천히 주입하여 2회의 기관지폐포세정을 실시하였다. 평균 0.8 ml의 기관지폐포세정액을 수집하였고 원심분리하여 얻은 상청액은 사이토카인 측정 전까지 영하 70℃에서 보관하였다. 
   기관지폐포세정액 내의 IL-18, IL-4, IL-5, IFN-γ의 정량분석은 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)를 이용하였고 상용화되어 있는 BD OptEIATM ELISA set(BD Biosciences, San Diego, CA)를 사용하였다. 96-well ELISA plate에 0.1 ml carbonate coating buffer로 희석한 rat anti-mouse IL-18, IL-4, IL-5, IFN-γ antibody 용액을 넣은 후 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 완충액(0.1% Tween 20/PBS, pH7.2)으로 3회 반복하여 세척 후 assay diluent(10% FBS/PBS, pH 7.0)를 넣고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 다시 완충액으로 3회 세척 후 cytokine에 대한 표준용액과 기관지폐포세정액을 넣은 후 2시간 동안 실온에서 배양하였다. 다시 7회 세척 후 기질 용액(substrate solution)을 넣은 다음 어두운 곳에 30분 동안 보관하였고, 그 후 중지용액(2N H₂SO₄)을 이용하여 반응을 정지시키고 microplate spectrophotometer(SPECTRA MAX Plus^®, Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

조직학적 평가
   기관지폐포세정 후 마우스를 희생시킨 다음 흉곽을 개방하고 양측 폐를 채취하여 4% paraformaldehyde 용액에 24시간 동안 고정하였다. 파라핀 포매 후 5 μm의 두께로 절편을 만들었다. H&E 염색 후 400 배율의 광학현미경 관찰하에 기관지주위조직의 호산구 침윤의 정도를 침윤이 없는 경우, 경도의 침윤, 중도의 침윤, 중증도의 침윤 및 고도의 침윤 등의 정도에 따라 각각 0, 1, 2, 3, 4로 구분하여 반정량적으로 평가하였다.

통계분석
   통계학적 검증은 SPSS for window version 12.0(SPSS Inc., Chicago, IL)을 이용하였다. ELISA 측정값의 두 군간의 검정에는 Student's t-test를, 조직소견의 정량적 비교는 Mann-Whitney U test를 이용하였고 각기 유의수준 5%에서 검정하였다.

결     과

기관지폐포세정액 내의 사이토카인 정량분석
   기관지폐포세정액 내의 IL-4 농도는 A, B, C, D군에서 각각 150.8±18.2 pg/ml, 163.5±20.5 pg/ml, 142.7±23.4 pg/ml, 135.1±13.9 pg/ml였다. B군은 A군보다 높은 농도를 보였으나 통계학적으로 유의하게 증가되지 않았다. C, D군은 A군 보다 낮은 농도를 보였으나 역시 통계학적 유의성은 없었다. 그러나 알레르기 양성대조군인 B군에 비해 비강 내로 IL-18을 투여한 D군은 통계학적으로 유의하게 낮은 농도를 보였다(p=0.016)(Fig. 1).
   기관지폐포세정액 내의 IL-5 농도는 A, B, C, D군에서 각각 166.4±20.2 pg/ml, 226.8±28.5 pg/ml, 204.8±24.6 pg/ml, 188.2±22.9 pg/ml였다. B군은 A군보다 유의한 증가를 보였으며(p=0.004), D군은 B군보다 유의하게 낮은 농도를 보였다(p=0.01)(Fig. 2).
   기관지폐포세정액 내의 IFN-γ 농도는 A, B, C, D군에서 각각 620±109.6 pg/ml, 780±149.2 pg/ml, 703±123.8 pg/ml, 713±77.6 pg/ml였다. C, D군 모두 B군과 통계학적으로 유의한 농도차이는 보이지 않았다(Fig. 3).
   기관지폐포세정액 내의 IL-18 농도는 A, B, C, D군에서 각각 20.2±5.2 pg/ml, 71.1±3.5 pg/ml, 141.7±6.5 pg/ml, 26.5±2.3 pg/ml였다. B군은 정상대조군인 A군보다 유의한 증가를 보였으며 복강 내로 IL-18을 투여한 C군은 B군보다 유의한 증가를(p=0.001), 비강 내로 IL-18을 투여한 D군은 B군보다 유의한 감소를 보였다(p=0.005)(Fig. 4).

조직학적 검사
   각 군의 평균 점수는 A군부터 D군 순으로 각각 0, 3, 1.37, 1.25점이었으며 C, D군 모두 B군보다 호산구의 침윤이 유의하게 감소되어 있었다(p=0.001)(Fig. 5).

고     찰

   알레르기 비염이나 기관지 천식과 같은 알레르기 질환은 호산구, T 림프구, 비만세포와 같은 여러 염증세포와 이들에서 분비되는 다양한 사이토카인, 케모카인, 접착분자들이 관여된 만성 염증성 질환이다.^1,2) IL-2, IFN-γ, TNF -β 등 Th1 사이토카인에 비해 IL-4, IL-5, IL-10과 같은 Th2 사이토카인의 상대적인 증가가 알레르기 질환에서 관찰되며, T세포의 사이토카인 분비반응을 Th2 반응에서 Th1 반응으로 유도하여 알레르기 질환 특유의 호산구에 의한 염증 반응을 억제하려는 노력이 시도되어 왔다.^3,4,5,6) 
   IL-18은 T세포에서 IFN-γ의 생성을 유도하는 사이토카인으로 IL-1과 구조와 신호전달체계에서 유사성을 보이지만 그 기능면에서는 IL-1과는 확연히 다르다.^8,9,10) IL-18은 주로 대식세포, 수지상세포 등에서 생성되며, 그 외에도 호흡상피세포, 진피세포 등 다양한 면역 혹은 비면역세포에서 생성되고 IL-12과 함께 Th1 반응을 자극하여 IFN-γ 생성을 통해 숙주방어에 중요한 역할을 담당하지만 과잉생성 시 중증의 염증반응을 유발하는 것으로 알려져 있다.^12,13,14) 하지만 IL-18은 알레르기반응과 IL-4, IL-10, IL-13과 같은 Th2 사이토카인의 생성을 유도하는 기능도 있음이 밝혀졌다.^8,9,10) 이외에도 IL-18은 TNF-α, GM-CSF 등의 생성을 유도하며, T세포와 NK세포에서 Fas ligand 발현을 증가시켜 이들의 세포독성을 증강시키며, cyclooxygenase 2, iNOS 등의 생성을 유도하는 기능도 보고되었다.¹¹⁾
   실험적으로 유발된 알레르기 모델에서 IL-18의 다양한 면역학적 작용에 관하여 보고된 결과를 살펴보면 다음과 같다. Hofstra 등³⁾은 난알부민의 복강 내 주입과 분무를 통하여 알레르기반응을 유발시킨 BALB/c 마우스에서 복강 내로 IL-12 혹은 IL-18 단독 투여군보다 IL-12와 IL-18을 동시 투여한 군에서 혈청 IgE의 농도, 호산구 침윤 정도, 기도과민성 및 기관지폐포세정액 내의 IL-4, IL-5의 농도가 현저히 낮아짐을 보고하였다. 또한 IFN-γ의 유의한 증가를 관찰하여 IL-12와 IL-18의 동시 투여가 Th2 반응을 억제하고 Th1 반응을 항진시킬 수 있음을 보고하였다. 이들의 실험에서 IL-18을 단독으로 복강 내로 투여한 경우 통계학적 유의성은 관찰되지 않았지만 양성 대조군에 비해 혈청 IgE의 농도의 감소, 기관지폐포세정액 내의 호산구가 감소하는 경향을 보였다. Komada 등¹⁶⁾은 난알부민의 복강내 주사와 분무를 통하여 알레르기반응을 유발시킨 IL-18 deficient C57BL/6 마우스 실험결과 유발단계에서 복강 내로 IL-18을 투여한 경우 기관지폐포세정액 내의 호산구의 침윤과 IL-4의 농도가 감소함을 관찰하여 IL-18가 Th2반응을 억제한다고 보고하였다. 이들의 결과는 저자들의 실험결과와 유사성을 보였다. Campbell 등⁶⁾은 바퀴벌레 항원을 이용한 CBA/J 마우스 알레르기 모델에서 IL-18을 유발단계에서 항원과 동시에 기관 내로 국소적으로 투여한 경우 eotaxin의 발현을 활성화시켜 호산구의 침윤을 증가시킨다고 보고하였다. 하지만 유발단계 1시간 전에 항 IL-18항체를 복강 내로 투여했을 때 폐조직의 호산구 침윤이 현저히 증가되어 IL-18의 국소적인 작용과 전신적인 작용에 차이가 있음을 보여주었다. 저자들의 실험에서 IL-18을 복강 내로 주입한 실험군과 비강 내로 주입한 실험군 모두 대조군에 비해 기관지폐포세정액 내의 IL-4와 IL-5는 낮은 농도를 보였지만 비강 내로 IL-18을 주입한 실험군에서만 통계학적으로 유의한 감소를 보였다. 또한 IL-18을 투여한 실험군의 경우 폐조직의 호산구 침윤 정도가 유의하게 감소하였다. 이것은 유발단계 전후로 투여한 IL-18이 Th2 반응을 억제하는 데 기인할 것이다. 또한 항원의 비강 내 점적을 통해 증상을 유발시킨 저자들의 실험에서처럼 항원의 노출경로와 같은 비강 내 IL-18의 투여는 비점막에서의 국소 면역반응을 통해 폐의 염증반응에 영향을 주는 것을 확인할 수 있었다. 하지만 본 실험에서는 비점막의 조직검사나 비세정액 내의 사이토카인 분석을 시행하지 않아 이에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다. 
   Wild 등⁴⁾의 ragweed를 이용한 BALB/c 마우스 알레르기 모델 실험에서 감작 시에 IL-18을 투여한 경우에는 기관지폐포세정액 내의 호산구의 증가와 폐조직 내의 IFN-γ, IL-5의 농도가 증가하였고, 본 실험에서처럼 유발 시에 투여한 경우에는 기관지폐포세정액 내의 호산구가 감소하였다. 또한 naive 마우스에 항원과 IL-18을 폐 내로 투여한 경우 Th2 사이토카인 및 IgE의 증가, 호산구의 침윤, 기관지 내 점액의 증가 등이 관찰되어 알레르기의 감작을 유도할 수 있음을 보고하였다. 이와 같은 IL-18의 면역학적 기전에서의 양면성은 실험동물의 차이, 알레르기 유발물질의 종류 및 유발방법의 차이, 그리고 투여한 IL-18의 농도, 투여 용량, 투여 시기 및 투여 방법, 실험 후 동물의 희생 시점의 차이 등 여러 가지 인자가 복합적으로 작용할 것으로 추정된다.^4,10) 

결     론

   본 연구에서는 난알부민을 이용하여 BALB/c 마우스 기도 알레르기 모델을 제작한 후 유발단계 전후로 IL-18을 복강 및 비강에 투여하여 IL-18의 국소 및 전신 효과를 비교하였다. IL-18을 투여한 실험군이 대조군에 비해 기관지폐포세정액 내의 IL-4, IL-5의 감소와 폐조직의 호산구 침윤 감소 등 Th2 반응이 감소하였다. 하지만 IL-18의 투여 용량, 투여 시기 그리고 투여 방법 등에 따라 면역학적 반응이 다양하게 나타날 수 있을 것으로 사료되며 그 기전에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.

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