서     론

   삼출성 중이염(otitis media with effusion)은 유소아에서 가장 흔한 질환 하나로 중 청력 장애의 원 학령기 이전 아동의 80%가 경험한다. 미국의 경우 소아 중이염으로 인해 병원을 찾는 횟수가 연간 13만 건 이상이며,¹⁾ 이로 인한 비용은 30억 불에 달하는 것으로 보고되고 있다.²⁾ 우리나라의 경우 1993년 통계에 의하면 그 유병률이 2% 이상으로,³⁾ 최근의 증가추세를 고려하면 현재 유병률은 훨씬 높을 것으로 추정된다. 삼출성 중이염의 병인으로는 이관의 기능에 여러 가지 이유로 장애가 생겨 중이강 내에 음압이 발생하고, 이에 따라 혈장여과액(transudate)이 중이강 내에 고인다는 hydrops ex vacuo theory로 설명되어 왔다.⁴⁾ 그러나 중이 삼출액에서 대부분 세균이 발견되고, 중이와 이관점막에 염증반응이 확인된 이후, 그 병인을 세균 감염에 의한 직접적인 염증반응이나 세균 항원에 의한 국소 면역 반응 등으로 추정하고 있다.^5,6) 본 논문에서는 중이염 연구의 기초가 되는 사람 중이 점막세포의 배양법을 소개하고 이를 통한 병인 연구를 이온 채널을 중심으로 소개하고자 한다. 

중이 점막 세포 배양

중이 점막 세포배양의 필요성
   세포 배양은 인위적인 조건을 주었을 때의 세포반응을 객관적으로 볼 수 있어 분자생물학 연구에 있어서 필수적인 방법이다. 삼출성 중이염 등 각종 중이 질환의 병인에 있어서 중이 점막 상피가 중요한 역할을 한다는 사실이 밝혀지면서 여러 연구자들이 중이 점막 상피세포를 배양하고자 하였다.⁷⁾ 그러나 중이 점막은 채취할 수 있는 조직의 양이 적기 때문에 계대배양(serially passaged culture)을 통해 세포의 수를 증가시키는 것이 동일한 조건을 갖는 세포에서 다양한 실험을 진행하기 위해서는 필수적이다. 중이 점막 상피세포의 계대배양은 백서나 친칠라 등에서 이루어졌으며,^{8,9,10,11,12)} Moon 등이 사람의 중이 점막 상피세포를 성공적으로 explant 법을 이용하여 계대배양하였고,^13,14) Choi 등은 조직을 trypsin 처리하여 보다 효과적으로 배양할 수 있었다.¹⁵⁾ 최근에는 middle ear cell line이 개발되어 보다 안정적인 실험도 가능해졌다.¹⁶⁾ 

조직 채취와 상피세포 분리
   화학적 미로 절제술이나 경미로 접근술로 청신경 종양을 제거 받는 환자들의 정상으로 보이는 중이 점막을 와우갑각(promontory)에서 크기가 약 2×2 mm² 정도로 채취한다. 채취한 조직을 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Gibco, NY, USA)과 Ham's F12 nutrient mixture(F12, Gibco, NY, USA) 1：1로 혼합한 용액에서 1% pronase(type 14)를 첨가하여 18시간 정도 처치하고, 상층에 떠 있는 세포를 플라스틱 용기에 평판한 후 37℃ 배양기에서 1시간 동안 배양한다. 이때 근육세포, 혈관내피세포, 섬유아세포는 대부분 플라스틱 용기에 부착하나 상피세포는 그 시간 동안 플라스틱에 부착하지 못하는 특성을 이용하'여 상피세포만을 분리한 후 플라스틱 용기에 평판한다. 

계대배양
   상피세포의 수를 늘리기 위해 계대배양을 시도하는데, 배양액으로는 bronchial epithelial growth media(BEGM, CloneticsCo., MD, USA)를 기본으로 하여 호르몬과 각종 성장인자를 첨가하였다(Table 1). 배양액은 평판 하루 후에 갈아주며 그 다음은 2일에 한 번씩 갈아주었다. 50∼60% 합류(confluence)를 이루는 시점에서 trypsin/EDTA를 이용하여 세포들을 플라스틱 용기로부터 떨어뜨려 단세포로 만든 후 혈구계를 사용하여 세포의 수를 측정하였다. 연속적 배양을 하지 않는 세포들은 10% dimethyl sulfoxide (DMSO)가 들어 있는 배양액에 1×10⁶ cells/ml의 농도로 부유시킨 후 액화질소에 얼려 둔다. 연속적 배양을 위한 상피세포를 2,000 cells/cm² 밀도로 평판하여 passage-2(P-2) 세포를 만든다. Passage-3(P-3)와 passage-(P-4)도 같은 방법으로 만들었다. 이와 같은 계대배양으로 세포의 수를 1,000배 이상 늘릴 수 있다(Fig. 1).

분  화
   세포의 분화를 위해서는 인체의 중이 점막과 유사한 상태로 만들어 주는 것이 좋다. 이를 위해 Air-liquid interface 방법을 사용하는 데 자세한 방법은 다음과 같다. 반투과성 막으로 상하가 구분된 배양기(Transclear, Costar Corp., Cambridge, MA, USA)에 BEBM과 DMEM을 1：1로 혼합한 무혈장 배양액을 넣고, 냉동 보관된 passage-2 세포를 4×10⁴cells/cm² 밀도로 평판 부유하였다. 이때 배양액에 첨가한 호르몬과 성장인자들은 Table 2와 같다. 계대배양에서 사용한 배양액과는 epidermoid growth factor를 25 ng/ml에서 0.5 ng/ml로 조정한 것 이외에는 동일하다. 세포들은 첫 9일간은 배양액에 잠긴 상태로 두며 배양액은 격일로 갈아준다. 배양 10일째 위쪽 배양액을 제거하여 세포의 apical surface를 공기에 노출시키며, 아래쪽 배양액은 매일 교환한다. 배양은 37℃, 5% CO₂에서 진행하였다. 배양기간에 따라 세포들이 분화되는데 먼저 점액 분비세포들이 분화되고, 합류 3주 후가 되면 섬모세포가 분화된다(Table 2). 특이한 점은 섬모세포의 비율이 상기도 상피 세포배양에 비해 훨씬 적다는 점이다. 이는 인체 내에서의 중이점막세포 섬모세포 비율과 유사하며, 세포배양으로 in vivo tissue와 유사한 분화가 가능하다는 반증이 될 것이다. 

중이염과 진주종의 세포모델
   위에서 언급한 바와 같이 적절한 성장요소를 공급하면 배양된 중이 점막 상피세포는 인체에서와 유사한 위중층 섬모 원주상피(pseudostratified ciliated columnar epithelium, PCCE) 세포로 분화한다(Fig. 2). 또한, 중이염의 연구를 위해서는 Interleukin 1β나 TNF-α와 같은 cytokine을 처치할 경우 goblet cell hyperplasia나 ciliated cell이 많아지는 중이염과 유사한 상태로 분화시킬 수 있다(Fig. 3).^17,18) 또한, retinoic acid를 결핍시킬 경우 cholesteatoma와 유사한 squamous epithelium으로도 분화가 가능하다(Fig. 4).^19,20) 이처럼 배양된 중이 점막 상피세포는 다양한 형태로의 분화능력을 가지고 있다. 

중이 점막 상피에서의 이온 채널

이온 채널과 세포 표면액
   세포막 표면에는 다양한 형태의 이온 채널이 존재하여, 세포의 탈분극이나 전기적 신호 전달에 관여한다. 그런데 이러한 이온채널이 상기도 상피세포에서는 수분의 흡수와 분비하는 기능이 있어, 기도 표면액(airway surface liquid)의 양을 조절하는 역할을 한다.^21,22) 먼저 수분의 흡수 과정을 보면 상피의 막 첨부(apical membrane)에 있는 Na⁺ channel(epithelial Na⁺ channel, ENaC)이 수분 흡수에 있어서 속도 조절 단계(rate-limiting step)로 작용한다.²³⁾ 이 채널이 열리면 세포내외의 농도차에 의해 Na⁺이 세포내로 유입되고, 이는 다시 세포의 기저면에 있는 Na⁺-K⁺-ATPase을 통해 혈관 등으로 흡수되게 된다. 이러한 Na⁺ 이동에 따라 전하량의 차이가 생기고, Cl^-의 이동과 삼투압에 의해 수분이 흡수되게 된다(Fig. 5). 반대로 수분의 분비는 세포막 첨부의 Cl^- 채널에 의해 조절된다. 세포막 첨부에 있는 Cl^- 채널이 열리면 세포내의 음전하 때문에 Cl^-는 세포 밖으로 빠져나가게 되고, 뒤를 이어 Na⁺과 수분의 분비가 일어난다. 기저막에 있는 Na⁺-K⁺-Cl^- cotransporter(NKCC)에 의해 Cl^-는 세포내로 계속 유입되게 된다(Fig. 6). 상기도 상피세포의 대표적인 Cl^- 채널로는 cAMP에 의해 열리는 cystic fibrosis transmembrane conductor regulator(CFTR)이 있으며, CFTR의 이상이나 돌연변이에 의해 그 기능이 상실되면, 세포 표면액의 분비가 되지 않아 점액 섬모 수송체계의 장애가 와서 폐렴 등 심각한 기도 질환이 초래된다.^24,25) 이 외에도 Ca²⁺에 의해 활성화되는 Ca²⁺-activated Cl^- channel(CaCC)이 기도나 소화기 점막에 존재하는데 CFTR과 더불어 세포의 수분 분비에 중요한 역할을 한다. 특히, CFTR이 없는 cystic fibrosis 환자에서는 CaCC의 기능이 더욱 활성화되어 있어, UTP 등으로 이 채널을 활성화시켜 기도내 점액 분비를 촉진시키는 방법이 cystic fibrosis 등의 임상 치료에 응용되고 있다.^26,27)

삼출성 중이염의 발병기전에 대한 가설
   삼출성 중이염은 이관기능부전에 의해 중이강 내 저기압이나 상기도의 세균감염으로 인한 중이점막의 염증반응으로 발생하지만, 삼출액이 저류하는 기전에 대해서는 아직까지 정확하게 밝혀져 있지 않다. 중이를 덮고 있는 점막은 상기도 점막과 마찬가지로 얇은 점액층과 기도 표면액(airway surface liquid, ASL)으로 덮여 있으며, ENaC이나 CFTR 등의 이온채널들이 기도 표면액의 양을 조절함으로써 효과적인 점액 섬모 수송기전이 일어나고, 이를 통해 염증을 예방하는 것이라 생각되고 있다. 따라서, 여러 가지 원인으로 인해 이온채널의 기능에 장애가 올 경우 세포 표면액이 과다하게 축척되고, 이로 인해 삼출성 중이염이 발생할 수 있다(Fig. 7).

중이점막에서의 ENaC의 역할 
   외부에서 들어오는 소리를 내이로 효과적으로 전달하기 위해서는 중이강을 수분이 없는 공기로 찬 상태를 유지해야 한다. 동물을 이용한 전기생리학적 연구에서는 ENaC의 억제제인 amiloride가 백서의 중이 상피에서 단락전류(short-circuit current)를 차단함이 보고된 바 있다.^28,29,30) 연구자의 이전 연구에 의하면 사람 중이점막 상피세포에서 상기도에 비해 ENaC이 더욱 강하게 발현되며, ENaC-dependent current가 활성화되어 있다. 배양된 세포표면을 amiloride로 처치할 경우 수분 흡수가 완전히 차단됨을 확인하였다(Fig. 8). 따라서 중이강 내를 수분이 없는 공기로 찬 공간으로 유지하는 데 있어서 ENaC은 결정적인 작용을 할 것으로 추정된다.³¹⁾ 

중이점막에서 Chloride channel의 역할
   중이점막도 상기도와 유사하게 위중층 섬모 원주상피로 덮여 있기 때문에 세포막첨부에 CFTR이 분포하고 이를 통해 음이온이 분비될 것으로 추정되어 왔다. 그런데 특이하게도 CFTR의 돌연변이가 있는 낭포성 섬유종(cystic fibrosis)환자에서 비염, 축농증, 폐렴 등의 상기도 질환의 비율은 매우 높은데 반해, 삼출성 중이염은 흔하지 않다고 보고되었다.³²⁾ 이러한 점을 통해 중이 상피에서는 다른 기도 상피와는 CFTR의 기능이 차이가 있을 것으로 유추할 수 있다. 그런데 연구자의 이전연구에서 정상 중이점막에서는 특이하게도 CFTR의 발현이 기관이나 비점막 등의 상기도에 비해 미약하며, ATP 등과 같은 nucleotide에 의해 Cl^- 분비가 촉진되는 것을 확인한 바 있다(Fig. 8).³¹⁾ 이와 같은 사실은 CFTR의 기능이 소실된 cystic fibrosis 환자의 상기도에서 alternate Cl^- pathway로 CaCC의 역할이 상대적으로 중요한 것 같이, 정상인의 중이점막에서도 이온 이동이나 수분분비에 있어서 CFTR보다도 CaCC가 주된 역할을 하고 있음을 시사한다. 

염증반응에서의 이온 채널 기능의 변화
   그렇다면 염증반응이 있는 경우에는 이러한 이온 채널들의 기능이 어떻게 변하며, 그러한 기능변화가 어떠한 생리기능에 변화를 줄 수 있을까? 대부분의 상피에서는 염증반응이 있을 경우 세포에서 분비가 활성화되고, 흡수가 억제되는 방향으로 이온 채널의 기능이 바뀌게 된다. 이는 세포표면에 분비를 촉진시킴으로써 점액섬모체계에 의해 세균을 몸 밖으로 내보내려고 하는 생리적 작용으로 여겨진다. 중이 점막 상피세포에서도 염증반응을 일으켰을 때 이와 유사한 반응들이 발생한다. 즉, IL 1β로 전처치할 경우 goblet cell metaplasia와 ciliated cell hyperplasia 등의 형태학적 변화가 일어난다.¹⁷⁾ 그러나 이러한 형태학적 변화 이외에도 중이점막 상피세포에서의 염증반응은 ENaC의 기능을 억제하고, 수분 흡수 능력도 감소시킨다(Fig. 9).³³⁾ 이와 반대로 분비에 있어서 필요한 Cl^-의 공급원인 NKCC는 염증반응에 의해 활성되는 것으로 나타나(Fig. 10),³⁴⁾ 결국 세포는 분비를 많이 하고 흡수를 적게 하는 방향으로 기능변화가 일어난다. 이와 같은 변화는 수분흡수 능력의 감소로 나타나 세포 표면액의 과다 생성을 가져온다. 따라서 염증반응에 의한 수분 흡수 능력의 저하가 초기 삼출성중이염의 병인의 하나가 아닐까 추측된다. 

Glucocorticoid 제재에 의한 분비과정 조절
   Glucocorticoid 제재는 삼출성 중이염의 치료에 유용하게 사용되고 있으며,³⁵⁾ 다양한 경로의 항염증 효과가 있다고 알려져 있다. 하지만, 급성염증기가 지난 만성 삼출성 중이염에도 효과를 보이기 때문에 항염증 작용 이외에도 다른 기전이 있을 것으로 추측된다. Glucocorticoid는 이온 채널의 기능에도 큰 영향을 미치는데 특히 Na⁺의 기능을 향상시키는 것으로 알려져 있다. 이러한 효과는 alveolar epithelium에서 잘 나타나 신생아에서 페포내 수분의 흡수장애로 생기는 호흡부전의 경우 glucorcorticoid가 ENaC을 활성화시켜서 신생아의 사망률을 낮추는 것으로 되어 있다.^36,37) 이와 유사하게 중이 점막에서도 Dexamethasone이 ENaC a의 발현을 증가시키고, 수분흡수를 촉진시키며(Fig. 11) 또 다른 Na⁺ 흡수경로인 NHE도 활성화시킴을 보고하였다. 이는 스테로이드 호르몬이 삼출성 중이염을 호전시키는 과정에서 Na⁺ channel의 기능을 향상시키는 것이 한 기전이 아닐까 추측된다.^38,39)

향후 연구

ENaC의 조절기전
   앞서 언급한대로 ENaC이 중이점막에서 수분흡수에 결정적인 역할을 하고, 염증반응에 의해 그 기능이 저하될 경우 수분흡수가 되지 않기 때문에 ENaC의 기능 조절 기전을 밝히는 것이 중요하다. ENaC은 steroid 등의 호르몬 이외에도 세포내 pH, Protein kinase A 등의 신호전달 물질에 의해 조절되며, 최근 serine protease(trypsin, prostasin, TMPRSS4)가 ENaC을 활성화시키며, serine protease inhibitor에 의해 억제됨이 밝혀졌다.⁴⁰⁾ 특히 상기도 점막에서는 serine protease와 그 억제제에 의해 기도 표면액의 양이 조절된다.^41,42) 저자의 연구에 의하면 삼출성 중이염 환자의 삼출액에서 채취한 삼출액에서도 이들 serine protease와 그 억제제가 발현하는 것이 확인되었다. 향후 serine protease에 의해 ENaC이 활성화된다면, 삼출성중이염 치료의 한 방법이 될 수 있을 것이다. 

Cl^- 채널의 조절 기전
   상기도 상피, 소화기 점막상피 등에서 수분분비에 Cl^- 채널이 주된 작용을 하고 이를 억제할 경우 수분 분비가 억제된다. 따라서 이들 채널의 억제제는 최근 지사제(antidiarrheal drug)으로 개발되고 있다.^43,44) CFTR의 억제제인 CFTRinh172를 처치할 경우 secretory diarrhea가 효과적으로 치료되어 임상시험 중이며, CaCC의 억제제인 niflumic aicd도 수분분비뿐 아니라 점액의 exocytosis를 줄이는 것으로 알려지고 있다. 따라서 이들 억제제들은 중이 점막의 염증 상황에서 수분 분비를 억제시켜 삼출성 중이염의 예방이나 치료에 응용될 수 있을 것이다. 

결     론

   사람 중이점막 상피세포의 배양은 생체와 유사한 세포의 분화를 유도할 수 있어 중이염 연구에 있어서 매우 유용한 방법이다. 또한 이온 채널은 중이 점막에서 수분의 흡수와 분비에 결정적인 역할을 한다. 따라서 배양된 중이점막 상피세포를 이용한 이온 채널에 대한 전기생리학적 연구는 삼출성 중이염의 원인을 밝히고 치료법을 개발하는 데 많은 도움을 줄 것이다. 

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